Name: cantilever bending of murine femoral necks
Uploaded: 2022-01-05T14:00:00
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この研究は、NIH P30AR069655およびR01AR070613(H. A. A.)によって支持された。

動物実験はロチェスター大学動物資源委員会によって承認された。本試験で用いたマウスは、24~29週齢のC57BL/6雌雄であった。マウスを、食物および水を自由摂取させた標準条件下で飼育した。二酸化炭素吸入 による 安楽死、続いて子宮頸部脱臼に際し、20個の右大腿骨(10個の雄および10個の雌)を収穫し、試験するまで−20°Cで凍結した。
1. カスタム3Dプリント...

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このプロトコルは、マウス大腿骨頸部に対する信頼性の高い片持ち梁曲げ試験の概要を示しています。大腿骨頸部で起こる自然な片持ち梁屈曲シナリオは、通常、標準的な3点および4点曲げ試験では表されません5。この試験方法は、骨脆弱性患者が経験する大腿骨頚部骨折のタイプをより良くかつより確実に複製する。このプロトコルを実行する際の主な焦点は、大腿骨シ?...

骨折リスクは、骨粗鬆症に関連する深刻な医学的懸念である。米国だけでも毎年150万件以上の脆弱性骨折が報告されており、主要な骨折タイプ1として股関節、特に大腿骨頸部に骨折が起こっています。女性の18%、男性の6%が一生のうちに大腿骨頚部骨折を経験すると推定され2、 骨折後1年の死亡率は20%を超えています1。したがって、大腿骨頸部の生体力学的試験を可能にするマウスモデルは、脆弱性骨折の研究に適している可能性がある。マウスモデルはまた、骨粗鬆症に潜在的に関与する翻訳可能な細胞および分子事象を解明するための強力なツールを提供する。これは、遺伝子レポーターの利用可能性、機能モデルの利得と喪失、および分子技術と試薬の広範なライブラリによるものです。マウスの骨の機械的検査は、疾患の病因を説明する可能性のある骨の健康状態、遺伝子型および表現型の変動を決定し、骨の質および骨折のリスクの転帰尺度に基づいて治療法を評価するために必要な転帰尺度を提供することができる3。
大腿骨頸部の解剖学的構造は、典型的には曲げ(曲げ)骨折につながるユニークな機械的負荷シナリオを作成する。大腿骨頭は、大腿骨の近位端にある寛骨臼ソケットに装填される。これにより、大腿骨頸部に片持ち梁曲げシナリオが作成され、大腿骨軸に遠位に取り付けられます4。これは、大腿骨中枢骨幹に対する従来の3点または4点曲げ試験とは異なります。これらの試験は有用であるが、骨折位置または負荷シナリオに関して、骨減少性および骨粗鬆症の個体において脆弱性骨折に典型的につながる負荷を再現しない。
マウスにおける脆弱性骨折リスクをよりよく評価するために、マウス大腿骨頸部の片持ち梁曲げ試験の再現性を改善することが求められた。理論的に予測されたように、大腿骨軸に対する大腿骨頭部への荷重角度は、転帰尺度5に大きく影響することが示されており5、それによって報告された転帰の信頼性および再現性に対する課題が生じている。サンプル調製中に大腿骨の適切かつ一貫した位置合わせを確実にするために、C57BL/6マウス大腿骨のμCTスキャンで行われた解剖学的測定に基づいてガイドを設計し、3Dプリントしました。ガイドは、大腿骨シャフトが垂直荷重方向から約20°に維持されるように、サンプルを一貫してポッティングするのに役立つように設計されています。この角度が選択されたのは、大腿骨シャフトに沿った最大曲げモーメントを最小限に抑えながら剛性を最大化し、大腿骨頸部骨折の可能性を高め、より一貫性のある再現性のある試験につながるためです5。ガイドは、サンプル間の解剖学的違いに対応するためにさまざまなサイズで3Dプリントされ、アクリル骨セメントでポッティングしながらサンプルを安定した位置に保持するために使用されました。剛性、最大力、降伏力、および最大エネルギーは、力-変位グラフから計算されました。この試験方法は、前述の生体力学的結果について一貫した結果を示した。練習と3Dプリントガイドの助けを借りて、ミスアライメントによる測定誤差を最小限に抑えることができ、信頼性の高い結果測定が得られます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188;&#8221; x &#188;&#8221; square aluminum tubing</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>48KU67</td>
			<td>Cut to lengths of 1/2&#34; to 1&#34; lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kN load cell</td>
			<td>Instron</td>
			<td>2527-130</td>
			<td>Any load cell with sub 1 N resolution can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope</td>
			<td>Omano</td>
			<td>OM2300S-GX4</td>
			<td>Microscope used to precisely line up samples with loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed guides</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Angled slots at 73.13&#176;, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed mount</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Base Plate Material Kit</td>
			<td>Keystone Industries</td>
			<td>921392</td>
			<td>Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to compile &#181;CT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biaxial stage</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used to center femoral head of sample under the loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMed Amber Resin</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMAM-01</td>
			<td>Any resin from formlabs could be used for this project.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluehill 3</td>
			<td>Instron</td>
			<td>V3.66</td>
			<td>Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPuls 10000</td>
			<td>Instron</td>
			<td>E10000</td>
			<td>Mechanical testing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron UltraFocus</td>
			<td>Faxitron BioOptics</td>
			<td>2327A40311</td>
			<td>X-ray imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>F2</td>
			<td>Used to print the mount and guides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2 Resin Tank LT</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RT-F2-02</td>
			<td>LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Used to assess &#181;CT and X-ray images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco iLED Series LED Light Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMPSILED30W</td>
			<td>Light source used in conjugtion with microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading platen</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount attachment</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plumber&#39;s putty</td>
			<td>Oatey</td>
			<td>31174</td>
			<td>Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreForm</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>Preform 3.15.2</td>
			<td>Formlabs software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>Scanco</td>
			<td>&#181;CT 40</td>
			<td>Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cantilever bending of murine femoral necks

大腿骨頸部の骨折は、骨粗鬆症を有する個体において一般的な発生である。疾患の状態と治療法を評価するために多くのマウスモデルが開発されており、生体力学的検査が主要な転帰尺度となっています。しかし、従来の生体力学的試験は、長骨の中間軸に適用されるねじりまたは曲げ試験に焦点を当てている。これは、典型的には、骨粗鬆症患者における高リスク骨折の部位ではない。したがって、骨粗鬆症患者が経験する骨折の種類をよりよく再現するために、片持ち梁曲げ荷重でマウス大腿骨の大腿骨頸部を試験する生体力学的試験プロトコルが開発された。生体力学的結果は、大腿骨頸部に対する曲げ荷重方向に大きく依存するため、3Dプリントガイドは、荷重方向に対して20°の角度で大腿骨シャフトを維持するために作成されました。新しいプロトコルは、アライメントのばらつき(21.6°±1.5°、COV = 7.1%、n = 20)を低減し、測定された生体力学的結果の再現性を向上させる(平均COV = 26.7%)ことにより、試験を合理化しました。信頼性の高い試料アライメントのために3Dプリントガイドを使用する新しいアプローチは、骨粗鬆症のマウス研究におけるサンプルサイズを最小限に抑えるはずの、試料ミスアライメントによる測定誤差を低減することにより、厳密さと再現性を向上させます。

ガイドの助けを借りて鉢植えにすると、大腿骨シャフトは21.6°±1.5°に整列した。これは意図した角度20°から<10%のずれを表していますが、試験前の平面X線で検証されたように、試験したすべてのサンプルにわたるポッティング角度の変動係数(COV)は、雄マウスと雌マウスでそれぞれ7.6%と6.5%(1群あたりn = 10)でした(図5)。さらに、テスト後のX線を使用して、サンプルが失?...

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Cantilever Bending of Murine Femoral Necks

本議定書は、片持ち梁曲げセットアップにおけるマウス大腿骨頸部のための再現性のある試験プラットフォームの開発を記述している。カスタム3Dプリントガイドを使用して、大腿骨を最適なアライメントで一貫してしっかりと固定しました。

マウス大腿骨首のカンチレバー曲げ

Fractures in the femoral neck are a common occurrence in individuals with osteoporosis. Many mouse models have been developed to assess disease states and ...

このプロトコルで概説されている片持ち梁曲げセットアップは、大腿骨頸部骨折を発生させるための再現可能なアプローチを作成し、これはより臨床的に関連性があり、骨粗鬆症を調べるためのマウス研究に利用することができる。このプロトコルは、再現性を向上させるテストプラットフォームを作成し、結果測定の変動係数を低減します。したがって、ロバストスタディに必要なサンプルサイズが最小限に抑えられます。1/4インチ×1/4インチの正方形アルミニウムチューブを使用して、長さ1/2インチから1インチのチューブセクションを切断することから始めます。各アルミニウムセグメントにエッチングツールでサンプルIDのラベルを付けます。チューブセグメントの半分をパテで満たし、それらを直立させるために固定具に入れます。清潔な大腿骨をベンチトップに平らに置き、前面が上を向くようにします。次に、3D プリントされたガイドを 3 番目の転子の真下に配置し、シャフトの直径が揃います。近位端と遠位端を片手で持ちます。大腿骨を作業台にしっかりと押し付け、もう一方の手で3Dプリントされたガイドを大腿骨の中央軸に置き、大腿骨が横側または内側に回転しないようにします。次に、対応するアルミニウムセグメントの前に配置します。アルミニウムセグメントを骨セメントでほぼいっぱいになるまで満たし、変位のための少しのスペースを残します。ガイド付きの大腿骨を正しいアルミニウムセグメントに配置し、骨セメントをセットします。骨セメントが硬化したら、サンプルを室温PBSのペトリ皿に入れ、2時間再水和させます。機械的試験システムを使用して、1ニュートン未満の分解能でロードセルを取り付けて校正します。正方形のスロットを備えた固定具を取り付けて、サンプルを含むアルミニウムセグメントをしっかりと保持します。固定具の両側に止めネジを取り付けて、サンプルを所定の位置にしっかりと保持します。次に、ローディングプラテンをアクチュエータに取り付けます。MTS の真正面の面に実体顕微鏡を置きます。顕微鏡を通してセットアップを確認するために追加の照明が必要な場合は、システムの周りに光源を配置します。MTS ソフトウェアで、新しい曲げプロトコルの作成を開始します。プロトコルが変位制御で動作することを確認します。プロトコルの読み込み速度を毎秒 0.5 ミリメートルに設定します。ソフトウェアにソフトキーの設定がある場合は、ソフトキーの残高とゼロ拡張をプロトコルに追加します。ソフトウェア・プログラムが、最小サンプリング・レートである100ヘルツで、時間を秒単位で、負荷をニュートン単位で、拡張または変位をミリメートル単位で記録することを確認します。新しいプロトコルを保存し、ソフトウェアプログラムのメイン画面に戻り、新しいサンプルセットのテストを開始します。アルミポット内の試料のX線画像を得る。一度に複数のサンプルを画像化できます。ポッティング角度の検証測定を可能にするために、サンプルの正面図がキャプチャされていることを確認してください。サンプル付きのアルミセグメントを保持固定具に入れ、止めネジを締めます。アクチュエータを大腿骨頭から数ミリメートル以内に収まるまで下げます。実体顕微鏡を使用して二軸ステージを調整し、ローディングプラテンの真下に大腿骨頭の位置を合わせます。2 軸ステージを所定の位置にロックします。MTSソフトウェアでは、アクチュエータの位置をゼロにし、追加されたソフトキーバランスとゼロエクステンションを使用してロードセルのバランスを取ります。次に、読み込みプロトコルを開始します。ローディングプラテンとサンプルの間にどれだけのスペースが残っていたかに応じて、テストには10〜30秒しかかかりません。試験後、試料の別の前方X線を捕捉する。これは、フラクチャのモードを識別し、文書化するために使用されます。マウス大腿骨頚部の測定された曲げ特性からの変動係数(COV)がここに示されている。COV は、データ セットの標準偏差と平均の比率を表し、その減少は、平均の周囲の個々のデータ ポイントのグループ化が厳密であることを示します。このプロトコルは、同様のテストを実行する他のパブリケーションと比較して、最大負荷の COV を削減しました。0.2%オフセット線形適合を示す代表的な力変位曲線を使用して、剛性と降伏点を導出します。選択した結果メジャーがプロットされ、破損時の最大荷重、剛性、破損時の最大変位、および破損までの作業を含む平均と標準偏差が表示されます。アスタリスクは、片側不対応t検定を使用して決定された有意差を示します。雄マウスの大腿骨頸部は、雌マウスの標本よりも有意に強く、硬かった。さらに、雌の大腿骨頸部は、雄マウスの標本と比較して、より有意な変形および障害への働きを経験した。これは、女性の骨塩密度が低いことと一致しており、生理学的に関連する違いを検出するためのテストの感度を強調しています。最大荷重、剛性、最大変位、および故障までの作業を含む生体力学的アウトカム測定値を、ポッティング角度に対してプロットし、男性コホート、女性コホート、およびグループ化されたすべてのサンプルについて単純線形回帰を使用して相関させた。黒い実線はグループサンプルの線形回帰を示し、点線は信頼区間を示します。ポッティング角度の変動は、最大荷重、最大変位、または破損作業に大きく影響しませんでした。しかし、ポッティング角度が大きくなるにつれて、剛性は増大した。このプロトコルを試行する際に覚えておくべき最も重要なことは、ポッティング手順と読み込み速度を同じに保ち、結果を以前に公開されたデータとよりよく比較することです。試験後にサンプルを除去するために軟化させることができるビスマス合金などの骨セメントの代替物を使用する場合、サンプルは、ラマン分光法、DEXA、または3点曲げなどの他の手順を経て、追加の機械的、化学的、および構造的特性を解明することができる。

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