Name: cantilever bending of murine femoral necks
Uploaded: 2022-01-05T14:00:00
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L’étude a été soutenue par les NIH P30AR069655 et R01AR070613 (H. A. A.).

Les études sur les animaux ont été approuvées par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris utilisées dans cette étude étaient des mâles et des femelles C57BL/6 âgés de 24 à 29 semaines. Les souris ont été logées dans des conditions standard avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Lors de l’euthanasie par inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale, 20 fémurs droits (10 mâles et 10 femelles) ont été récoltés et congelés à -20 °C...

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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+changes+after+short-term+whole+body+vibration+are+confined+to+cancellous+bone.">Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone.</a> Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).</li><li>Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).</li></ol>

Ce protocole décrit un test de flexion en porte-à-faux fiable pour les cols fémoraux murins. Le scénario de flexion naturelle en porte-à-faux qui se produit au niveau du col du fémur n’est généralement pas représenté dans les tests de flexion standard à 3 et 4 points5. Cette méthode de test est meilleure et reproduit de manière plus fiable le type de fractures du col du fémur subies par les patients atteints de fragilité osseuse. L’objectif principal lors de l’exécution de ce...

Le risque de fracture est un problème médical grave associé à l’ostéoporose. Plus de 1,5 million de fractures de fragilité sont signalées chaque année aux États-Unis seulement, avec des fractures survenant à la hanche, en particulier au col du fémur, comme principale fracture de type1. On estime que 18 % des femmes et 6 % des hommes subiront une fracture du col du fémur au cours de leur vie2, et le taux de mortalité à 1 an après la fracture est supérieur à 20 %1. Par conséquent, les modèles murins qui permettent des tests biomécaniques du col du fémur peuvent convenir à l’étude des fractures de fragilité. Les modèles murins offrent également des outils puissants pour élucider les événements cellulaires et moléculaires traduisibles impliqués dans l’ostéoporose potentiellement. Cela est dû à la disponibilité de rapporteurs génétiques, au gain et à la perte de modèles fonctionnels et à la vaste bibliothèque de techniques moléculaires et de réactifs. Les tests mécaniques sur les os de souris peuvent fournir les mesures de résultats nécessaires pour déterminer la santé des os, les variations génotypiques et phénotypiques qui pourraient expliquer l’étiologie de la maladie, et évaluer les thérapies en fonction des mesures des résultats de la qualité de l’os et du risque de fracture3.
L’anatomie du col du fémur crée des scénarios de charge mécanique uniques, qui conduisent généralement à des fractures de flexion (flexion). La tête fémorale est chargée dans la cavité acétabulaire à l’extrémité proximale du fémur. Cela crée un scénario de flexion en porte-à-faux sur le col fémoral, qui est fixé de manière rigide à la tige fémorale distalement4. Cela diffère des tests de flexion traditionnels à 3 ou 4 points sur la diaphyse moyenne fémorale. Bien que ces tests soient utiles, ils ne reproduisent pas la charge qui conduit généralement à des fractures de fragilité chez les personnes ostéopéniques et ostéoporotiques en termes de localisation de la fracture ou de scénario de charge.
Pour mieux évaluer le risque de fracture de fragilité chez la souris, il a été cherché à améliorer la reproductibilité des tests de flexion en porte-à-faux du col fémoral murin. Comme on l’avait prédit théoriquement, il a été démontré que l’angle de charge sur la tête fémorale par rapport à l’arbre fémoral influe de manière significative sur les mesures des résultats5, créant ainsi un défi pour la fiabilité et la reproductibilité des résultats rapportés. Pour assurer un alignement correct et cohérent des fémurs pendant la préparation de l’échantillon, des guides ont été conçus et imprimés en 3D sur la base de mesures anatomiques effectuées sur des scans μCT de fémurs de souris C57BL/6. Les guides ont été conçus pour aider à rempoter systématiquement les échantillons de manière à ce que l’arbre fémoral soit maintenu à ~ 20 ° de la direction de chargement verticale. Cet angle a été choisi parce qu’il maximise la rigidité tout en minimisant le moment de flexion maximal le long de l’arbre fémoral, ce qui augmente le risque de fractures du col du fémur et conduit à des tests plus cohérents et reproductibles5. Les guides ont été imprimés en 3D dans différentes tailles pour tenir compte des différences anatomiques entre les échantillons et utilisés pour maintenir les échantillons dans une position stable tout en rempotant dans du ciment osseux acrylique. La rigidité, la force maximale, la force d’élasticité et l’énergie maximale ont été calculées à partir des graphiques force-déplacement. Cette méthode d’essai a montré des résultats cohérents pour le résultat biomécanique susmentionné. Avec la pratique et l’aide du guide imprimé en 3D, les erreurs de mesure dues à un désalignement peuvent être minimisées, ce qui permet d’obtenir des mesures de résultats fiables.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188;&#8221; x &#188;&#8221; square aluminum tubing</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>48KU67</td>
			<td>Cut to lengths of 1/2&#34; to 1&#34; lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kN load cell</td>
			<td>Instron</td>
			<td>2527-130</td>
			<td>Any load cell with sub 1 N resolution can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope</td>
			<td>Omano</td>
			<td>OM2300S-GX4</td>
			<td>Microscope used to precisely line up samples with loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed guides</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Angled slots at 73.13&#176;, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed mount</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Base Plate Material Kit</td>
			<td>Keystone Industries</td>
			<td>921392</td>
			<td>Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to compile &#181;CT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biaxial stage</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used to center femoral head of sample under the loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMed Amber Resin</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMAM-01</td>
			<td>Any resin from formlabs could be used for this project.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluehill 3</td>
			<td>Instron</td>
			<td>V3.66</td>
			<td>Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPuls 10000</td>
			<td>Instron</td>
			<td>E10000</td>
			<td>Mechanical testing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron UltraFocus</td>
			<td>Faxitron BioOptics</td>
			<td>2327A40311</td>
			<td>X-ray imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>F2</td>
			<td>Used to print the mount and guides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2 Resin Tank LT</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RT-F2-02</td>
			<td>LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Used to assess &#181;CT and X-ray images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco iLED Series LED Light Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMPSILED30W</td>
			<td>Light source used in conjugtion with microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading platen</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount attachment</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plumber&#39;s putty</td>
			<td>Oatey</td>
			<td>31174</td>
			<td>Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreForm</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>Preform 3.15.2</td>
			<td>Formlabs software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>Scanco</td>
			<td>&#181;CT 40</td>
			<td>Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cantilever bending of murine femoral necks

Les fractures du col du fémur sont fréquentes chez les personnes atteintes d’ostéoporose. De nombreux modèles murins ont été développés pour évaluer les états pathologiques et les thérapies, avec des tests biomécaniques comme mesure de résultat principal. Cependant, les essais biomécaniques traditionnels se concentrent sur les essais de torsion ou de flexion appliqués à l’arbre médian des os longs. Ce n’est généralement pas le site des fractures à haut risque chez les personnes ostéoporotiques. Par conséquent, un protocole de test biomécanique a été développé qui teste le cou fémoral des fémurs murins dans la charge de flexion en porte-à-faux pour mieux reproduire les types de fractures subies par les patients atteints d’ostéoporose. Étant donné que les résultats biomécaniques dépendent fortement de la direction de charge de flexion par rapport au col du fémur, des guides imprimés en 3D ont été créés pour maintenir un arbre fémoral à un angle de 20 ° par rapport à la direction de charge. Le nouveau protocole a simplifié les tests en réduisant la variabilité de l’alignement (21,6 ° ± 1,5 °, COV = 7,1 %, n = 20) et en améliorant la reproductibilité des résultats biomécaniques mesurés (COV moyen = 26,7 %). La nouvelle approche utilisant les guides imprimés en 3D pour un alignement fiable des échantillons améliore la rigueur et la reproductibilité en réduisant les erreurs de mesure dues au désalignement des échantillons, ce qui devrait minimiser la taille des échantillons dans les études sur l’ostéoporose chez la souris.

Lorsqu’ils étaient mis en pot à l’aide du guide, les arbres fémoraux étaient alignés à 21,6° ± 1,5°. Bien que cela représente un écart de <10 % par rapport à l’angle prévu de 20°, les coefficients de variation (COV) de l’angle d’empotage sur tous les échantillons testés étaient de 7,6 % et 6,5 % pour les souris mâles et femelles, respectivement (n = 10 par groupe), tels que vérifiés par les radiographies planes pré-test (Figure 5). De plus, les rayons X post-te...

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Cantilever Bending of Murine Femoral Necks

Le présent protocole décrit le développement d’une plate-forme d’essai reproductible pour les cols fémoraux murins dans une configuration de flexion en porte-à-faux. Des guides imprimés en 3D personnalisés ont été utilisés pour fixer de manière cohérente et rigide les fémurs dans un alignement optimal.

Flexion en porte-à-faux du col fémoral murin

Fractures in the femoral neck are a common occurrence in individuals with osteoporosis. Many mouse models have been developed to assess disease states and ...

La configuration de flexion en porte-à-faux décrite dans ce protocole crée une approche reproductible pour générer des fractures du col du fémur, qui sont plus pertinentes sur le plan clinique et peuvent être utilisées dans les études murines pour examiner l’ostéoporose. Ce protocole crée une plate-forme de test qui améliore la reproductibilité, entraînant une diminution du coefficient de variation dans les mesures des résultats. Par conséquent, il minimise la taille de l’échantillon nécessaire pour des études robustes.Commencez par couper des sections de tubes de longueur 1/2 pouce à 1 pouce en utilisant des tubes en aluminium carrés de 1/4 pouce par 1/4 pouce. Étiquetez chaque segment d’aluminium avec les ID d’échantillon avec un outil de gravure. Remplissez la moitié des segments de tube avec du mastic et placez-les dans un luminaire pour les maintenir debout.Placez les fémurs propres à plat sur la paillasse afin que la surface antérieure soit tournée vers le haut. Ensuite, placez le guide imprimé en 3D directement sous le troisième trochanter, où le diamètre de l’arbre devient cohérent. Tenez les extrémités proximales et distales d’une seule main.Appuyez fermement sur le fémur sur l’établi et, à l’aide de l’autre main, placez le guide imprimé en 3D sur l’arbre médian du fémur pour empêcher le fémur de tourner vers le côté latéral ou médian. Ensuite, placez-les devant les segments d’aluminium correspondants. Remplissez les segments d’aluminium avec du ciment osseux jusqu’à ce qu’ils soient presque pleins, en laissant un peu de place pour le déplacement.Placez les fémurs avec des guides dans le bon segment en aluminium et laissez le ciment osseux se fixer. Une fois le ciment osseux durci, placez les échantillons dans une boîte de Petri avec du PBS à température ambiante et laissez-les se réhydrater pendant deux heures. Utilisez un système d’essai mécanique pour fixer et calibrer un capteur de pesage d’une résolution inférieure à 1 Newton.Fixez un luminaire avec une fente carrée pour maintenir fermement les segments en aluminium avec les échantillons. Fixez des vis fixes sur les deux côtés du dispositif de maintien pour maintenir fermement les échantillons en place. Ensuite, fixez une plaque de chargement dans l’actionneur.Placez un stéréomicroscope sur une surface directement devant le MTS. Placez des sources lumineuses autour du système si un éclairage supplémentaire est nécessaire pour voir la configuration à travers le microscope. Dans le logiciel MTS, commencez la création d’un nouveau protocole de flexion.Assurez-vous que le protocole fonctionnera dans le contrôle du déplacement. Réglez le taux de chargement du protocole sur 0,5 millimètre par seconde. Si le logiciel dispose d’un paramètre pour les touches programmables, ajoutez les touches logicielles Balance et Zero Extension au protocole.Assurez-vous que le logiciel enregistrera le temps en secondes, la charge en Newtons et l’extension ou le déplacement en millimètres à un taux d’échantillonnage minimum de 100 hertz. Enregistrez le nouveau protocole et revenez à l’écran principal du logiciel pour commencer le test d’un nouvel ensemble d’échantillons. Obtenez une image radiographique des échantillons dans les pots en aluminium.Plusieurs échantillons peuvent être imagés à la fois. Assurez-vous que la vue antérieure des échantillons est capturée pour permettre des mesures de vérification de l’angle d’empotage. Placez un segment en aluminium avec échantillon dans le dispositif de maintien et serrez les vis de réglage.Abaissez l’actionneur jusqu’à ce qu’il soit à quelques millimètres de la tête fémorale. Utilisez le stéréomicroscope pour ajuster l’étage biaxial afin d’aligner la position de la tête fémorale directement sous la plaque de chargement. Verrouillez l’étage biaxial en place.Dans le logiciel MTS, mettez à zéro la position de l’actionneur et équilibrez le capteur de pesage à l’aide des touches programmables supplémentaires Balance et Zero Extension. Ensuite, commencez le protocole de chargement. Selon l’espace restant entre la plaque de chargement et l’échantillon, les tests ne prendront que 10 à 30 secondes.Après le test, capturez une autre radiographie antérieure de l’échantillon. Cela sera utilisé pour discerner et documenter le mode de fracture. Les coefficients de variation, ou COV, des propriétés de flexion mesurées du col fémoral de souris sont présentés ici.COV représente le rapport entre l’écart-type et la moyenne d’un ensemble de données, et sa diminution indique un regroupement plus serré des points de données individuels autour de la moyenne. Ce protocole a réduit le COV pour la charge maximale par rapport à d’autres publications effectuant des tests similaires. Une courbe de déplacement de force représentative affichant un ajustement linéaire décalé de 0,2 % est utilisée pour calculer la rigidité et la limite d’élasticité.Les mesures de résultat sélectionnées sont tracées, affichant la moyenne et l’écart-type, y compris la charge maximale à la défaillance, la rigidité, le déplacement maximal à la défaillance et le travail à la défaillance. Les astérisques indiquent des différences significatives déterminées à l’aide d’un test t non apparié à une queue. Le cou fémoral des souris mâles était significativement plus fort et plus rigide que celui des spécimens de souris femelles.En outre, les cols fémoraux femelles ont connu des déformations plus importantes et un travail jusqu’à l’échec par rapport aux spécimens de souris mâles. Ceci est cohérent avec la densité minérale osseuse plus faible chez les femmes et souligne la sensibilité du test pour détecter les différences physiologiquement pertinentes. Les mesures des résultats biomécaniques, y compris la charge maximale, la rigidité, le déplacement maximal et le travail jusqu’à la défaillance, ont été tracées par rapport à l’angle d’empotage et corrélées à l’aide d’une régression linéaire simple pour la cohorte masculine, la cohorte féminine et tous les échantillons regroupés.Les lignes noires pleines montrent la régression linéaire des échantillons de groupe, et les lignes pointillées indiquent les intervalles de confiance. La variabilité de l’angle d’empotage n’a pas eu d’incidence significative sur la charge maximale, le déplacement maximal ou le travail de défaillance. Cependant, à mesure que l’angle de rempotage augmentait, la rigidité augmentait.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de ce protocole est de garder la procédure d’empotage et les taux de chargement les mêmes pour mieux comparer vos résultats aux données précédemment publiées. Si vous utilisez une alternative au ciment osseux, comme un alliage de bismuth qui peut être ramolli pour retirer l’échantillon après les tests, les échantillons peuvent subir d’autres procédures, telles que la spectroscopie Raman, DEXA ou la flexion à trois points, pour élucider des propriétés mécaniques, chimiques et structurelles supplémentaires.

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