Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Forfatterne takker Clemsons administration, medicinsk personale og kliniske laboratoriemedarbejdere på REDDI Lab, der hjalp med at implementere og styre SARS-CoV-2-test. Vi takker Dr. Phillip Buckhaults og Dr. Carolyn Bannister fra University of South Carolina for indledende projektrådgivning og branchekontakter til indkøb af udstyr. Vi takker mange studerende, professorer og medarbejdere for deres hjælp til prøveindsamling. Tak til Creative Inquiry-studerende for standard indsamling af kurvedata. Finansiering til denne undersøgelse blev modtaget fra National Institutes of Health-tilskuddet P20GM121342 (tildelt DD og LGP), Clemson Athletic Department, Clemson University's Vice President for Research og South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee.

Al forskning blev udført i overensstemmelse med Clemson University og Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1. juli 2020).
1. Opsætning af open source væskehåndteringsrobot
<ol><li>Installer højeffektive partikelluftfiltermoduler (HEPA) (se materialetabel) øverst på hver væskehåndteringsrobot i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Fastgør en 8-kanals P20-pipette til venstre montering af mastermixpladeforberedelsesrobotten (e) i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Fastgør en P20-pipette til højre montering af prøvebelastningsrobotten/-robotterne i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Download de brugerdefinerede Python-scripts (Supplerende fil 1 og Supplerende fil 2) på de relevante computere.</li>
	<li>Åbn TigerSaliva Full 384 Loading.py i desktop-applikationen ved prøveindlæsningsrobotcomputerne. Klik på Kalibrer , og konfigurer både pipetten og programmet i henhold til softwareanvisningerne.</li>
	<li>Åbn 12 Full Plates.py i desktop-applikationen på master mix-robotcomputeren. Klik på Kalibrer , og konfigurer både pipetten og programmet i henhold til softwareanvisningerne.</li>
	<li>Udskriv brugerdefinerede prøvestativer med en smeltet aflejringsmodelleringsprinter med tredimensionel (3D) ved hjælp af en CAD-fil (Computer Aided Design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Udskriv 16 stativer pr. prøveindlæsningsrobot til to sæt af otte stativer.</li>
</ol>2. Fremstilling af 20x multiplex N1 + P1 sonde / primer blanding
<ol><li>Forbered et parti 20x multiplex N1 + P1 sonde / primerblanding (samlet volumen på 20 ml, tabel 1) i et 50 ml konisk rør i et sterilt miljø væk fra syntetisk SARS-CoV-2 RNA eller patientprøver.</li>
	<li>Aliquot 1,6 ml af blandingen ved hjælp af en serologisk pipette i sterile 2,0 ml centrifugerør og mærk passende.</li>
	<li>Opbevar aliquots i en -20 °C fryser, indtil de er klar til brug.</li>
</ol>3. Fremstilling af positiv kontrolblanding
BEMÆRK: Positiv kontrolblanding bør ikke fremstilles i samme sterile miljø som sonde/primerblanding eller andre masterblandingskomponenter. Der skal anvendes en separat beholder med nukleasefrit vand.
<ol><li>Fortynd SARS-CoV-2 syntetisk RNA (N1) fra 1.000.000 genkopier / μL (cpμ) til 10.000 cpμ ved at tilsætte 10 μL stamopløsning til 990 μL nukleasefrit vand. Aliquot 25 μL af 10.000 cpμ i sterile 0,2 ml rør og mærk passende. Opbevar ubrugte aliquots ved -80 ° C. BEMÆRK: Syntetisk RNA skal opbevares ved -80 ° C for at forhindre nedbrydning.</li>
	<li>Fortynd Hs_RPP30 syntetisk DNA (P1) fra 200.000 cpμ til 10.000 cpμ ved at tilsætte 50 μL stamopløsning til 950 μL nukleasefrit vand. Aliquot 25 μL af 10.000 cpμ i sterile 0,2 ml rør og mærk passende. Opbevar ubrugte aliquots ved -80 ° C.</li>
	<li>Fortynd hver komponent til en endelig koncentration på 200 cpμ ved at tilsætte 20 μL af både SARS-CoV-2 og Hs_RPP30 10.000 cpμ-lagre til 960 μL nukleasefrit vand, i alt 1000 μL. Aliquot 20 μL blandet 200 cpμ positiv kontrol i 0,2 ml rør og mærk passende. Opbevar aliquots ved -80 °C, indtil de er klar til brug.</li>
</ol>4. Fremstilling af masterblandingsplader
BEMÆRK: Lav masterblanding i et sterilt miljø væk fra syntetisk SARS-CoV-2 RNA eller patientprøver. Alle komponenter skal optøes fuldstændigt, inden de tilsættes til blandingen; uden ordentlig optøning kan koncentrationerne være forkerte. Utilstrækkelig optøning er indikeret ved tilstedeværelsen af is eller ujævn farve af reagenser. Opbevares på en fryseblok, mens blandingen forberedes.
<ol><li>Forbered et parti multiplex master mix (samlet volumen på 48 ml, tabel 2) i et 50 ml konisk rør.</li>
	<li>Homogeniser blandingen ved at dreje røret over 3x. Bland ikke ved pipettering op og ned eller hvirvel, da dette vil beskadige enzymet.</li>
	<li>Fyld kolonner 1-4 i et sterilt 96-brønds dybt brøndreservoir ved at overføre 1,48 ml masterblanding til hver brønd. En 50 ml konisk fylder fire søjler, nok til 12 plader.</li>
	<li>Dæk det dybe brøndreservoir med en folieforsegling, og læg det i den dedikerede master mix væskehåndteringsrobot. Placer det fyldte dybe brøndreservoir på dæk 10, placer seks tomme 384-brøndsplader på dæk 1-6 og P20-tipboksen på dæk 11. Afdæk den dybe brøndplade og tipkasser, og luk robotten.</li>
	<li>Initialiser den brugerdefinerede Python-driftsprotokol ved at klikke på Start kørsel i robotskrivebordsprogrammet.</li>
	<li>Efter 40 minutter sættes løbet på pause. Dæk de fyldte 384 brøndplader med folietætninger, mens de forbliver i robotten, og tryk ned med rullen for at sikre vedhæftning. Mærk kanten af hver plade med en batchidentifikator.</li>
	<li>Placer seks nye tomme 384-brøndsplader på dæk 1-6, og genoptag driftsprotokollen ved at klikke på Genoptag kørsel. Når kørslen er afsluttet, skal du dække det endelige sæt 384 brøndplader med folieforseglinger.</li>
	<li>Pipette 2 μL af den resterende masterblanding i kolonne 1-3 og 22-24 på en tom plade med 384 brønde til batchkvalitetskontrol. Forsegl med en optisk klar tætning, og kør på termocyklisten (afsnit 10.1-10.2). Hvis brønde har N1-tærskelcyklusværdier (Ct), eller hvis mere end 10 brønde har P1 Ct-værdier, er batchen forurenet og kan ikke anvendes.</li>
	<li>De tilberedte masterblandingsplader opbevares ved 4 °C, og de anvendes senest 7 dage efter tilberedningen.</li>
</ol>5. Prøveindsamling, indtagelse og varmebehandling
<ol><li>Instruer deltagerne om at undgå at spise, drikke, ryge eller udføre tandhygiejne 30 minutter før spytopsamlingen. Instruer deltagerne om at indsamle mindst 1 ml spyt, der naturligt samler sig i munden og deponere det i et sterilt 50 ml konisk rør uden konserveringsmidler, og derefter dække røret (Supplerende fil 3).</li>
	<li>Dekontaminere ydersiden af spytopsamlingsrør med 70% ethanol eller desinfektionsservietter og overføre dem til laboratoriet til testning.</li>
	<li>Registrer prøveankomst ved at scanne hver prøvestregkode i regnearket til det daglige indtag (Supplerende fil 4).</li>
	<li>Varmebehandle de scannede prøver i 30 minutter i en ovn på 95 °C. Fjern prøverne, mens du bærer varmebestandige handsker. BEMÆRK: Ubehandlede prøver er stabile ved stuetemperatur (23 °C) i op til 72 timer. Når prøverne er varmebehandlet, skal de opbevares ved 4 °C, hvis de ikke behandles straks.</li>
</ol>6. Prøveopgave
<ol><li>Åbn de daglige regneark til indlæsning af eksempler for hver prøveindlæsningsrobot (Supplerende fil 5) på computeren på prøvetildelingsstationen.</li>
	<li>Tildel 188 prøver til hver 384-brøndplade som følger: Prøver 1-48 betragtes som kvartal 1, prøver 49-96 betragtes som kvartal 2, prøver 97-144 betragtes som kvartal 3, og prøver 145-188 betragtes som kvartal 4. Prøven analyseres i to eksemplarer.</li>
	<li>Etiketbakker med pladenavn, dato og kvartnummer. Scan prøverne i rækkefølge i regnearket til indlæsning af prøver. BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at køre prøver fra tidligere plader manuelt som defineret i figur 3. Se afsnit 8.1-8.3 for manuel prøvetildeling og ilægningsinstruktioner.</li>
</ol>7. Betjening af prøveindlæsningsrobotter
<ol><li>På prøvelæssestationen skal du stille to komplette sæt med otte 3D-printede stativer, der svarer til dæksplaceringen i robotten.</li>
	<li>Fjern hætte kvart 1 rør og læg dem i 3D-printede stativer, startende med position A1 i rack 1. Fyld hvert stativ fra venstre mod højre og top til bund. Fortsæt dette læssemønster i stativ 2, og fortsæt derefter til stativer 4 og 5 (se figur 2C). BEMÆRK: Racks er ikke nummereret fortløbende på grund af robotprogrammets parametre.</li>
	<li>Placer lastede kvart 1 prøvestativer på dæk 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Placer P20-spidser på dæk 3 og 9. For at forenkle opsætningsprocessen skal du lægge materialer fra bagside til front ind i robotten.</li>
	<li>Tag en færdiglavet masterblandingsplade fra 4 °C, mærk den med pladenavn, og brug et skarpt blad til at skære en linje i folien omkring kontrolbrøndene (N23/24, O23/24 og P23/24).</li>
	<li>Placer masterblandingspladen på dæk 6, og skræl foliedækslet væk, og efterlad det lille rektangel, der dækker kontrolbrøndene. Afdæk tipkasserne, og luk robotten.</li>
	<li>Initialiser den brugerdefinerede Python-driftsprotokol ved at klikke på Start kør gennem robotskrivebordsprogrammet. Hvert kvartal tager 24,5 minutter at indlæse på pladen; indstil en timer som en påmindelse.</li>
	<li>Mens robotten kører, skal du pakke 2. kvartals prøverør ud og læsse dem i det andet sæt 3D-printede stativer som beskrevet i afsnit 7.2.</li>
	<li>Når robotten holder pause, skal du fjerne 1. kvartals stativer og udskifte dem med kvart 2 stativer. Klik på Genoptag kørsel i skrivebordsprogrammet.</li>
	<li>Opsummering af 1. kvartals prøverør, og opbevar dem i et køleskab på 4 °C, mens du afventer resultaterne. Gentag denne indlæsningsproces for kvartal 3 og 4.</li>
	<li>Overfør den belastede plade til et biosikkerhedsskab. For at minimere forurening skal pladen holdes tildækket under overførslen.</li>
</ol>8. Manuel prøveindlæsning
BEMÆRK: Udfør en enkelt manuel kørsel på gentagne prøver (N1 Rerun eller Rerun, se figur 3) i tilfælde af utilstrækkelig robotbelastning.
<ol><li>Saml eventuelle gentagne prøver, og tildel dem som de sidste prøver i kvartal 4 (se pkt. 6.2). Nummerer eksempler, scan stregkoderne, og indtast den oprindelige prøveplacering og resultatet i regnearket til indlæsning af eksempler.</li>
	<li>Overfør gentagne prøver til biosikkerhedsskabet. Læg ikke gentagne prøverør i robottens ilægningsstativer.</li>
	<li>Pipette 2 μL af hver gentagelsesprøve til de korrekte brønde efter pladelayoutdiagrammet (Supplerende fil 6). Brug en udpeget pipette til tilsætning af patientprøver. Hold kontrolbrønde dækket med folie, mens du tilføjer prøver for at minimere forurening.</li>
</ol>9. Tilføjelse af betjeningsanordninger til prøveplader
<ol><li>Skræl foliedækslet væk over kontrolbrønde ved hjælp af tang.</li>
	<li>Pipette 2 μL nukleasefrit vand (ingen skabelonkontrol) til brønde N23-N24 og 2 μL af 200 cpμ blandet positiv kontrol (se punkt 3) til brønde O23-O24. Pipette 2 μL af en bekræftet positiv patientprøvekontrol i brønde M23-M24 som en yderligere kontrol. Lad brøndene P23-P24 være tomme for at overvåge batchkvaliteten af mastermixet.</li>
	<li>Dæk pladen med en optisk klar tætning, og brug applikatorrullen til at klæbe tætning til alle brønde. Vortex pladen ved 2500 o / min i 30 sek for at blande grundigt. Centrifugering af pladen ved 500 x g i 1 min.</li>
</ol>10. Udførelse af RT-qPCR
<ol><li>Opret et protokolprogram i termocyklistsoftwaren i henhold til de beskrevne betingelser (tabel 3). Gem protokollen til fremtidige plader. Anbring den forseglede plade i termocyklisten, og kør protokollen.</li>
	<li>Eksporter Ct-værdier som en .xslx-fil, og kopiér værdierne til regnearket til indlæsning af eksempler (Supplerende fil 5). BEMÆRK: Disse ark blev specialdesignet til Ct-outputfiler fra producentens software og skal muligvis ændres for at acceptere andre formater.</li>
</ol>11. Bestemmelse af pladens gyldighed
<ol><li>Valider både den positive kontrol og/eller kendte positive prøver og den negative kontrol for at betragte pladeresultaterne som gyldige. Vurder kontrolbrøndene med følgende kriterier.<ol>
<li>For positiv kontrol skal du kontrollere, om mindst en positiv kontrolbrønde (O23 / O24) producerer Ct-værdier på mellem 22-28 for både P1- og N1-sonder. Alternativt producerer de kendte positive prøvebrønde (M23/M24) P1- og N1 Ct-værdier <33 på P1- og N1-sonderne.</li>
		<li>For negativ kontrol skal du kontrollere, at der ikke er N1- eller P1 Ct-værdier i nogen af de to negative kontrolbrønde (N23/N24). Bekræft, at Ct-værdier har gyldige forstærkningskurver, før du ugyldiggør pladen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Fortolkning af prøveresultater
<ol><li>Bestem patientresultatet efter diagrammet (figur 3), og rapporter løste prøver.<ol>
<li>Vurder P1-resultatet som GYLDIGT eller UGYLDIGT. Hvis P1 giver et resultat af Ct <33, skal du overveje brønden GYLDIG og fortsætte med at følge af N1. Hvis P1 giver et resultat af Ct-> = 33 eller ingen Ct-værdi, skal du betragte brønden som UGYLDIG.<ol>
<li>Vurder N1-resultatet som JA, NEJ eller NEJ*. Hvis N1 giver et resultat af Ct <33, er brønden JA. Hvis N1 ikke producerer en Ct-værdi, er brønden NEJ. Hvis N1 producerer en Ct > = 33, er brønden NEJ *. Bekræft, at alle N1 Ct-værdier er forbundet med en reel forstærkningskurve. Hvis en Ct-værdi for N1 ikke har nogen forstærkningskurve, er brønden NEJ.</li>
			<li>Identificer gentagne prøver (N1 Rerun eller Rerun), mærk dem med et internt prøvenummer og prøvetype, og returner dem til indlæsningsarbejdsgangen (afsnit 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laboratorieoprydning
<ol><li>Robotter til væskehåndtering<ol>
<li>Rengør alle sider med desinfektionsmiddel på mellemniveau. Brug ikke ethanol, da det vil nedbryde plasten.</li>
		<li>Tør forsigtigt pipettespidsenden og affaldsbeholderen af med en aftørring af alkohol (70 % ethanol eller 100 % isopropanol). Tør tastaturet og musen af.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biosikkerhedsskab<ol>
<li>Rengør alle overflader med desinfektionsmiddel på mellemniveau. Tænd FOR UV-lyset i 15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre. Det assay, der er beskrevet i protokollen, falder ind under SalivaDirect EUA indgivet af Yale School of Public Health.

Det assay, der er beskrevet i protokollen, blev vurderet ved en uafhængig valideringsundersøgelse. Det blev konstateret, at assayet havde 98,9% specificitet (1,1% falsk positiv) og 90,0% følsomhed (10,0% falsk negativ), når den blev evalueret mod parrede nasopharyngeale vatpinde taget på samme tid (n = 837; 817 negative, 20 positive). Det er vigtigt, at tre deltagere, der testede positivt med TigerSaliva og negativ med en nasopharyngeal vatpind, blev testet igen med vatpinde 48 timer senere og returnerede positive resultater, hvilket indikerer, at TigerSaliva muligvis kan opdage SARS-CoV-2-infektioner tidligere i sygdomsforløbet.
Vi simulerede positive spytprøver ved at spiking virusfri spyt (både varmebehandlet og ikke-varmebehandlet) med kendte koncentrationer af SARS-CoV-2 syntetisk RNA og udførte en 10 gange fortynding for at bestemme Ct-grænsen i spyt. N1-genet kunne ikke påvises under 10.000 genkopier (ca. Ct = 28) i simulerede positive prøver. Vi formoder, at dette skyldes RNase-nedbrydning eller andre forvirrende faktorer. Imidlertid er interaktionen mellem spyt RNases og nøgen syntetisk RNA sandsynligvis forskellig fra interaktionen med virale partikler, selv efter at de er blevet denatureret af varme. Positive spytprøver er blevet identificeret med Ct >30, og eksterne laboratorier opnåede SARS-CoV-2 genetiske sekvensdata fra disse prøver. Vi spekulerer i, at de virale proteiner giver beskyttelse mod RNA-nedbrydning i patientens spytprøver.
Det mest kritiske trin i protokollen er implementeringen af automatisering til master mix forberedelse og spyt prøve behandling (henholdsvis afsnit 4 og 7). Dette giver mulighed for overlappende opgaveprocesser, hvilket drastisk reducerer ekspeditionstiden. Et andet kritisk trin er klinisk resultatfortolkning (§§ 11 og 12). Etablering af mellemliggende resultatkategorier (Rerun og N1 Rerun) minimerede også forekomsten af ufattelige testresultater.
Vi påviste, at variationen mellem manuelle og automatiserede metoder til indlæsning af spytprøver er ubetydelig (figur 5A), og at automatisering kan forbedre reproducerbarheden af SARS-CoV-2-detektion (figur 5B). Automatisering bør foretrækkes for at lette testning, når kliniske laboratorier designes og udvides25. Laboratoriearbejdsgangen forbedres med implementeringen af robotautomatiserede opgaver26. Open source-funktioner i væskehåndteringsrobotterne giver mulighed for implementering af brugerdefineret scripting til protokoldesign. Dette gør væskehåndteringsrobotter til et billigt og meget modificerbart system sammenlignet med traditionelle kliniske automatiseringsmetoder. Det er også en ideel strategi til udførelse af meget gentagne laboratorieopgaver. Systemets høje tilpasningsevne betyder frihed til at ændre labware (f.eks. Opsamlingsrør, pipettespidser eller plader med 384 brønde) i tilfælde af mangel. Derfor er automatisering ved hjælp af væskehåndteringsrobotter levedygtig til både overvågning og forskning i stor og lille skala.
En stor fordel ved denne teststrategi er en meget kortere ekspeditionstid i forhold til andre kliniske laboratorier. Brugen af automatiserede væskehåndteringsrobotter spiller en nøglerolle i at reducere ekspeditionstiden, men samtidig brug af robotter og termocyklister er også medvirkende til at maksimere testeffektiviteten. En robot og termocyklist skal betjenes som et par, hvor begge maskiner bruges sammen til uafbrudt prøvebelastning og analyse af prøveresultat. Når en jævn strøm af tildelte prøver er etableret, kan alle maskinpar betjenes samtidigt. Konstant samtidig brug af robotter og termocyklister øger testkapaciteten og effektiviteten drastisk, hvilket er afgørende for at imødekomme den høje testvolumen.
I modsætning til andre etablerede SARS-CoV-2 RT-qPCR-protokoller inkluderede vi et touchdown-trin i termocyklistprotokollen for at forbedre udglødningen af sonden og primersættene til målgenerne27, hvilket reducerede risikoen for mislykket forstærkning. Resultaterne viste, at touchdown forbedrede påvisningen af positive prøver uden at risikere tab af specifik primerbinding (tabel 4). Vi fastslog, at en bred vifte af både SARS-CoV-2 RNA-kopier (figur 4A) og Hs_RPP30 DNA-kopier (figur 4B) kan detekteres samtidigt ved RT-qPCR-assay.
En begrænsning af væskehåndteringsrobotter er muligheden for krydskontaminering fra positive prøver under spytoverførsel. Spyt er en viskoelastisk væske28 og kan snøre sig på tværs af tilstødende brønde efter at være blevet dispenseret fra pipettespidsen. Desuden kan heterogeniteten af spyt29 forårsage ujævn fordeling af virale partikler i hele prøven. Dette øger muligheden for både falske positive og negative, hvilket nødvendiggør udpegning af N1 Rerun- og Rerun-prøver. Imidlertid forsvandt 14,1% af prøverne, der oprindeligt blev udpeget som N1 Rerun, som positive for SARS-CoV-2 og var mere end 30 gange mere tilbøjelige end Rerun-prøver til at løse som positive efter gentestning. Derfor gav differentiering af Rerun fra N1 Rerun (figur 3) mulighed for mere nøjagtig adskillelse af potentielt positive prøver, hvilket øgede følsomheden og specificiteten af vores diagnostiske assay. Andre resulterende parametre til diagnostisk spyttest gjorde ikke denne sondring12,14,24,30,31.
Spytprøver kan være vanskelige at pipette på grund af heterogenitet og viskositet32. Varmebehandling denaturerer proteiner i spytbiomatrixen tilstrækkeligt, reducerer viskositeten og eliminerer behovet for RNA-ekstraktionsreagenser9, som var knappe i de tidlige stadier af pandemien10. Udvidet varmebehandling inaktiverer også tilstedeværende vira33, hvilket giver mulighed for laboratoriebehandling ved lavere biosikkerhedsniveauer. Følgelig blev en varmebaseret RNA-ekstraktion (beskrevet i pkt. 5.4) implementeret for at reducere viskositeten gennem proteindenaturering (figur 6). Baseret på resultaterne postulerer vi, at varmebehandling også kan homogenisere spytprøver ud over at denaturere proteinbiomatrixen. Andre grupper kombinerede varmebehandling og proteinase K-behandling for at øge homogeniteten9,14,34. Vi valgte ikke at implementere dette trin, da det kan denaturere virionproteiner med en hastighed, der efterlader viralt RNA udsat for varmenedbrydning35. Desuden kan prøvefortynding med proteinase K maskere positive prøver, der indeholder færre virale partikler, hvilket reducerer følsomheden. Derudover blev analyseresultaterne sammenlignet med et kommercielt tilgængeligt spytbaseret SARS-CoV-2-assay (Logix Smart COVID-19), der bruger magnetisk perle-RNA-ekstraktion (tabel 5). Det blev konstateret, at det nuværende assay var bedre egnet til at påvise svage positive prøver sammenlignet med det kommercielt tilgængelige assay.
Det er vanskeligt at kvantificere viruskopinummer i spyt ved kun at bruge RT-qPCR, fordi qPCR er semikvantitært. Der er iboende variation mellem Ct-værdier, der stammer fra tekniske begrænsninger. Genkopinummer kan bestemmes ud fra Ct-værdier (figur 4) og svarer nogenlunde til viralt kopinummer. En mulig løsning til at bestemme det virale kopinummer i spytprøver er ddPCR, som giver hård kvantificering af genkopier i reaktionen. Vi mener dog, at det er tilstrækkeligt at levere kvalitative resultater til klinikere, og relativt viralt indhold kan sammenlignes på tværs af prøver, der behandles med vores metoder.
På trods af nogle begrænsninger, der opstår ved brug af spyt, viser SARS-CoV-2-assayet ved spytbaseret RT-qPCR sig at være en effektiv metode til hurtig og pålidelig viral RNA-detektion på enhver testskala. Dette gælder især, når det kombineres med brugen af open source væskehåndteringssystemer. Denne testmetode kan ændres for at detektere andre nukleinsyresekvenser, der er relevante for diagnostik, såsom infektionssygdomsmidler, sygdomsmarkører eller andre vira. Dette gør analysen anvendelig til både klinisk og forskningsdiagnostisk indsats.

Alvorlig akut respiratorisk syndrom-associeret coronavirus-2 (SARS-CoV-2), en ny coronavirus, opstod i slutningen af 2019 og spredte sig hurtigt i hele den globale befolkning1. SARS-CoV-2-infektionen forårsager coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), en meget smitsom sygdom med potentielt alvorlige respiratoriske og inflammatoriske symptomer. Høj overførbarhed kombineret med lav dødelighed indikerede, at virusset ville sprede sig hurtigt gennem populationer og ville kræve øget diagnostisk testning2,3. Folkesundhedsanbefalinger tilskyndede til omfattende befolkningsscreening for at isolere tilfælde og efterfølgende reducere transmissionshastighederne4,5,6. Desuden viste modeller for befolkningsovervågning, at øget testfrekvens og faldende rapporteringstid havde en større effekt på at reducere transmissionen end at øge testfølsomheden7. Dette skyldes sandsynligvis, at inficerede personer kunne blive sat i karantæne tidligere og derved bryde smittekæder.
Den oprindelige nukleinsyreamplifikationstest (NAAT) standard var nasopharyngeal (NP) vatpinde behandlet af RT-qPCR8. Der opstår imidlertid komplikationer med denne form for testning for meget store populationer, såsom øgede relative omkostninger og forværret pres i forsyningskæden9,10. Desuden er både prøveindsamling og behandling af almindelige NAAT-metoder (herunder NP-vatpinde, orofaryngeale vatpinde, mid-turbinatpinde og næsepinde) afhængige af specialudstyr, reagenser og medicinsk personale9,10.
En passende erstatning for NP-vatpind RT-qPCR-test er spytbaseret test, som er et nøjagtigt diagnostisk værktøj til SARS-CoV-2-detektion11,12,13,14. Direkte udførelse af RT-qPCR på spytprøver giver samme følsomhed og specificitet som NP-vatpinde15. En stor fordel, som spyttest har i forhold til NP-vatpindstest, er, at det giver mulighed for selvindsamling af prøver16. Dette minimerer behovet for medicinsk personale og maksimerer let prøveindsamling for patienter ved at være mindre invasiv end NP-vatpinde. Da spytprøver ikke kræver buffere for at fjerne prøven fra en vatpind (som i tilfældet med NP-prøver), kan spytbaserede tests desuden anvende varmebaseret ribonukleinsyre (RNA) ekstraktion direkte, hvilket reducerer testomkostningerne ved at fjerne behovet for yderligere buffere, transportmedier og / eller RNA-ekstraktionsreagenser14,17.
Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab blev oprettet for at imødekomme universitetets behov for COVID-19-test og overvågning. I lukkede befolkninger, herunder universiteter, gav hyppige overvågningstest kombineret med social afstand de mest gunstige resultater i epidemiologiske modeller for sygdomsprævalens18. De konsoliderede CDC 2019-nCOV RT-qPCR19- og SalivaDirect14-protokoller blev tilpasset, og automatisering blev brugt i den kliniske arbejdsgang til at reducere omkostningerne og forbedre leveringstiden. Tidligere grupper havde brugt open source væskehåndteringsrobotter til SARS-CoV-2 RNA-ekstraktionstrin20,21, men vi maksimerede brugen af robotterne til at forberede testplader og belastningsprøver22. Her viser vi, at den tilpassede protokol og brugen af open source væskehåndteringssystemer (figur 1) giver mulighed for hurtig og præcis spytbaseret RT-qPCR og er en effektiv strategi for storstilet folkesundhedsovervågning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

Fremkomsten af den nylige globale sundhedskrise sars-CoV-2 introducerede centrale udfordringer for epidemiologisk forskning og klinisk testning. Karakteriseret ved en høj transmissionshastighed og lav dødelighed nødvendiggjorde COVID-19-pandemien nøjagtig og effektiv diagnostisk test, især i lukkede befolkninger såsom boliguniversiteter. Den første tilgængelighed af nukleinsyretest, som nasopharyngeal vatpinde, var begrænset på grund af forsyningskædetrykket, hvilket også forsinkede rapporteringen af testresultater. Spytbaseret omvendt transkriptase kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) test har vist sig at være sammenlignelig i følsomhed og specificitet med andre testmetoder, og spytopsamling er mindre fysisk invasiv for deltagerne. Derfor udviklede vi et multiplex RT-qPCR diagnostisk assay til befolkningsovervågning af Clemson University og det omkringliggende samfund. Assayet anvendte open source væskehåndteringsrobotter og termocyklister i stedet for komplekse kliniske automatiseringssystemer for at optimere arbejdsgangen og systemfleksibiliteten. Automatisering af spytbaseret RT-qPCR muliggør hurtig og nøjagtig detektion af en lang række virale RNA-koncentrationer til både store og små testkrav. Den gennemsnitlige turnaround for det automatiserede system var < 9 timer for 95% af prøverne og < 24 timer for 99% af prøverne. Omkostningerne ved en enkelt test var $ 2,80, da alle reagenser blev købt i bulkmængder.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Protokollen beskriver en SARS-CoV-2 diagnostisk metode, der bruger open source-automatisering til at udføre RT-qPCR molekylær test af spytprøver. Denne skalerbare tilgang kan anvendes til klinisk folkesundhedsovervågning samt til at øge kapaciteten i mindre universitetslaboratorier.

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkriptase PCR spytdiagnostisk strategi ved hjælp af open source pipetteringsrobotter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Vi har udviklet en billig, spytbaseret COVID 19-diagnostiktest og -arbejdsgang, der er nem at implementere og skalere op til store samfundsscreeningsapplikationer. Her bruger vi open source væskehåndteringsrobotter, standard termocyklister og software til at udføre direkte test af spyt uden ekstraktions- eller stabiliseringsbuffere, mens vi stadig giver nøjagtige diagnostiske resultater. På grund af de enkle automatiserede parallelle arbejdsgange kan systemet skaleres op til at udføre tusindvis af tests dagligt med minimale krav til udstyr, plads og personale.Ud over Kylie King vil Rachel Ham, vores kliniske laboratorievejleder og Austin Smothers vores uddannelseskoordinator, hjælpe med at demonstrere proceduren Begynd med at dekontaminere ydersiden af spytopsamlingsrørene med 70% ethanol og overføre dem til laboratoriet til test. Registrer prøveankomsten ved at scanne hver prøvestregkode i regnearket med det daglige indtag. Varmbehandle scanningsprøverne i 30 minutter i en ovn på 95 grader Celsius, og fjern derefter prøverne ved hjælp af varmebestandige handsker.Åbn de daglige regneark til prøveindlæsning for hver prøveindlæsningsrobot på prøvetildelingsstationen. Tildel derefter 188 prøver til hver 384 brøndplade. Etiketbakker med pladenavn, dato og kvartalsnummer.Scan prøverne i rækkefølge i regnearket til indlæsning af prøver. På prøvelæssestationen skal du stille to fulde sæt med otte 3D-printede stativer op, svarende til dækplaceringen i robotten. Fjern hætten kvart et rør og læg dem i 3D-trykte stativer, startende med position A1 i rack et.Fyld hvert stativ fra venstre mod højre og top til bund. Fortsæt dette lastemønster i rack to, og fortsæt derefter til stativer fire og fem. Placer lastede kvart et prøvestativer på dæk et, to, fire, fem, syv, otte, 10, 11.Placer P20-spidser på dæk tre og ni. For at forenkle installationsprocessen skal du indlæse materialer fra bagsiden til forsiden i robotten. Master mixpladerne produceres på en dedikeret robot og opbevares ved fire grader Celsius.En plade bruges ad gangen og er mærket med pladenavn, og et skarpt blad bruges til at skære en linje i folien omkring kontrolbrøndene. Placer masterblandingspladen på dæk seks, og skræl foliedækslet væk, og efterlad det lille rektangel, der dækker kontrolbrøndene. Afdæk tipkasserne, og luk robotten.Initialiser den brugerdefinerede Python-driftsprotokol ved at klikke på Start kørsel gennem robotskrivebordsprogrammet. Hvert kvartal tager 24,5 minutter at lægge på pladen. Indstil en timer som en påmindelse.Mens robotten kører, skal du pakke og indlæse kvart to prøverør i det andet sæt 3D-trykte stativer. Når robotten holder pause, skal du fjerne de kvarte stativer og udskifte dem med de to kvarte stativer og derefter klikke på Genoptag kørsel i desktop-applikationen. Opsummering af et kvartal af et prøverør og opbevar dem i et køleskab på fire grader Celsius, mens du afventer resultaterne.Gentag denne indlæsningsproces i kvartal tre og fire. Overfør den belastede plade til et biosikkerhedsskab. For at minimere forurening skal du holde pladen dækket under overførslen.Saml eventuelle gentagne prøver, og tildel dem som de sidste prøver i fjerde kvartal. Nummerer prøverne, scan stregkoderne, og indtast den oprindelige prøveplacering og resultatet i regnearket til indlæsning af prøver. Overfør gentagelsesprøverne til biosikkerhedsskabet.Læg ikke de gentagne prøverør i robottens læssestativer. Pipette to mikroliter af hver gentagelsesprøve til de korrekte brønde. Brug den udpegede pipette til tilsætning af patientprøver.Hold kontrolbrøndene dækket af folie, mens du tilføjer prøver for at minimere forurening. Skræl foliedækslet væk over kontrolbrønde ved hjælp af tang. Pipette to mikroliter bekræftede positive patientprøver i brønde M23 og M24.Pipette to mikroliter nukleasefrit vand til brønde N23 til N24 og to mikroliter på 200 kopier pr. mikroliter blandet positiv kontrol til brønde O23 til O24. Lad brønde P23 til P24 være tomme for at overvåge batchkvaliteten af mastermixet. Dæk pladen med en optisk klar tætning, og brug applikatorrullen til at klæbe tætning til alle brønde.Hvirvel pladen ved 2.500 o / min i 30 sekunder for at blande grundigt, og centrifuger derefter pladen ved 500 gange G i et minut. Vælg protokolprogrammet i termocyklistsoftwaren, og gem protokollen til fremtidige plader. Anbring den forseglede plade i termocyklisten, og kør protokollen.Eksporter CT-værdier, og kopiér værdierne til regnearket til indlæsning af eksempler. For positiv kontrol skal du kontrollere, om mindst en positiv kontrolbrønde producerer CT-værdier mellem 22 og 28 for både P1- og N1-sonder. Alternativt producerer de kendte positive prøvebrønde P1 og N1 CT-værdier mindre end 33 på P1- og N1-sonderne.For negativ kontrol skal du kontrollere, at der ikke er N1- eller P1 CT-værdier i nogen af de to negative kontrolbrønde. Bekræft, at CT-værdier har gyldige forstærkningskurver, før du ugyldiggør pladen. Hvis P1 giver et resultat af CT mindre end 33, skal du betragte brønden som gyldig og fortsætte med at være resultatet af N1. Hvis P1 producerer et resultat af CT, der er større end eller lig med 33 eller ingen CT-værdi, skal du betragte brønden som ugyldig.Hvis N1 giver et resultat af CT mindre end 33, skal du vurdere brønden som ja. Hvis N1 ikke producerer en CT-værdi, skal du vurdere brønden som nej. Hvis N1 producerer en CT-værdi, der er større end eller lig med 33, skal du vurdere brønden som ingen stjerne.Bekræft, at alle N1 CT-værdier er forbundet med en reel forstærkningskurve. Hvis en CT-værdi for N1 ikke har nogen forstærkningskurve, er brønden nej. Identificer gentagelsesprøverne, mærk dem med et internt prøvenummer og eksempeltype, og returner dem til indlæsningsarbejdsgangen.De repræsentative billeder viser RTQ PCR-påvisning af N1 eller SARS CoV-2 syntetisk RNA og P1 eller HSRPP30 syntetisk DNA. Standardkurver blev afbildet med standardafvigelser for at bestemme rækkevidden af nøjagtig detektion ved hjælp af denne sondeprimerkombination. De gennemsnitlige CT-værdier opnået i respektive fortyndinger blev plottet mod den estimerede mængde syntetisk RNA og syntetisk DNA.I begge tilfælde viste de lineære kurver gode korrelationskoefficienter på tværs af en lang række genkopikoncentrationer. N1 CT-værdier opnået fra unikke prøver ved hjælp af både robotten og manuel prøvebelastning blev transponeret for at bestemme interassay-variabiliteten mellem manuel og robotbelastning. Det lineære forhold mellem de manuelle og automatiserede metoder frembragte en høj korrelationskoefficient, der indikerer, at begge metoder er funktionelt ækvivalente.Intra assay variabilitet blev også bestemt ved hjælp af transponerede repliktive N1 CT-værdier opnået fra både robotten og manuel prøveindlæsning. Evaluering af varmebehandlingsmetoder til viskositetsreduktion i spyt er vist her. SARS CoV-2 negativ spyt blev indsamlet fra en enkelt kilde, og alikvoter blev varmebehandlet i enten nul minutter, 30 minutter eller 60 minutter ved 95 grader Celsius.P1 CT-værdier fra tekniske replikater af hver tilstand blev plottet for at bestemme variabiliteten mellem behandlingsmetoderne. Både 30 minutter og 60 minutters varmebehandlingsmetoder gav signifikant nedsat prøvevariation sammenlignet med ingen behandlingskontrol. Der var ingen signifikant forskel mellem 30 minutters og 60 minutters behandlinger.Derfor blev 30 minutters varmebehandlingsmetoden implementeret for at reducere behandlingstiden. Brug korrekt aseptisk teknik for at minimere forurening af testpladerne, især ved ilægning af manuelle prøver og kontroller. Undgå at krydse pladen med dine hænder eller ærmer.Efter at kliniske resultater er produceret, kan prøver bortskaffes i biofarligt affald, eller de kan gemmes til yderligere analyse, såsom helgenomsekventering for at bestemme specifikke stammer. Denne teknik tillader bredt samfundstest, som giver os mulighed for at undersøge virkningerne af testdækning og den ikke-symptomatiske spredning af Covid 19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hurtig screening af HIV revers transkriptase og Integrase hæmmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Udnytte den Antigen capsidet-Indbygning strategi for udvikling af adenovirusserotype 5-vektoriserede Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput Påvisning af respiratoriske patogener i Animal Prøver af Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR af T7 Bacteriophage fra Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisning af SARS-CoV-2 neutraliserende antistoffer ved hjælp af fluorescerende billeddannelse af pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En hurtig, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 neutralisering Assay for en multiplexed perle-baseret Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning af SARS-CoV-2 receptorbindende domæneantistof ved hjælp af en HiBiT-baseret bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...