Name: cantilever bending of murine femoral necks
Uploaded: 2022-01-05T14:00:00
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El estudio fue apoyado por los NIH P30AR069655 y R01AR070613 (H. A. A.).

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester. Los ratones utilizados en este estudio fueron machos y hembras C57BL/6 con edades comprendidas entre las 24 y las 29 semanas de edad. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar con comida y agua ad libitum. Tras la eutanasia por inhalación de dióxido de carbono, seguida de luxación cervical, se cosecharon 20 fémures derechos (10 machos y 10 hembras) y se congelaron a -20 °C hasta que se pr...

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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+changes+after+short-term+whole+body+vibration+are+confined+to+cancellous+bone.">Bone changes after short-term whole body vibration are confined to cancellous bone.</a> Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 18 (4), 485-492 (2018).</li><li>Neustadt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Osteoporosis: A global health crisis. , (2017).</li></ol>

Este protocolo describe una prueba confiable de flexión en voladizo para cuellos femorales murinos. El escenario de flexión en voladizo natural que ocurre en el cuello femoral generalmente no está representado en las pruebas estándar de flexión de 3 y 4 puntos5. Este método de prueba es mejor y replica de manera más confiable el tipo de fracturas de cuello femoral experimentadas por pacientes con fragilidad ósea. El enfoque principal al realizar este protocolo es eliminar la variabilidad d...

El riesgo de fractura es una preocupación médica grave asociada con la osteoporosis. Más de 1.5 millones de fracturas por fragilidad se reportan cada año solo en los Estados Unidos, con fracturas que ocurren en la cadera, específicamente en el cuello femoral, como el tipo de fractura principal1. Se estima que el 18% de las mujeres y el 6% de los hombres experimentarán una fractura de cuello femoral en su vida2, y la tasa de mortalidad a 1 año después de la fractura es superior al 20%1. Por lo tanto, los modelos de ratón que permiten realizar pruebas biomecánicas del cuello femoral pueden ser adecuados para estudiar fracturas por fragilidad. Los modelos de ratón también ofrecen herramientas poderosas para dilucidar potencialmente eventos celulares y moleculares traducibles involucrados en la osteoporosis. Esto se debe a la disponibilidad de reporteros genéticos, la ganancia y pérdida de modelos de función y la amplia biblioteca de técnicas moleculares y reactivos. Las pruebas mecánicas de huesos de ratón pueden proporcionar las medidas de resultado necesarias para determinar la salud ósea, las variaciones genotípicas y fenotípicas que podrían explicar la etiología de la enfermedad, y evaluar las terapias basadas en medidas de resultado de la calidad del hueso y el riesgo de fractura3.
La anatomía del cuello femoral crea escenarios de carga mecánica únicos, que generalmente conducen a fracturas de flexión (flexión). La cabeza femoral se carga en la cavidad acetabular en el extremo proximal del fémur. Esto crea un escenario de flexión en voladizo en el cuello femoral, que está rígidamente unido al eje femoral distalmente4. Esto difiere de las pruebas tradicionales de flexión de 3 o 4 puntos en la diáfisis media femoral. Si bien estas pruebas son útiles, no replican la carga que generalmente conduce a fracturas por fragilidad en individuos osteopénicos y osteoporóticos en términos de ubicación de la fractura o el escenario de carga.
Para evaluar mejor el riesgo de fractura por fragilidad en ratones, se buscó mejorar la reproducibilidad de las pruebas de flexión en voladizo de cuellos femorales murinos. Como se predijo teóricamente, se ha demostrado que el ángulo de carga en la cabeza femoral en relación con el eje femoral afecta significativamente las medidas de resultado5, creando así un desafío para la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados informados. Para garantizar una alineación adecuada y consistente de los fémures durante la preparación de la muestra, se diseñaron guías y se imprimieron en 3D en función de las mediciones anatómicas realizadas en exploraciones μCT de fémures de ratón C57BL / 6. Las guías fueron diseñadas para ayudar a colocar consistentemente las muestras de tal manera que el eje femoral se mantenga a ~ 20 ° de la dirección de carga vertical. Este ángulo fue elegido porque maximiza la rigidez al tiempo que minimiza el momento máximo de flexión a lo largo del eje femoral, lo que aumenta la probabilidad de fracturas de cuello femoral y conduce a pruebas más consistentes y reproducibles5. Las guías se imprimieron en 3D en varios tamaños para acomodar las diferencias anatómicas entre las muestras y se utilizaron para mantener las muestras en una posición estable mientras se colocaban en macetas de cemento óseo acrílico. La rigidez, la fuerza máxima, la fuerza de rendimiento y la energía máxima se calcularon a partir de los gráficos de fuerza-desplazamiento. Este método de prueba mostró resultados consistentes para el resultado biomecánico antes mencionado. Con la práctica y la ayuda de la guía impresa en 3D, los errores de medición debidos a la desalineación se pueden minimizar, lo que resulta en medidas de resultado confiables.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188;&#8221; x &#188;&#8221; square aluminum tubing</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>48KU67</td>
			<td>Cut to lengths of 1/2&#34; to 1&#34; lengths</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kN load cell</td>
			<td>Instron</td>
			<td>2527-130</td>
			<td>Any load cell with sub 1 N resolution can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-45x Zoom Stereo Boom Microscope</td>
			<td>Omano</td>
			<td>OM2300S-GX4</td>
			<td>Microscope used to precisely line up samples with loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed guides</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Angled slots at 73.13&#176;, with diameters between 1.9 mm and 2.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed mount</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Tapped with M10 threads to fit the mount attachment and with 2 M4 threaded holes adjacent sides to hold the aluminum tubing with sample in place.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic Base Plate Material Kit</td>
			<td>Keystone Industries</td>
			<td>921392</td>
			<td>Mix 3.5 g of powder with 2 mL of liquid. This will be enough for approximately 8 samples, and will begin to harden quickly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to compile &#181;CT scans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biaxial stage</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>Used to center femoral head of sample under the loading platen.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMed Amber Resin</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RS-F2-BMAM-01</td>
			<td>Any resin from formlabs could be used for this project.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluehill 3</td>
			<td>Instron</td>
			<td>V3.66</td>
			<td>Software used to set up loading protocol and collect load, displacement and time data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPuls 10000</td>
			<td>Instron</td>
			<td>E10000</td>
			<td>Mechanical testing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron UltraFocus</td>
			<td>Faxitron BioOptics</td>
			<td>2327A40311</td>
			<td>X-ray imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>F2</td>
			<td>Used to print the mount and guides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form 2 Resin Tank LT</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>RT-F2-02</td>
			<td>LT Tank was used to be compatible with the BioMed Resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Used to assess &#181;CT and X-ray images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laxco iLED Series LED Light Source</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AMPSILED30W</td>
			<td>Light source used in conjugtion with microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading platen</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>This can be any metal rod that is tapered to a diameter of approximately 2.5 mm. We used an M6 screw that was tapered on a lathe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mount attachment</td>
			<td>Custom made</td>
			<td></td>
			<td>To secure the 3D printed mount to the load cell. We used a M10/M6 threaded rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Need to rehydrate the samples once acrylic base plate material has set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plumber&#39;s putty</td>
			<td>Oatey</td>
			<td>31174</td>
			<td>Used to seal the end of the aluminum tubing when pouring acrylic base plate material in. Any clay or putty could be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreForm</td>
			<td>formlabs</td>
			<td>Preform 3.15.2</td>
			<td>Formlabs software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td>Samples can be laid flat in culture dish and covered in PBS to rehydrate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>Scanco</td>
			<td>&#181;CT 40</td>
			<td>Representative set or actual samples can be scanned prior to printing of guides to calculate femoral shaft angle and diameter.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cantilever bending of murine femoral necks

Las fracturas en el cuello femoral son una ocurrencia común en individuos con osteoporosis. Se han desarrollado muchos modelos de ratón para evaluar los estados de la enfermedad y las terapias, con pruebas biomecánicas como medida de resultado primaria. Sin embargo, las pruebas biomecánicas tradicionales se centran en las pruebas de torsión o flexión aplicadas al eje medio de los huesos largos. Este no suele ser el sitio de fracturas de alto riesgo en individuos osteoporóticos. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo de pruebas biomecánicas que prueba los cuellos femorales de los fémures murinos en la carga de flexión en voladizo para replicar mejor los tipos de fracturas experimentadas por los pacientes con osteoporosis. Dado que los resultados biomecánicos dependen en gran medida de la dirección de carga de flexión en relación con el cuello femoral, se crearon guías impresas en 3D para mantener un eje femoral en un ángulo de 20 ° en relación con la dirección de carga. El nuevo protocolo simplificó las pruebas al reducir la variabilidad en la alineación (21.6 ° ± 1.5 °, COV = 7.1%, n = 20) y mejoró la reproducibilidad en los resultados biomecánicos medidos (COV promedio = 26.7%). El nuevo enfoque que utiliza las guías impresas en 3D para una alineación confiable de las muestras mejora el rigor y la reproducibilidad al reducir los errores de medición debido a la desalineación de las muestras, lo que debería minimizar los tamaños de las muestras en estudios de osteoporosis en ratones.

Cuando se colocaron en macetas con la ayuda de la guía, los ejes femorales se alinearon a 21.6 ° ± 1.5 °. Si bien esto representa una desviación del <10% del ángulo previsto de 20 °, los coeficientes de variación (COV) del ángulo de maceta en todas las muestras analizadas fueron del 7,6% y el 6,5% para ratones machos y hembras, respectivamente (n = 10 por grupo) según lo verificado por radiografías planas previas a la prueba (Figura 5). Además, las radiografías posteriores a la ...

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Cantilever Bending of Murine Femoral Necks

El presente protocolo describe el desarrollo de una plataforma de prueba reproducible para cuellos femorales murinos en una configuración de flexión en voladizo. Se utilizaron guías personalizadas impresas en 3D para fijar de manera consistente y rígida los fémures en una alineación óptima.

Flexión en voladizo de cuellos femorales murinos

Fractures in the femoral neck are a common occurrence in individuals with osteoporosis. Many mouse models have been developed to assess disease states and ...

La configuración de flexión en voladizo descrita en este protocolo crea un enfoque reproducible para generar fracturas de cuello femoral, que son más relevantes clínicamente y se pueden utilizar en estudios murinos para observar la osteoporosis. Este protocolo crea una plataforma de pruebas que mejora la reproducibilidad, lo que lleva a una disminución del coeficiente de variación en las medidas de resultado. Por lo tanto, minimiza el tamaño de la muestra necesario para estudios robustos.Comience cortando secciones de tubos de longitud de 1/2 pulgada a 1 pulgada usando tubos de aluminio cuadrados de 1/4 de pulgada por 1/4 de pulgada. Etiquete cada segmento de aluminio con los ID de muestra con una herramienta de grabado. Llene la mitad de los segmentos de los tubos con masilla y colóquelos en un accesorio para mantenerlos en posición vertical.Coloque los fémures limpios planos en la mesa de trabajo para que la superficie anterior esté hacia arriba. Luego, coloque la guía impresa en 3D directamente debajo del tercer trocánter, donde el diámetro del eje se vuelve consistente. Sostenga los extremos proximal y distal con una mano.Presione firmemente el fémur sobre el banco de trabajo y, con la otra mano, coloque la guía impresa en 3D en el eje medio del fémur para evitar que el fémur gire hacia el lado lateral o medial. Luego, colóquelos frente a los segmentos de aluminio correspondientes. Llene los segmentos de aluminio con cemento óseo hasta que estén casi llenos, dejando un poco de espacio para el desplazamiento.Coloque los fémures con guías en el segmento de aluminio correcto y permita que el cemento óseo se cuaje. Después de que el cemento óseo se haya endurecido, coloque las muestras en una placa de Petri con PBS a temperatura ambiente y deje que se rehidraten durante dos horas. Utilice un sistema de pruebas mecánicas para conectar y calibrar una célula de carga con una resolución inferior a 1 Newton.Coloque un accesorio con una ranura cuadrada para sujetar firmemente los segmentos de aluminio con las muestras. Coloque los tornillos de ajuste en los dos lados del accesorio de sujeción para mantener firmemente las muestras en su lugar. Luego, conecte una placa de carga en el actuador.Coloque un microscopio estéreo en una superficie directamente frente al MTS. Coloque fuentes de luz alrededor del sistema si se necesita iluminación adicional para ver la configuración a través del microscopio. En el software MTS, comience la creación de un nuevo protocolo de flexión.Asegúrese de que el protocolo operará en el control de desplazamiento. Establezca la velocidad de carga del protocolo en 0,5 milímetros por segundo. Si el software tiene una configuración para las teclas programables, agregue las teclas programables Balance y Zero Extension al protocolo.Asegúrese de que el programa de software registre el tiempo en segundos, la carga en Newtons y la extensión o desplazamiento en milímetros a una frecuencia de muestreo mínima de 100 hercios. Guarde el nuevo protocolo y vuelva a la pantalla principal del programa de software para comenzar la prueba de un nuevo conjunto de muestras. Obtenga una imagen de rayos X de las muestras en las macetas de aluminio.Se pueden obtener imágenes de varias muestras a la vez. Asegúrese de que se capture la vista anterior de las muestras para permitir la verificación de las mediciones del ángulo de maceta. Coloque un segmento de aluminio con muestra en el accesorio de sujeción y apriete los tornillos del conjunto.Baje el actuador hasta que esté a unos pocos milímetros de la cabeza femoral. Use el microscopio estereoscópico para ajustar la etapa biaxial para alinear la posición de la cabeza femoral directamente debajo de la placa de carga. Bloquee la etapa biaxial en su lugar.En el software MTS, ponga a cero la posición del actuador y equilibre la célula de carga utilizando las teclas programables agregadas Balance y Zero Extension. Luego, comience el protocolo de carga. Dependiendo de cuánto espacio quedó entre la placa de carga y la muestra, las pruebas solo tomarán de 10 a 30 segundos.Después de la prueba, capture otra radiografía anterior de la muestra. Esto se utilizará para discernir y documentar el modo de fractura. Aquí se presentan los coeficientes de variación, o COV, de las propiedades de flexión medidas de los cuellos femorales de ratón.COV representa la relación entre la desviación estándar y la media de un conjunto de datos, y su disminución indica una agrupación más estrecha de los puntos de datos individuales alrededor de la media. Este protocolo disminuyó el COV para la carga máxima en comparación con otras publicaciones que realizan pruebas similares. Se utiliza una curva de desplazamiento de fuerza representativa que muestra un ajuste lineal de desplazamiento del 0,2% para derivar la rigidez y el punto de rendimiento.Las medidas de resultado seleccionadas se trazan, mostrando la media y la desviación estándar, incluida la carga máxima en la falla, la rigidez, el desplazamiento máximo en la falla y el trabajo hasta la falla. Los asteriscos indican diferencias significativas determinadas mediante una prueba t no apareada de una cola. Los cuellos femorales de los ratones machos fueron significativamente más fuertes y rígidos que los especímenes de ratones hembra.Además, los cuellos femorales femeninos experimentaron deformaciones más significativas y trabajaron hasta el fracaso en comparación con los especímenes de ratones machos. Esto es consistente con la menor densidad mineral ósea en las mujeres y subraya la sensibilidad de la prueba para detectar diferencias fisiológicamente relevantes. Las medidas de resultado biomecánicas, incluida la carga máxima, la rigidez, el desplazamiento máximo y el trabajo hasta el fracaso, se trazaron contra el ángulo de maceta y se correlacionaron mediante una regresión lineal simple para la cohorte masculina, la cohorte femenina y todas las muestras agrupadas.Las líneas negras sólidas muestran la regresión lineal de las muestras de grupo, y las líneas punteadas indican intervalos de confianza. La variabilidad en el ángulo de maceta no afectó significativamente la carga máxima, el desplazamiento máximo o el trabajo de falla. Sin embargo, a medida que aumentaba el ángulo de maceta, aumentaba la rigidez.Lo más importante que debe recordar al intentar este protocolo es mantener el procedimiento de maceta y las tasas de carga iguales para comparar mejor sus resultados con los datos publicados anteriormente. Si se utiliza una alternativa al cemento óseo, como una aleación de bismuto que se puede ablandar para eliminar la muestra después de la prueba, las muestras pueden someterse a otros procedimientos, como espectroscopia Raman, DEXA o flexión de tres puntos, para dilucidar propiedades mecánicas, químicas y estructurales adicionales.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

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