Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

يشكر المؤلفون إدارة كليمسون والطاقم الطبي وموظفي المختبر السريري في مختبر REDDI الذين ساعدوا في تنفيذ وإدارة اختبار SARS-CoV-2. نشكر الدكتور فيليب باكهولتس والدكتورة كارولين بانيستر من جامعة ساوث كارولينا على الاستشارات الأولية للمشروع والاتصالات الصناعية لشراء المعدات. نشكر العديد من الطلاب والأساتذة والموظفين على مساعدتهم في جمع العينات. شكرا لطلاب Creative Inquiry على جمع بيانات المنحنى القياسية. تم تلقي تمويل هذه الدراسة من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121342 (الممنوحة ل DD و LGP) ، وإدارة كليمسون الرياضية ، ونائب رئيس جامعة كليمسون للبحوث ، وحاكم ولاية كارولينا الجنوبية ولجنة مراجعة السندات المشتركة.

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه. يندرج الفحص الموصوف في البروتوكول تحت SalivaDirect EUA المقدم من كلية ييل للصحة العامة.

تم تقييم الفحص الموصوف في البروتوكول من خلال دراسة تحقق مستقلة. وجد أن الفحص كان له خصوصية بنسبة 98.9٪ (1.1٪ إيجابية كاذبة) وحساسية 90.0٪ (10.0٪ سلبية كاذبة) عند تقييمها مقابل مسحات البلعوم الأنفي المقترنة المأخوذة في نفس الوقت (n = 837 ؛ 817 سلبية ، 20 إيجابية). الأهم من ذلك ، تم إعادة اختبار ثلاثة مشاركين ثبتت إصابتهم ب TigerSaliva وسلبية مع مسحة البلعوم الأنفي بمسحات بعد 48 ساعة وعادوا بنتائج إيجابية ، مما يشير إلى أن TigerSaliva قد يكون قادرا على اكتشاف عدوى SARS-CoV-2 في وقت مبكر من أثناء المرض.
قمنا بمحاكاة عينات اللعاب الإيجابية عن طريق رفع اللعاب الخالي من الفيروسات (المعالج حراريا وغير المعالج حراريا على حد سواء) مع تركيزات معروفة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 وأجرينا تخفيفا بمقدار 10 أضعاف لتحديد حد Ct في اللعاب. لم يكن من الممكن اكتشاف جين N1 أقل من 10000 نسخة جينية (حوالي Ct = 28) في عينات إيجابية محاكاة. نحن نشك في أن هذا يرجع إلى تدهور RNase أو عوامل مربكة أخرى. ومع ذلك ، من المحتمل أن يختلف تفاعل اللعاب مع الحمض النووي الريبي الاصطناعي العاري عن التفاعل مع الجسيمات الفيروسية ، حتى بعد تشويهها بالحرارة. تم تحديد عينات اللعاب الإيجابية باستخدام Ct >30 وحصلت المختبرات الخارجية على بيانات التسلسل الجيني SARS-CoV-2 من هذه العينات. نتوقع أن البروتينات الفيروسية توفر الحماية من تدهور الحمض النووي الريبي في عينات لعاب المرضى.
الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تنفيذ الأتمتة لإعداد المزيج الرئيسي ومعالجة عينات اللعاب (القسمان 4 و 7 على التوالي). وهذا يسمح بتداخل عمليات المهام ، مما يقلل بشكل كبير من وقت الإنجاز. خطوة حاسمة أخرى هي تفسير النتائج السريرية (القسمان 11 و 12). كما أدى إنشاء فئات النتائج الوسيطة (إعادة التشغيل وإعادة تشغيل N1) إلى تقليل حدوث نتائج اختبار غير حاسمة.
لقد أظهرنا أن التباين بين طرق تحميل عينات اللعاب اليدوية والآلية لا يكاد يذكر (الشكل 5A) وأن الأتمتة قد تحسن من قابلية تكرار الكشف عن SARS-CoV-2 (الشكل 5B). يجب تفضيل الأتمتة لتسهيل الاختبار عند تصميم وتوسيع المختبرات السريرية25. تم تحسين سير العمل في المختبر من خلال تنفيذ المهام الآلية للروبوت26. تسمح القدرات مفتوحة المصدر لروبوتات مناولة السوائل بتنفيذ برمجة نصية مخصصة لتصميم البروتوكول. وهذا يجعل روبوتات مناولة السوائل نظاما غير مكلف وقابلا للتعديل بدرجة عالية مقارنة بطرق الأتمتة السريرية التقليدية. كما أنها استراتيجية مثالية لتنفيذ المهام المختبرية المتكررة للغاية. يترجم المستوى العالي من قابلية التخصيص للنظام إلى حرية تغيير أدوات المختبر (على سبيل المثال ، أنابيب التجميع أو أطراف الماصة أو لوحات 384 بئرا) في حالة النقص. لذلك ، فإن الأتمتة باستخدام روبوتات مناولة السوائل قابلة للتطبيق لكل من المراقبة والأبحاث على نطاق واسع وصغير.
تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لاستراتيجية الاختبار هذه في وقت تسليم أقصر بكثير مقارنة بالمختبرات السريرية الأخرى. يلعب استخدام روبوتات مناولة السوائل الآلية دورا رئيسيا في تقليل وقت الاستجابة ، ولكن الاستخدام المتزامن للروبوتات وأجهزة التدوير الحراري مفيد أيضا في زيادة كفاءة الاختبار إلى أقصى حد. يجب تشغيل روبوت واحد وجهاز تدوير حراري كزوج ، حيث يتم استخدام كلا الجهازين جنبا إلى جنب لتحميل العينات دون انقطاع وتحليل نتائج العينات. بمجرد إنشاء تدفق ثابت للعينات المعينة ، يمكن تشغيل جميع أزواج الماكينات في وقت واحد. الاستخدام المتزامن المستمر للروبوتات وأجهزة إعادة التدوير الحراري يزيد بشكل كبير من قدرة الاختبار وكفاءته ، وهو أمر بالغ الأهمية لاستيعاب حجم الاختبار المرتفع.
وعلى النقيض من بروتوكولات SARS-CoV-2 RT-qPCR الأخرى المعمول بها، قمنا بتضمين خطوة هبوط في بروتوكول التدوير الحراري لتحسين تلدين مجموعات المسبار والتمهيدي للجينات المستهدفة27، مما يقلل من خطر فشل التضخيم. أظهرت النتائج أن الهبوط حسن من اكتشاف العينات الإيجابية دون المخاطرة بفقدان ربط تمهيدي محدد (الجدول 4). قررنا أن مجموعة واسعة من نسخ الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 (الشكل 4A) ونسخ الحمض النووي Hs_RPP30 (الشكل 4B) يمكن اكتشافها في وقت واحد بواسطة فحص RT-qPCR.
أحد القيود المفروضة على روبوتات مناولة السوائل هو إمكانية التلوث المتبادل من العينات الإيجابية أثناء نقل اللعاب. اللعاب هو سائل لزج مرن28 وقد يخيط عبر الآبار المجاورة بعد الاستغناء عنه من طرف الماصة. علاوة على ذلك، قد يسبب عدم تجانس اللعاب29 توزيعا غير متساو للجسيمات الفيروسية في جميع أنحاء العينة. هذا يزيد من إمكانية كل من الإيجابيات والسلبيات الخاطئة ، مما يستلزم تعيين عينات N1 Rerun و Rerun. ومع ذلك ، فإن 14.1٪ من العينات التي تم تعيينها في البداية على أنها N1 Rerun تم حلها على أنها إيجابية ل SARS-CoV-2 وكانت أكثر عرضة بأكثر من 30 مرة من عينات Rerun لحلها على أنها إيجابية بعد إعادة الاختبار. وبالتالي ، فإن التمييز بين Rerun و N1 Rerun (الشكل 3) سمح بفصل أكثر دقة للعينات الإيجابية المحتملة ، مما زاد من حساسية وخصوصية الفحص التشخيصي لدينا. المعلمات الأخرى الناتجة لاختبار اللعاب التشخيصي لم تجعل هذا التمييز12،14،24،30،31.
قد يكون من الصعب ماصة عينات اللعاب بسبب عدم التجانس واللزوجة32. تعمل المعالجة الحرارية على تشويه البروتينات الموجودة في المصفوفة الحيوية للعاب بشكل كاف، مما يقلل من اللزوجة ويلغي الحاجة إلى كواشف استخراج الحمض النووي الريبي9، التي كانت نادرة خلال المراحل المبكرة من الجائحة10. كما أن المعالجة الحرارية الموسعة تعطل الفيروسات الحالية33 مما يسمح بالمعالجة المختبرية بمستويات أقل من السلامة الأحيائية. ونتيجة لذلك، تم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الحرارة (الموصوف في القسم 5.4) لتقليل اللزوجة من خلال تمسخ البروتين (الشكل 6). بناء على النتائج ، نفترض أن المعالجة الحرارية قد تؤدي أيضا إلى تجانس عينات اللعاب بالإضافة إلى تمسخ المصفوفة الحيوية للبروتين. مجموعات أخرى جمعت بين المعالجة الحرارية ومعالجة بروتين K لزيادة التجانس9،14،34. لقد اخترنا عدم تنفيذ هذه الخطوة لأنها قد تشوه بروتينات الفيروسات بمعدل يترك الحمض النووي الريبي الفيروسي عرضة للتحلل الحراري35. علاوة على ذلك ، قد يخفي تخفيف العينة باستخدام بروتين K عينات إيجابية تحتوي على جزيئات فيروسية أقل وبالتالي تقليل الحساسية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة نتائج الفحص بفحص SARS-CoV-2 القائم على اللعاب المتاح تجاريا (Logix Smart COVID-19) والذي يستخدم استخراج الحمض النووي الريبي من الخرز المغناطيسي (الجدول 5). وقد وجد أن الفحص الحالي كان أكثر ملاءمة للكشف عن العينات الإيجابية الضعيفة مقارنة بالفحص المتاح تجاريا.
من الصعب تحديد عدد نسخ الفيروس في اللعاب باستخدام RT-qPCR فقط ، لأن qPCR شبه كمي. هناك اختلاف متأصل بين قيم Ct التي تنشأ من القيود التقنية. يمكن تحديد عدد النسخ الجينية من قيم Ct (الشكل 4) وهو يعادل تقريبا عدد النسخ الفيروسية. أحد الحلول الممكنة لتحديد عدد النسخ الفيروسية في عينات اللعاب هو ddPCR ، والذي يوفر تكميليا ثابتا للنسخ الجينية في التفاعل. ومع ذلك ، نعتقد أنه من الكافي توفير نتائج نوعية للأطباء ويمكن مقارنة المحتوى الفيروسي النسبي عبر العينات التي تتم معالجتها بأساليبنا.
على الرغم من بعض القيود التي تنشأ عند استخدام اللعاب ، فإن فحص SARS-CoV-2 بواسطة RT-qPCR القائم على اللعاب يثبت أنه طريقة فعالة للكشف السريع والموثوق به عن الحمض النووي الريبي الفيروسي على أي نطاق من الاختبارات. هذا صحيح بشكل خاص عندما يقترن باستخدام أنظمة مناولة السوائل مفتوحة المصدر. يمكن تعديل نهج الاختبار هذا للكشف عن تسلسلات الأحماض النووية الأخرى ذات الصلة بالتشخيص ، مثل عوامل الأمراض المعدية أو علامات المرض أو الفيروسات الأخرى. وهذا يجعل الفحص قابلا للتطبيق على كل من الجهود التشخيصية السريرية والبحثية.

ظهر فيروس كورونا 2 المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2)، وهو فيروس تاجي جديد، في أواخر عام 2019 وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. تسبب عدوى SARS-CoV-2 مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، وهو مرض شديد العدوى مع أعراض تنفسية والتهابية حادة محتملة. وتشير القابلية العالية للانتقال إلى جانب انخفاض معدل الوفيات إلى أن الفيروس سينتشر بسرعة بين السكان وسيتطلب زيادة الاختبارات التشخيصية2,3. وشجعت توصيات الصحة العمومية على إجراء فحوص سكانية واسعة النطاق لعزل الحالات وبالتالي خفض معدلات انتقال العدوى4,5,6. وعلاوة على ذلك، كشفت نماذج ترصد السكان أن زيادة تواتر الاختبار وتقليل وقت الإبلاغ كان لهما تأثير أكبر على الحد من انتقال العدوى من زيادة حساسية الاختبار7. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أنه يمكن وضع الأفراد المصابين في الحجر الصحي في وقت مبكر، وبالتالي كسر سلاسل العدوى.
كان معيار اختبار تضخيم الحمض النووي الأصلي (NAAT) هو مسحات البلعوم الأنفي (NP) التي تمت معالجتها بواسطة RT-qPCR8. ومع ذلك، تنشأ مضاعفات مع هذا النوع من الاختبارات لعدد كبير جدا من السكان، مثل زيادة التكلفة النسبية وتفاقم ضغط سلسلة التوريد9,10. علاوة على ذلك ، يعتمد كل من جمع العينات ومعالجة طرق NAAT الشائعة (بما في ذلك مسحات NP ، ومسحات البلعوم الفموي ، ومسحات منتصف التوربينات ، ومسحات الأنف) على المعدات المتخصصة والكواشف والموظفين الطبيين 9,10.
بديل مناسب لاختبار مسحة NP RT-qPCR هو الاختبار القائم على اللعاب ، وهو أداة تشخيصية دقيقة للكشف عن SARS-CoV-2 11،12،13،14. يؤدي إجراء RT-qPCR مباشرة على عينات اللعاب إلى حساسية وخصوصية مماثلة لمسحات NP 15. إحدى المزايا الرئيسية لاختبار اللعاب على اختبار مسحة NP هي أنه يسمح بالجمع الذاتي للعينات16. هذا يقلل من الحاجة إلى الموظفين الطبيين ويزيد من سهولة جمع العينات للمرضى من خلال كونها أقل توغلا من مسحات NP. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن عينات اللعاب لا تتطلب مخازن مؤقتة لإزالة العينة من مسحة (كما هو الحال في عينات NP) ، يمكن للاختبارات القائمة على اللعاب استخدام استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الحرارة (RNA) مباشرة ، مما يقلل من تكاليف الاختبار عن طريق إزالة الحاجة إلى مخازن مؤقتة إضافية و / أو وسائط نقل و / أو كواشف استخراج الحمض النووي الريبي 14,17.
تم إنشاء مختبر جامعة كليمسون للبحوث والتعليم في تشخيص الأمراض والتدخل (REDDI) لتلبية احتياجات الجامعة لاختبار COVID-19 والمراقبة. وفي المجموعات السكانية المغلقة، بما في ذلك الجامعات، أسفرت اختبارات الترصد المتكررة المقترنة بالتباعد الاجتماعي عن النتائج الأكثر ملاءمة في النماذج الوبائية لانتشار الأمراض18. تم تكييف بروتوكولات CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 و SalivaDirect14 الموحدة ، وتم استخدام الأتمتة في سير العمل السريري لتقليل التكلفة وتحسين وقت التحول. وكانت المجموعات السابقة قد استخدمت روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر لخطوات استخراج الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2222، لكننا حققنا أقصى استفادة من الروبوتات لإعداد لوحات الاختبار وتحميل العينات22. هنا ، نظهر أن البروتوكول المعدل واستخدام أنظمة مناولة السوائل مفتوحة المصدر (الشكل 1) يسمح ب RT-qPCR سريع ودقيق قائم على اللعاب وهو استراتيجية فعالة لمراقبة الصحة العامة على نطاق واسع.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

أدى ظهور الأزمة الصحية العالمية الأخيرة ل SARS-CoV-2 إلى ظهور تحديات رئيسية للبحوث الوبائية والاختبارات السريرية. تميزت جائحة كوفيد-19 بارتفاع معدل انتقال العدوى وانخفاض معدل الوفيات، واستلزمت إجراء اختبارات تشخيصية دقيقة وفعالة، لا سيما في المجموعات السكانية المغلقة مثل الجامعات السكنية. كان التوافر الأولي لاختبار الحمض النووي ، مثل مسحات البلعوم الأنفي ، محدودا بسبب ضغط سلسلة التوريد الذي أخر أيضا الإبلاغ عن نتائج الاختبار. أظهر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائم على النسخ العكسي القائم على اللعاب (RT-qPCR) أنه قابل للمقارنة في الحساسية والخصوصية لطرق الاختبار الأخرى ، وجمع اللعاب أقل توغلا جسديا للمشاركين. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير اختبار تشخيصي RT-qPCR متعدد الإرسال لمراقبة السكان في جامعة كليمسون والمجتمع المحيط بها. استخدم الفحص روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر وأجهزة تدوير الحرارة بدلا من أنظمة الأتمتة السريرية المعقدة لتحسين سير العمل ومرونة النظام. تتيح أتمتة RT-qPCR القائم على اللعاب الكشف السريع والدقيق عن مجموعة واسعة من تركيزات الحمض النووي الريبي الفيروسي لكل من متطلبات الاختبار الكبيرة والصغيرة. وبلغ متوسط التحول للنظام الآلي < 9 ساعات ل 95 في المائة من العينات و < 24 ساعة ل 99 في المائة من العينات. كانت تكلفة اختبار واحد 2.80 دولار عندما تم شراء جميع الكواشف بكميات كبيرة.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

يصف البروتوكول طريقة تشخيص SARS-CoV-2 التي تستخدم التشغيل الآلي مفتوح المصدر لإجراء اختبار جزيئي RT-qPCR لعينات اللعاب. ويمكن تطبيق هذا النهج القابل للتطوير على مراقبة الصحة العمومية السريرية وكذلك لزيادة قدرة المختبرات الجامعية الأصغر.

استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

لقد طورنا اختبارا وسير عمل منخفض التكلفة قائما على اللعاب يعتمد على اللعاب ويسهل تنفيذه وتوسيع نطاقه لتطبيقات الفحص المجتمعي واسعة النطاق. هنا نستخدم روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر وأجهزة تدوير الحرارة القياسية والبرامج لإجراء اختبار مباشر للعاب دون استخراج أو تثبيت المخازن المؤقتة مع الاستمرار في توفير نتائج تشخيصية دقيقة. بسبب سير العمل المتوازي الآلي البسيط ، يمكن توسيع نطاق النظام لإجراء آلاف الاختبارات يوميا مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات والمساحة والموظفين.بالإضافة إلى كايلي كينغ ، ستساعد راشيل هام ، المشرفة على المختبر السريري لدينا وأوستن سموذرز منسق التعليم لدينا ، في إظهار الإجراء ابدأ بتطهير الجزء الخارجي من أنابيب جمع اللعاب بنسبة 70٪ من الإيثانول ونقلها إلى المختبر للاختبار. سجل وصول العينة عن طريق مسح كل نموذج من الباركود في جدول بيانات المدخول اليومي. عالج عينات المسح الحراري لمدة 30 دقيقة في فرن 95 درجة مئوية ثم قم بإزالة العينات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة.افتح جداول بيانات تحميل العينة اليومية لكل روبوت تحميل عينة في محطة تعيين العينة. ثم قم بتعيين 188 عينة لكل لوحة بئر 384. صواني الملصقات مع اسم اللوحة والتاريخ ورقم الربع.امسح العينات ضوئيا بالترتيب في جدول بيانات تحميل العينة. في محطة تحميل العينات ، اصطف مجموعتين كاملتين من ثمانية رفوف مطبوعة 3D ، تتوافق مع وضع سطح السفينة في الروبوت. قم بفك أنابيب الربع الأول ووضعها في رفوف مطبوعة ثلاثية الأبعاد ، بدءا من الموضع A1 في الرف الأول.املأ كل رف من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل. استمر في نمط التحميل هذا في الرف الثاني ، ثم انتقل إلى الرفوف الرابعة والخامسة. ضع رفوف عينة ربع محملة على الطوابق واحد ، اثنان ، أربعة ، خمسة ، سبعة ، ثمانية ، 10 ، 11.ضع نصائح P20 على الطوابق الثالثة والتاسعة. لتبسيط عملية الإعداد، قم بتحميل المواد من الخلف إلى الأمام في الروبوت. يتم إنتاج لوحات المزيج الرئيسية على روبوت مخصص وتخزينها عند أربع درجات مئوية.يتم استخدام لوحة واحدة في كل مرة ويتم تصنيفها باسم اللوحة ، ويتم استخدام شفرة حادة لقطع خط في الرقائق حول آبار التحكم. ضع لوحة الخلط الرئيسية على السطح السادس وقشر غطاء الرقائق ، تاركا وراءه المستطيل الصغير الذي يغطي آبار التحكم. اكشف عن صناديق الأطراف وأغلق الروبوت.قم بتهيئة بروتوكول تشغيل Python المخصص بالنقر فوق بدء التشغيل من خلال تطبيق سطح المكتب الروبوت. يستغرق كل ربع سنة 24.5 دقيقة للتحميل على اللوحة. قم بتعيين مؤقت كتذكير.أثناء تشغيل الروبوت ، قم بفك الغطاء وتحميل ربع أنبوبين للعينة في المجموعة الثانية من الرفوف المطبوعة 3D. عندما يتوقف الروبوت مؤقتا، قم بإزالة الرفوف ربع الأولى واستبدلها بربع رفوفين، ثم انقر على استئناف التشغيل في تطبيق سطح المكتب. قم بتلخيص ربع واحد من أنابيب العينة وتخزينها في ثلاجة بأربع درجات مئوية أثناء انتظار النتائج.كرر عملية التحميل هذه للربعين الثالث والرابع. انقل اللوحة المحملة إلى خزانة السلامة الحيوية. لتقليل التلوث، حافظ على تغطية اللوحة أثناء النقل.جمع أي عينات متكررة وتعيينها كآخر العينات في الربع الرابع. قم بترقم العينات ومسح الباركود ضوئيا وأدخل موقع العينة الأصلي والنتيجة في جدول بيانات تحميل العينة. انقل العينات المتكررة إلى خزانة السلامة الحيوية.لا تقم بتحميل أنابيب العينة المتكررة في رفوف تحميل الروبوت. ماصة ميكرولترين من كل عينة متكررة إلى الآبار الصحيحة. استخدم الماصة المخصصة لإضافة عينات المرضى.حافظ على تغطية آبار التحكم بالرقائق المعدنية، مع إضافة عينات لتقليل التلوث. قشر غطاء الرقائق فوق آبار التحكم باستخدام الملقط. ماصة ميكرولترين من عينات المرضى الإيجابية المؤكدة في الآبار M23 و M24.ماصة ميكرولترين من المياه الخالية من النوكليز إلى الآبار N23 إلى N24 واثنين من الميكرولترات من 200 نسخة لكل ميكرولتر التحكم الإيجابي المختلط إلى الآبار O23 إلى O24. اترك الآبار P23 إلى P24 فارغة لمراقبة جودة دفعة المزيج الرئيسي. قم بتغطية اللوحة بختم شفاف بصريا واستخدم بكرة قضيب للالتصاق بالختم لجميع الآبار.دوامة اللوحة في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لخلط جيدا ، ثم الطرد المركزي لوحة في 500 مرة G لمدة دقيقة واحدة. حدد برنامج البروتوكول في برنامج التدوير الحراري واحفظ البروتوكول للألواح المستقبلية. ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البروتوكول.تصدير قيم CT ونسخ القيم إلى نموذج تحميل جدول البيانات. للتحكم الإيجابي ، تحقق مما إذا كان هناك عنصر تحكم إيجابي واحد على الأقل ينتج قيم CT بين 22 و 28 لكل من تحقيقات P1 و N1. وبدلا من ذلك، تنتج آبار العينات الإيجابية المعروفة قيم P1 و N1 CT أقل من 33 في مجسات P1 و N1.للتحكم السلبي ، تحقق من عدم وجود قيم N1 أو P1 CT في أي من بئري التحكم السلبيين. تأكد من أن قيم التصوير المقطعي المحوسب لها منحنيات تضخيم صالحة قبل إبطال اللوحة. إذا أنتج P1 نتيجة للتصوير المقطعي المحوسب أقل من 33 ، ففكر في البئر كما هو صالح وانتقل إلى النتيجة من N1. إذا كان P1 ينتج نتيجة للتصوير المقطعي المحوسب أكبر من أو يساوي 33 أو لا قيمة التصوير المقطعي المحوسب ، ففكر في البئر غير صالح.إذا كان N1 ينتج نتيجة CT أقل من 33 ، فقم بتقييم البئر بنعم. إذا لم ينتج N1 قيمة CT ، فقم بتقييم البئر لا. إذا كان N1 ينتج قيمة CT أكبر من أو تساوي 33 ، فقم بتقييم البئر أو عدم وجود نجم.تأكد من أن جميع قيم N1 CT مقترنة بمنحنى تضخيم حقيقي. إذا كانت قيمة CT ل N1 ليس لها منحنى تضخيم ، فإن البئر لا. حدد العينات المتكررة، وقم بتصنيفها برقم عينة داخلي ونوع العينة وإعادتها إلى سير عمل التحميل.تظهر الصور التمثيلية اكتشاف RTQ PCR للحمض النووي الريبي الاصطناعي N1 أو SARS CoV-2 والحمض النووي الاصطناعي P1 أو HSRPP30. تم رسم المنحنيات القياسية مع الانحرافات المعيارية لتحديد نطاق الكشف الدقيق باستخدام هذا المزيج التمهيدي للمسبار. تم رسم متوسط قيم CT التي تم الحصول عليها في التخفيفات ذات الصلة مقابل الكمية المقدرة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي والحمض النووي الاصطناعي.في كلتا الحالتين ، أظهرت المنحنيات الخطية معاملات ارتباط جيدة عبر مجموعة واسعة من تركيزات النسخ الجينية. تم نقل قيم N1 CT التي تم الحصول عليها من عينات فريدة باستخدام كل من تحميل العينة الروبوت واليدوي لتحديد التباين بين الفحص بين التحميل اليدوي والروبوت. أنتجت العلاقة الخطية بين الطرق اليدوية والآلية معامل ارتباط مرتفع يشير إلى أن كلتا الطريقتين متكافئتان وظيفيا.كما تم تحديد تباين المقايسة الداخلية باستخدام قيم N1 CT التكرارية المنقولة التي تم الحصول عليها من كل من الروبوت وتحميل العينات اليدوي. يظهر هنا تقييم طرق المعالجة الحرارية لتقليل اللزوجة في اللعاب. تم جمع اللعاب السلبي SARS CoV-2 من مصدر واحد وتم معالجة aliquots بالحرارة إما لمدة صفر دقيقة أو 30 دقيقة أو 60 دقيقة عند 95 درجة مئوية.تم رسم قيم P1 CT من النسخ المتماثلة التقنية لكل حالة لتحديد التباين بين طرق العلاج. أنتجت كل من طرق المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة انخفاضا كبيرا في تباين العينة مقارنة بعدم التحكم في المعالجة. لم يكن هناك فرق كبير بين 30 دقيقة و 60 دقيقة العلاجات.لذلك تم تنفيذ طريقة المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة لتقليل وقت المعالجة. استخدم تقنية التعقيم المناسبة لتقليل تلوث لوحات الاختبار ، خاصة عند تحميل العينات اليدوية وعناصر التحكم. تجنب عبور الطبق بيديك أو أكمامك.بعد إنتاج النتائج السريرية، يمكن التخلص من العينات في نفايات المخاطر البيولوجية أو يمكن حفظها لمزيد من التحليل، مثل تسلسل الجينوم الكامل لتحديد سلالات معينة. تسمح هذه التقنية بإجراء اختبارات مجتمعية واسعة النطاق ، مما يسمح لنا بالتحقيق في آثار تغطية الاختبار والانتشار غير العرضي ل Covid 19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

استخدام استراتيجية قفيصة التأسيس Antigen ل تطوير المناهج اتش المصلي 5 تنقلها لقاح

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

سريع، متعدد المراسل المزدوج IgG وIgM سارس-CoV-2 تحييد المقايسة لنظام تحليل التدفق متعددة الخرز القائم

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

الكشف عن الأجسام المضادة للمجال الملزمة للمستقبلات من سارس-CoV-2 باستخدام جهاز تقرير حيوي قائم على HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

التصوير الحي والقياس الكمي للعدوى الفيروسية في الفئران المعدلة وراثيا K18 hACE2 باستخدام SARS-CoV-2 المؤتلف الذي يعبر عنه المراسل

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...