Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

De auteurs bedanken Clemson's administratie, medisch personeel en klinische laboratoriummedewerkers in het REDDI Lab die hebben geholpen bij het implementeren en beheren van SARS-CoV-2-tests. We bedanken Dr. Phillip Buckhaults en Dr. Carolyn Bannister van de Universiteit van South Carolina voor het eerste projectadvies en de contacten met de industrie voor de aanschaf van apparatuur. We bedanken veel studenten, professoren en medewerkers voor hun hulp bij het verzamelen van monsters. Bedankt aan Creative Inquiry-studenten voor het verzamelen van standaardcurvegegevens. Financiering voor deze studie werd ontvangen van de National Institutes of Health-subsidie P20GM121342 (toegekend aan DD en LGP), Clemson Athletic Department, Clemson University's Vice President for Research en de South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee.

Al het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met Clemson University en Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 juli 2020).
1. Installatie van open-source vloeistofbehandelingsrobot
<ol><li>Installeer hoogrenderende deeltjeslucht (HEPA) filtermodules (zie Tabel met materialen) aan de bovenkant van elke vloeistofbehandelingsrobot volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Bevestig een 8-kanaals P20-pipet aan de linkerkant van de master mix plate voorbereidingsrobot(s) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Bevestig een P20-pipet aan de rechterbevestiging van de monsterbeladingsrobot(s) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Download de aangepaste Python-scripts (Supplemental File 1 en Supplemental File 2) op de juiste computers.</li>
	<li>Open TigerSaliva Full 384 Loading.py in de desktopapplicatie bij de monsterbeladingsrobotcomputers. Klik op Kalibreren en stel zowel de pipet als het programma in volgens de aanwijzingen van de software.</li>
	<li>Open 12 Full Plates.py in de desktopapplicatie op de master mix robotcomputer. Klik op Kalibreren en stel zowel de pipet als het programma in volgens de aanwijzingen van de software.</li>
	<li>Print aangepaste voorbeeldrekken met een gesmolten depositiemodellering driedimensionale (3D) printer met behulp van een CAD-bestand (computer-aided design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Print 16 racks per monsterbeladingsrobot, voor twee sets van acht racks.</li>
</ol>2. Bereiding van 20x multiplex N1+P1 sonde/primer mix
<ol><li>Bereid een batch van 20x multiplex N1+P1 sonde/primer mix (totaal volume van 20 ml, tabel 1) in een conische buis van 50 ml in een steriele omgeving uit de buurt van synthetisch SARS-CoV-2 RNA of patiëntmonsters.</li>
	<li>Aliquot 1,6 ml van het mengsel met behulp van een serologische pipet in steriele centrifugebuizen van 2,0 ml en etiketteer op de juiste manier.</li>
	<li>Bewaar aliquots in een vriezer van -20 °C tot ze klaar zijn voor gebruik.</li>
</ol>3. Bereiding van een positieve controlemix
OPMERKING: Positieve controlemix mag niet in dezelfde steriele omgeving worden gemaakt als sonde/primermengsel of andere mastermixcomponenten. Een aparte container met nucleasevrij water moet worden gebruikt.
<ol><li>Verdun SARS-CoV-2 synthetisch RNA (N1) van 1.000.000 genkopieën/μL (cpμ) tot 10.000 cpμ door 10 μL stockoplossing toe te voegen aan 990 μL nucleasevrij water. Aliquot 25 μL van 10.000 cpμ in steriele 0,2 ml buizen en etiketteer op de juiste manier. Bewaar ongebruikte aliquots bij -80°C. OPMERKING: Synthetisch RNA moet worden opgeslagen bij -80 °C om afbraak te voorkomen.</li>
	<li>Verdun Hs_RPP30 synthetisch DNA (P1) van 200.000 cpμ tot 10.000 cpμ door 50 μL stamoplossing toe te voegen aan 950 μL nucleasevrij water. Aliquot 25 μL van 10.000 cpμ in steriele 0,2 ml buizen en etiketteer op de juiste manier. Bewaar ongebruikte aliquots bij -80°C.</li>
	<li>Verdun elk bestanddeel tot een eindconcentratie van 200 cpμ door 20 μL sars-cov-2 en Hs_RPP30 10.000 cpμ-voorraden toe te voegen aan 960 μl nucleasevrij water, voor een totaal van 1000 μl. Aliquot 20 μl gemengde 200 cpμ positieve controle in 0,2 ml buizen en label op de juiste manier. Bewaar aliquots bij -80°C tot ze klaar zijn voor gebruik.</li>
</ol>4. Bereiding van master mixplaten
OPMERKING: Maak mastermix in een steriele omgeving uit de buurt van synthetisch SARS-CoV-2-RNA of patiëntmonsters. Alle componenten moeten volledig worden ontdooid voordat ze aan het mengsel worden toegevoegd; zonder goede ontdooiing kunnen de concentraties onjuist zijn. Onvoldoende ontdooien wordt aangegeven door de aanwezigheid van ijs of ongelijke kleur van reagentia. Bewaren op een diepvriesblok tijdens het bereiden van het mengsel.
<ol><li>Bereid een partij multiplex master mix (totaal volume van 48 ml, tabel 2) in een conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Homogeniseer het mengsel door de buis 3x om te draaien. Meng niet door op en neer te pipetteren of te vortexen, omdat dit het enzym zal beschadigen.</li>
	<li>Vul kolommen 1-4 van een steriel 96-well diep putreservoir door 1,48 ml mastermix in elke put over te brengen. Eén conisch van 50 ml vult vier kolommen, genoeg voor 12 platen.</li>
	<li>Bedek het diepe putreservoir met een folieafdichting en plaats het in de speciale master mix vloeistofbehandelingsrobot. Plaats het gevulde diepe putreservoir op dek 10, plaats zes lege 384-putplaten op dekken 1-6 en de P20-tipbox op dek 11. Leg de diepe putplaat en tipboxen bloot en sluit de robot.</li>
	<li>Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Uitvoeren starten in de robotdesktoptoepassing.</li>
	<li>Na 40 minuten wordt de run gepauzeerd. Bedek de gevulde 384 putplaten met folieafdichtingen terwijl ze in de robot blijven en druk met de rol naar beneden om hechting te garanderen. Label de rand van elke plaat met een batch-id.</li>
	<li>Plaats zes nieuwe lege 384-putplaten op dekken 1-6 en hervat het bedieningsprotocol door op Hervatten uitvoeren te klikken. Nadat de run is voltooid, bedek je de laatste set van 384 putplaten met folieafdichtingen.</li>
	<li>Pipetteer 2 μL van het resterende mastermengsel in kolommen 1-3 en 22-24 van een lege 384-well plaat voor batchkwaliteitscontrole. Sluit af met een optisch heldere afdichting en voer uit op de thermocycler (sectie 10.1-10.2). Als putten N1-drempelwaarden (Ct) hebben of als meer dan 10 putten P1 Ct-waarden hebben, is de batch verontreinigd en kan deze niet worden gebruikt.</li>
	<li>Bewaar de bereide hoofdmengplaten bij 4 °C en gebruik ze binnen 7 dagen na bereiding.</li>
</ol>5. Monsterverzameling, inname en warmtebehandeling
<ol><li>Instrueer deelnemers om 30 minuten voorafgaand aan de speekselverzameling te voorkomen dat ze eten, drinken, roken of mondhygiëne uitvoeren. Instrueer deelnemers om ten minste 1 ml speeksel te verzamelen dat zich van nature in de mond verzamelt en het in een steriele conische buis van 50 ml zonder conserveermiddelen deponeert en vervolgens de buis afdekt (aanvullend bestand 3).</li>
	<li>Ontsmet de buitenkant van speekselopvangbuizen met 70% ethanol of desinfecterende doekjes en breng ze over naar het laboratorium om te testen.</li>
	<li>Registreer de aankomst van het monster door elke voorbeeldwebcode te scannen in de spreadsheet voor dagelijkse inname (aanvullend bestand 4).</li>
	<li>Verwarm de gescande monsters gedurende 30 minuten in een oven van 95 °C. Verwijder monsters terwijl u hittebestendige handschoenen draagt. OPMERKING: Onbehandelde monsters zijn stabiel bij kamertemperatuur (23 °C) gedurende maximaal 72 uur. Na een warmtebehandeling moeten de monsters bij 4 °C worden opgeslagen, indien zij niet onmiddellijk worden verwerkt.</li>
</ol>6. Voorbeeldtoewijzing
<ol><li>Open de spreadsheets voor het dagelijks laden van monsters voor elke robot voor het laden van monsters (aanvullend bestand 5) op de computer op het monstertoewijzingsstation.</li>
	<li>Wijs als volgt 188 monsters toe aan elke 384-putplaat: Monsters 1-48 worden beschouwd als kwartaal 1, monsters 49-96 worden beschouwd als kwartaal 2, monsters 97-144 worden beschouwd als kwartaal 3 en monsters 145-188 worden beschouwd als kwartaal 4. Monsters worden in tweevoud geanalyseerd.</li>
	<li>Etiketteer trays met plaatnaam, datum en kwartnummer. Scan de monsters in volgorde in de spreadsheet voor het laden van monsters. OPMERKING: Monsters van eerdere platen moeten mogelijk handmatig worden uitgevoerd, zoals gedefinieerd in figuur 3. Raadpleeg de rubrieken 8.1-8.3 voor handmatige monstertoewijzing en laadinstructies.</li>
</ol>7. Het bedienen van monsterbeladingsrobots
<ol><li>Zet bij het monsterlaadstation twee volledige sets van acht 3D-geprinte rekken op een rij die overeenkomen met de plaatsing van het dek in de robot.</li>
	<li>Ontdoe kwart 1 buizen en plaats in 3D geprinte rekken, te beginnen met positie A1 in rek 1. Vul elk rek van links naar rechts en van boven naar beneden. Ga verder met dit laadpatroon in rack 2 en ga vervolgens naar racks 4 en 5 (zie figuur 2C). OPMERKING: Racks worden niet achter elkaar genummerd vanwege de parameters van het robotprogramma.</li>
	<li>Plaats geladen kwart 1 monsterrekken op dekken 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Plaats P20 tips op decks 3 en 9. Om het installatieproces te vereenvoudigen, laadt u materialen van achter naar voren in de robot.</li>
	<li>Neem een kant-en-klare mastermixplaat van de 4 °C, label deze met de naam van de plaat en gebruik een scherp mes om een lijn in de folie rond de controleputten (N23/24, O23/24 en P23/24) te snijden.</li>
	<li>Plaats de master mengplaat op dek 6 en verwijder de folieafdekking, laat de kleine rechthoek achter die de controleputten bedekt. Maak de tipdozen bloot en sluit de robot.</li>
	<li>Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Start Uitvoeren via de robotdesktoptoepassing. Elk kwartaal duurt 24,5 min om op de plaat te laden; stel een timer in als herinnering.</li>
	<li>Terwijl de robot draait, ontkurkt en laadt u kwart 2 monsterbuizen in de tweede set 3D-geprinte rekken zoals beschreven in paragraaf 7.2.</li>
	<li>Wanneer de robot pauzeert, verwijdert u kwart 1-rekken en vervangt u ze door kwart 2-rekken. Klik op Uitvoeren hervatten in de bureaubladtoepassing.</li>
	<li>Vat kwart 1 monsterbuizen samen en bewaar ze in een koelkast van 4 °C in afwachting van de resultaten. Herhaal dit laadproces voor kwart 3 en 4.</li>
	<li>Breng de geladen plaat over naar een bioveiligheidskast. Om verontreiniging tot een minimum te beperken, houdt u de plaat bedekt tijdens de overdracht.</li>
</ol>8. Handmatig laden van monsters
OPMERKING: Voer één handmatige run uit op herhaalde monsters (N1 Rerun of Rerun, zie figuur 3) in geval van onvoldoende robotbelasting.
<ol><li>Verzamel eventuele herhalingsmonsters en wijs ze toe als de laatste monsters in kwartaal 4 (zie rubriek 6.2). Nummer monsters, scan de streepjescodes en voer de oorspronkelijke monsterlocatie en het resultaat in de spreadsheet voor het laden van monsters in.</li>
	<li>Breng herhaalde monsters over naar de bioveiligheidskast. Laad geen herhaalde monsterbuizen in de robotlaadrekken.</li>
	<li>Pipetteer 2 μL van elk herhalingsmonster naar de juiste putten volgens het plaatlay-outdiagram (aanvullend bestand 6). Gebruik een speciale pipet voor het toevoegen van patiëntmonsters. Houd controleputten bedekt met folie terwijl u monsters toevoegt om verontreiniging te minimaliseren.</li>
</ol>9. Toevoeging van controles aan testplaten
<ol><li>Verwijder de folieafdekking over controleputten met een tang.</li>
	<li>Pipetteer 2 μL nucleasevrij water (geen sjablooncontrole) naar putten N23-N24 en 2 μL van 200 cpμ gemengde positieve controle (zie sectie 3) naar putten O23-O24. Pipetteer 2 μL van een bevestigde positieve patiëntmonstercontrole in putjes M23-M24 als extra controle. Laat putten P23-P24 leeg om de batchkwaliteit van de mastermix te bewaken.</li>
	<li>Bedek de plaat met een optisch heldere afdichting en gebruik de applicatorrol om alle putten afdichting te bevestigen. Vortex de plaat bij 2500 rpm gedurende 30 sec om grondig te mengen. Centrifugeer de plaat gedurende 1 min bij 500 x g .</li>
</ol>10. RT-qPCR uitvoeren
<ol><li>Maak een protocolprogramma in de thermocycler-software volgens de beschreven omstandigheden (tabel 3). Bewaar het protocol voor toekomstige platen. Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en voer het protocol uit.</li>
	<li>Exporteer Ct-waarden als een .xslx-bestand en kopieer de waarden naar de spreadsheet voor het laden van voorbeelden (aanvullend bestand 5). OPMERKING: Deze bladen zijn speciaal ontworpen voor Ct-uitvoerbestanden van software van de fabrikant en moeten mogelijk worden gewijzigd om andere indelingen te accepteren.</li>
</ol>11. Bepaling van de geldigheid van de plaat
<ol><li>Valideer zowel de positieve controle en/of bekende positieve monsters als de negatieve controle om de plaatresultaten als geldig te beschouwen. Beoordeel de controleputten aan de hand van de volgende criteria.<ol>
<li>Controleer voor positieve controle of ten minste één positieve controleput (O23/O24) Ct-waarden tussen 22-28 produceert voor zowel P1- als N1-sondes. Als alternatief produceren de bekende positieve monsterputten (M23 / M24) P1- en N1 Ct-waarden <33 op de P1- en N1-sondes.</li>
		<li>Controleer voor negatieve controle of er geen N1- of P1 Ct-waarden zijn in een van de twee negatieve controleputten (N23/N24). Controleer of ct-waarden geldige versterkingscurven hebben voordat u de plaat ongeldig maakt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Interpretatie van voorbeeldresultaten
<ol><li>Bepaal het patiëntresultaat volgens het diagram (figuur 3) en rapporteer opgeloste monsters.<ol>
<li>Beoordeel het P1-resultaat als GELDIG of ONGELDIG. Als P1 een resultaat van Ct <33 oplevert, beschouw dan de put ALS GELDIG en ga verder met het resultaat van N1. Als P1 een resultaat oplevert van Ct >=33 of geen Ct-waarde, beschouw dan de put ONGELDIG.<ol>
<li>Beoordeel het N1-resultaat als JA, NEE of NEE*. Als N1 een resultaat van Ct <33 oplevert, is de put JA. Als N1 geen Ct-waarde produceert, is de put NO. Als N1 een Ct produceert >=33, is de put NO*. Controleer of alle N1 Ct-waarden zijn gekoppeld aan een echte versterkingscurve. Als een Ct-waarde voor N1 geen versterkingscurve heeft, is de put NO.</li>
			<li>Identificeer herhaalde monsters (N1 Rerun of Rerun), label ze met een intern monsternummer en monstertype en breng ze terug naar de laadworkflow (sectie 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laboratorium opruimen
<ol><li>Vloeistofbehandelingsrobots<ol>
<li>Reinig alle kanten met een desinfectiemiddel op gemiddeld niveau. Gebruik geen ethanol omdat dit het plastic zal afbreken.</li>
		<li>Veeg het uiteinde van de pipetpunt en de afvalbak voorzichtig af met een alcoholdoekje (70% ethanol of 100% isopropanol). Veeg het toetsenbord en de muis schoon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bioveiligheidskast<ol>
<li>Reinig alle oppervlakken met een desinfectiemiddel op gemiddeld niveau. Doe het UV-licht gedurende 15 minuten aan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. De test die in het protocol wordt beschreven, valt onder de SalivaDirect EUA die is ingediend door Yale School of Public Health.

De in het protocol beschreven test werd beoordeeld door een onafhankelijke validatiestudie. Het bleek dat de test 98,9% specificiteit (1,1% vals positief) en 90,0% sensitiviteit (10,0% vals negatief) had wanneer geëvalueerd tegen gepaarde nasofaryngeale swabs die tegelijkertijd werden genomen (n = 837; 817 negatieven, 20 positief). Belangrijk is dat drie deelnemers die positief testten met TigerSaliva en negatief met een nasofaryngeale swab 48 h later opnieuw werden getest met swabs en positieve resultaten terugkregen, wat aangeeft dat TigerSaliva mogelijk SARS-CoV-2-infecties eerder in de loop van de ziekte kan detecteren.
We simuleerden positieve speekselmonsters door virusvrij speeksel (zowel warmtebehandeld als niet-warmtebehandeld) te spieken met bekende concentraties SARS-CoV-2 synthetisch RNA en voerden een 10-voudige verdunning uit om de Ct-limiet in speeksel te bepalen. Het N1-gen was niet detecteerbaar onder de 10.000 genkopieën (ongeveer Ct = 28) in gesimuleerde positieve monsters. We vermoeden dat dit te wijten is aan RNase-degradatie of andere verstorende factoren. De interactie van speeksel-RNasen met naakt synthetisch RNA verschilt echter waarschijnlijk van de interactie met virale deeltjes, zelfs nadat ze door hitte zijn gedenatureerd. Positieve speekselmonsters zijn geïdentificeerd met Ct >30 en externe laboratoria hebben SARS-CoV-2 genetische sequentiegegevens van deze monsters verkregen. We speculeren dat de virale eiwitten bescherming bieden tegen RNA-afbraak in speekselmonsters van patiënten.
De meest kritieke stap in het protocol is de implementatie van automatisering voor de bereiding van hoofdmengsels en de verwerking van speekselmonsters (respectievelijk secties 4 en 7). Dit zorgt voor overlappende taakprocessen, wat de doorlooptijd drastisch verkort. Een andere cruciale stap is de interpretatie van klinische resultaten (rubrieken 11 en 12). Het vaststellen van tussenliggende resultaatcategorieën (Rerun en N1 Rerun) minimaliseerde ook het optreden van niet-overtuigende testresultaten.
We toonden aan dat de variatie tussen handmatige en geautomatiseerde methoden voor het laden van speekselmonsters verwaarloosbaar is (figuur 5A) en dat automatisering de reproduceerbaarheid van SARS-CoV-2-detectie kan verbeteren (figuur 5B). Automatisering moet de voorkeur krijgen om testen te vergemakkelijken bij het ontwerpen en uitbreiden van klinische laboratoria25. De laboratoriumworkflow wordt verbeterd door de implementatie van robot-geautomatiseerde taken26. Open-source mogelijkheden van de vloeistofbehandelingsrobots maken de implementatie van aangepaste scripts voor protocolontwerp mogelijk. Dit maakt vloeistofbehandelingsrobots een goedkoop en zeer aanpasbaar systeem in vergelijking met traditionele klinische automatiseringsmethoden. Het is ook een ideale strategie voor het uitvoeren van zeer repetitieve laboratoriumtaken. De hoge mate van aanpasbaarheid van het systeem vertaalt zich in de vrijheid om labware (bijv. Verzamelbuizen, pipetpunten of 384-well platen) te wijzigen in geval van tekorten. Daarom is automatisering met behulp van vloeistofbehandelingsrobots haalbaar voor zowel grootschalige als kleinschalige bewaking en onderzoek.
Een groot voordeel van deze teststrategie is een veel kortere doorlooptijd ten opzichte van andere klinische laboratoria. Het gebruik van geautomatiseerde vloeistofbehandelingsrobots speelt een sleutelrol bij het verkorten van de doorlooptijd, maar gelijktijdig gebruik van robots en thermocyclers is ook van groot belang bij het maximaliseren van de testefficiëntie. Eén robot en thermocycler moeten als een paar worden gebruikt, waarbij beide machines tegelijkertijd worden gebruikt voor ononderbroken monsterbelasting en monsterresultaatanalyse. Zodra een gestage stroom van toegewezen monsters is vastgesteld, kunnen alle machineparen tegelijkertijd worden bediend. Constant gelijktijdig gebruik van robots en thermocyclers verhoogt de testcapaciteit en efficiëntie drastisch, wat cruciaal is om het hoge testvolume op te vangen.
In tegenstelling tot andere gevestigde SARS-CoV-2 RT-qPCR-protocollen, hebben we een touchdown-stap opgenomen in het thermocycler-protocol om het gloeien van de sonde en primersets naar de doelgenen27 te verbeteren, waardoor het risico op mislukte amplificatie wordt verminderd. De resultaten toonden aan dat de touchdown de detectie van positieve monsters verbeterde zonder het verlies van specifieke primerbinding te riskeren (tabel 4). We hebben vastgesteld dat een breed scala aan zowel SARS-CoV-2 RNA-kopieën (figuur 4A) als Hs_RPP30 DNA-kopieën (figuur 4B) tegelijkertijd kan worden gedetecteerd door de RT-qPCR-test.
Een beperking van vloeistofbehandelingsrobots is de mogelijkheid van kruisbesmetting door positieve monsters tijdens speekseloverdracht. Speeksel is een visco-elastische vloeistof28 en kan over aangrenzende putten rijgen nadat het uit de pipetpunt is afgegeven. Bovendien kan de heterogeniteit van speeksel29 leiden tot een ongelijke verdeling van virale deeltjes over het monster. Dit verhoogt de kans op zowel valse positieven als negatieven, waardoor de aanduiding van N1 Rerun- en Rerun-monsters noodzakelijk is. 14,1% van de monsters die aanvankelijk waren aangewezen als N1 Rerun, verdween echter als positief voor SARS-CoV-2 en had meer dan 30 keer meer kans dan Rerun-monsters om na hertest als positief te verdwijnen. Bijgevolg zorgde het onderscheiden van Rerun van N1 Rerun (figuur 3) voor een nauwkeurigere scheiding van potentieel positieve monsters, waardoor de gevoeligheid en specificiteit van onze diagnostische test werden verhoogd. Andere resulterende parameters voor diagnostisch speekselonderzoek maakten dit onderscheid niet12,14,24,30,31.
Speekselmonsters kunnen moeilijk te pipetteren zijn vanwege heterogeniteit en viscositeit32. Warmtebehandeling denatureert eiwitten in de speekselbiomatrix adequaat, waardoor de viscositeit wordt verminderd en de behoefte aan RNA-extractiereagentia9, die schaars waren tijdens de vroege stadia van de pandemie10, wordt geëlimineerd. Uitgebreide warmtebehandeling inactiveert ook aanwezige virussen33, wat laboratoriumverwerking bij lagere bioveiligheidsniveaus mogelijk maakt. Bijgevolg werd een op warmte gebaseerde RNA-extractie (beschreven in paragraaf 5.4) geïmplementeerd om de viscositeit te verlagen door eiwitdenaturatie (figuur 6). Op basis van de resultaten stellen we dat warmtebehandeling naast het denatureren van de eiwitbiomatrix ook speekselmonsters kan homogeniseren. Andere groepen combineerden warmtebehandeling en proteïnase K-behandeling om de homogeniteit te vergroten9,14,34. We hebben ervoor gekozen om deze stap niet te implementeren, omdat het virion-eiwitten kan denatureren met een snelheid die viraal RNA blootstelt aan warmtedegradatie35. Bovendien kan monsterverdunning met proteïnase K positieve monsters maskeren die minder virale deeltjes bevatten, waardoor de gevoeligheid afneemt. Bovendien werden de testresultaten vergeleken met een in de handel verkrijgbare speekselgebaseerde SARS-CoV-2-test (Logix Smart COVID-19) die magnetische kralen-RNA-extractie gebruikt (tabel 5). Het bleek dat de huidige test beter geschikt was voor het detecteren van zwakke positieve monsters in vergelijking met de in de handel verkrijgbare test.
Het is moeilijk om het aantal viruskopieën in speeksel te kwantificeren met alleen RT-qPCR, omdat qPCR semi-kwantitatief is. Er is inherente variatie tussen Ct-waarden die voortkomt uit technische beperkingen. Het aantal genkopieën kan worden bepaald aan de hand van Ct-waarden (figuur 4) en is ongeveer gelijk aan het aantal virale kopieën. Een mogelijke oplossing om het virale kopienummer in speekselmonsters te bepalen is ddPCR, dat zorgt voor een harde kwantificering van genkopieën in de reactie. Wij zijn echter van mening dat het voldoende is om kwalitatieve resultaten te leveren aan clinici en dat de relatieve virale inhoud kan worden vergeleken tussen monsters die met onze methoden worden verwerkt.
Ondanks enkele beperkingen die zich voordoen bij het gebruik van speeksel, blijkt de SARS-CoV-2-test door op speeksel gebaseerde RT-qPCR een effectieve methode te zijn voor snelle en betrouwbare virale RNA-detectie op elke testschaal. Dit geldt vooral in combinatie met het gebruik van open-source vloeistofbehandelingssystemen. Deze testbenadering kan worden aangepast om andere nucleïnezuursequenties te detecteren die relevant zijn voor diagnostiek, zoals ziekteverwekkers, ziektemarkers of andere virussen. Dit maakt de test toepasbaar voor zowel klinische als onderzoeksdiagnostische inspanningen.

Ernstig acuut respiratoir syndroom-geassocieerd coronavirus-2 (SARS-CoV-2), een nieuw coronavirus, dook eind 2019 op en verspreidde zich snel over de wereldbevolking1. De SARS-CoV-2-infectie veroorzaakt coronavirusziekte 2019 (COVID-19), een zeer besmettelijke ziekte met mogelijk ernstige ademhalings- en ontstekingsverschijnselen. Hoge overdraagbaarheid in combinatie met een lage mortaliteit gaven aan dat het virus zich snel door populaties zou verspreiden en meer diagnostische tests zou vereisen2,3. Aanbevelingen op het gebied van de volksgezondheid moedigden grootschalige bevolkingsscreening aan om gevallen te isoleren en vervolgens de transmissiesnelheden te verlagen4,5,6. Bovendien toonden modellen van populatiesurveillance aan dat het verhogen van de testfrequentie en het verkorten van de rapportagetijd een groter effect hadden op het verminderen van de transmissie dan het verhogen van de testgevoeligheid7. Dit komt waarschijnlijk omdat geïnfecteerde personen eerder in quarantaine kunnen worden geplaatst, waardoor infectieketens worden verbroken.
De oorspronkelijke nucleïnezuurversterkingstest (NAAT) standaard was nasopharyngeale (NP) swabs verwerkt door RT-qPCR8. Complicaties doen zich echter voor bij deze vorm van testen voor zeer grote populaties, zoals verhoogde relatieve kosten en verhoogde druk in de toeleveringsketen9,10. Bovendien zijn zowel het verzamelen van monsters als de verwerking van veelgebruikte NAAT-methoden (waaronder NP-swabs, orofaryngeale swabs, mid-turbinate swabs en neusuitstrijkjes) afhankelijk van gespecialiseerde apparatuur, reagentia en medisch personeel9,10.
Een adequate vervanging voor NP swab RT-qPCR-testen is speeksel-gebaseerde testen, wat een nauwkeurig diagnostisch hulpmiddel is voor SARS-CoV-2 detectie11,12,13,14. Het direct uitvoeren van RT-qPCR op speekselmonsters levert een vergelijkbare gevoeligheid en specificiteit op als NP swabs15. Een groot voordeel van speekseltesten ten opzichte van NP-swabtesten is dat het zelfverzameling van monsters mogelijk maakt16. Dit minimaliseert de behoefte aan medisch personeel en maximaliseert het gemak van monsterverzameling voor patiënten door minder invasief te zijn dan NP-swabs. Bovendien, aangezien speekselmonsters geen buffers nodig hebben om het monster uit een wattenstaafje te verwijderen (zoals in het geval van NP-monsters), kunnen speekselgebaseerde tests direct gebruik maken van op warmte gebaseerde ribonucleïnezuur (RNA) -extractie, wat de testkosten verlaagt door de noodzaak van extra buffers, transportmedia en / of RNA-extractiereagentia te verwijderen14,17.
Het Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab is opgericht om tegemoet te komen aan de behoeften van de universiteit aan COVID-19-testen en -surveillance. In gesloten populaties, waaronder universiteiten, leverden frequente surveillancetests in combinatie met sociale afstand de meest gunstige resultaten op in epidemiologische modellen van ziekteprevalentie18. De geconsolideerde CDC 2019-nCOV RT-qPCR19- en SalivaDirect14-protocollen werden aangepast en automatisering werd gebruikt in de klinische workflow om de kosten te verlagen en de doorlooptijd te verbeteren. Eerdere groepen hadden open-source vloeistofbehandelingsrobots gebruikt voor SARS-CoV-2 RNA-extractiestappen20,21, maar we hebben het gebruik van de robots gemaximaliseerd om testplaten voor te bereiden en monsters te laden22. Hier laten we zien dat het aangepaste protocol en het gebruik van open-source vloeistofbehandelingssystemen (figuur 1) snelle en nauwkeurige op speeksel gebaseerde RT-qPCR mogelijk maakt en een effectieve strategie is voor grootschalige bewaking van de volksgezondheid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

De opkomst van de recente SARS-CoV-2 wereldwijde gezondheidscrisis bracht belangrijke uitdagingen voor epidemiologisch onderzoek en klinische testen met zich mee. Gekenmerkt door een hoge overdrachtsgraad en lage mortaliteit, vereiste de COVID-19-pandemie nauwkeurige en efficiënte diagnostische tests, vooral in gesloten populaties zoals residentiële universiteiten. De initiële beschikbaarheid van nucleïnezuurtests, zoals nasofaryngeale swabs, was beperkt vanwege de druk in de toeleveringsketen die ook de rapportage van testresultaten vertraagde. Speeksel-gebaseerde reverse transcriptase kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) testen is gebleken vergelijkbaar te zijn in gevoeligheid en specificiteit met andere testmethoden, en speekselverzameling is minder fysiek invasief voor deelnemers. Daarom ontwikkelden we een multiplex RT-qPCR diagnostische test voor populatiesurveillance van Clemson University en de omliggende gemeenschap. De test maakte gebruik van open-source vloeistofbehandelingsrobots en thermocyclers in plaats van complexe klinische automatiseringssystemen om de workflow en systeemflexibiliteit te optimaliseren. Automatisering van speekselgebaseerde RT-qPCR maakt snelle en nauwkeurige detectie van een breed scala aan virale RNA-concentraties mogelijk voor zowel grootschalige als kleinschalige testvereisten. De gemiddelde doorlooptijd voor het geautomatiseerde systeem was < 9 uur voor 95% van de monsters en < 24 uur voor 99% van de monsters. De kosten voor een enkele test waren $ 2,80 toen alle reagentia in bulkhoeveelheden werden gekocht.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Het protocol beschrijft een SARS-CoV-2 diagnostische methode die open-source automatisering gebruikt om RT-qPCR moleculaire testen van speekselmonsters uit te voeren. Deze schaalbare aanpak kan worden toegepast op klinisch toezicht op de volksgezondheid en om de capaciteit van kleinere universitaire laboratoria te vergroten.

Efficiënte SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Speeksel diagnostische strategie met behulp van Open-Source Pipetteerrobots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

We hebben een goedkope, op speeksel gebaseerde COVID 19-diagnostische test en workflow ontwikkeld die eenvoudig te implementeren en op te schalen is voor grootschalige community screening-toepassingen. Hier gebruiken we open source vloeistofbehandelingsrobots, standaard thermocyclers en software om direct speeksel te testen zonder extractie of stabilisatiebuffers, terwijl we nog steeds nauwkeurige diagnostische resultaten leveren. Vanwege de eenvoudige geautomatiseerde parallelle workflows kan het systeem worden opgeschaald om dagelijks duizenden tests uit te voeren met minimale apparatuur, ruimte en personeelsvereisten.Naast Kylie King zullen Rachel Ham, onze klinische laboratoriumbegeleider en Austin Smothers, onze onderwijscoördinator, helpen om de procedure te demonstreren Begin met het ontsmetten van de buitenkant van de speekselopvangbuizen met 70% ethanol en breng ze over naar het laboratorium voor testen. Registreer de aankomst van het monster door elke voorbeeldwebcode in de spreadsheet voor dagelijkse inname te scannen. Behandel de scanmonsters gedurende 30 minuten in een oven van 95 graden Celsius en verwijder de monsters vervolgens met hittebestendige handschoenen.Open de spreadsheets voor het dagelijks laden van monsters voor elke monsterbeladingsrobot op het monstertoewijzingsstation. Wijs vervolgens 188 monsters toe aan elke 384 putplaat. Etiketteer trays met plaatnaam, datum en kwartnummer.Scan de monsters in volgorde in de spreadsheet voor het laden van monsters. Zet bij het monsterlaadstation twee volledige sets van acht 3D-geprinte rekken op een rij, die overeenkomen met de plaatsing van het dek in de robot. Maak kwart één buizen los en plaats ze in 3D-geprinte rekken, te beginnen met positie A1 in rek één.Vul elk rek van links naar rechts en van boven naar beneden. Ga verder met dit laadpatroon in rek twee en ga dan verder met rekken vier en vijf. Plaats geladen kwart één monsterrekken op dekken één, twee, vier, vijf, zeven, acht, 10, 11.Plaats P20 tips op decks drie en negen. Om het installatieproces te vereenvoudigen, laadt u materialen van achter naar voren in de robot. De master mixplaten worden geproduceerd op een speciale robot en opgeslagen bij vier graden Celsius.Eén plaat wordt tegelijk gebruikt en is gelabeld met de naam van de plaat, en een scherp mes wordt gebruikt om een lijn in de folie rond de controleputten te snijden. Plaats de master mixplaat op dek zes en verwijder de folieafdekking, laat de kleine rechthoek achter die de controleputten bedekt. Maak de tipdozen bloot en sluit de robot.Initialiseer het aangepaste Python-besturingsprotocol door te klikken op Start run through the robot desktop application. Elk kwartaal duurt 24,5 minuten om op het bord te laden. Stel een timer in als herinnering.Terwijl de robot draait, ontdoe je en laad je kwart twee monsterbuizen in de tweede set 3D-geprinte rekken. Wanneer de robot pauzeert, verwijdert u de kwart één racks en vervangt u ze door de kwart twee racks en klikt u vervolgens op hervatten van uitvoeren in de desktoptoepassing. Vat monsterbuizen van kwart één samen en bewaar ze in een koelkast van vier graden Celsius in afwachting van de resultaten.Herhaal dit laadproces voor kwart drie en vier. Breng de geladen plaat over naar een bioveiligheidskast. Om verontreiniging tot een minimum te beperken, houdt u de plaat bedekt tijdens de overdracht.Verzamel eventuele herhalingsmonsters en wijs ze toe als de laatste monsters in kwartaal vier. Nummer de monsters, scan de streepjescodes en voer de oorspronkelijke monsterlocatie en het resultaat in de spreadsheet voor het laden van monsters in. Breng de herhalingsmonsters over naar de bioveiligheidskast.Laad de herhaalde monsterbuizen niet in de robotlaadrekken. Pipetteer twee microliter van elk herhalingsmonster naar de juiste putjes. Gebruik de daarvoor bestemde pipet voor het toevoegen van patiëntmonsters.Houd de controleputten bedekt met folie terwijl u monsters toevoegt om verontreiniging te minimaliseren. Verwijder de folieafdekking over controleputten met een tang. Pipetteer twee microliter bevestigde positieve patiëntmonsters in putjes M23 en M24.Pipetteer twee microliter nucleasevrij water naar putten N23 tot N24 en twee microliter van 200 kopieën per microliter gemengde positieve controle naar Wells O23 tot O24. Laat putten P23 tot P24 leeg om de batchkwaliteit van de mastermix te bewaken. Bedek de plaat met een optisch heldere afdichting en gebruik de applicatorrol om alle putten afdichting te bevestigen.Vortex de plaat bij 2, 500 RPM gedurende 30 seconden om grondig te mengen en centrifugeer de plaat vervolgens gedurende één minuut op 500 keer G. Selecteer het protocolprogramma in de thermocyclersoftware en sla het protocol op voor toekomstige platen. Plaats de verzegelde plaat in de thermocycler en voer het protocol uit.Exporteer CT-waarden en kopieer de waarden naar de spreadsheet voor het laden van voorbeelden. Controleer voor positieve controle of ten minste één positieve controleput CT-waarden tussen 22 en 28 oplevert voor zowel P1- als N1-sondes. Als alternatief produceren de bekende positieve monsterputten P1- en N1 CT-waarden van minder dan 33 op de P1- en N1-sondes.Controleer voor negatieve controle of er geen N1- of P1 CT-waarden zijn in een van de twee negatieve controleputten. Controleer of CT-waarden geldige versterkingscurven hebben voordat u de plaat ongeldig maakt. Als P1 een resultaat van CT van minder dan 33 oplevert, beschouw de put dan als geldig en ga verder met het resultaat van N1. Als P1 een resultaat van CT produceert dat groter is dan of gelijk is aan 33 of geen CT-waarde, beschouw de put dan als ongeldig.Als N1 een resultaat van CT van minder dan 33 oplevert, beoordeel dan de put als ja. Als N1 geen CT-waarde oplevert, beoordeel dan de put als nee. Als N1 een CT-waarde produceert die groter is dan of gelijk is aan 33, beoordeel dan de put als geen ster.Controleer of alle N1 CT-waarden zijn gekoppeld aan een echte versterkingscurve. Als een CT-waarde voor N1 geen versterkingscurve heeft, is de put nee. Identificeer de herhalingsmonsters, label ze met een intern monsternummer en monstertype en breng ze terug naar de laadworkflow.De representatieve beelden tonen de RTQ PCR detectie van N1 of SARS CoV-2 synthetisch RNA en P1 of HSRPP30 synthetisch DNA. Standaardcurven werden uitgezet met standaardafwijkingen om het bereik van nauwkeurige detectie te bepalen met behulp van deze sondeprimercombinatie. De gemiddelde CT-waarden verkregen in de respectieve verdunningen werden uitgezet tegen de geschatte hoeveelheid synthetisch RNA en synthetisch DNA.In beide gevallen vertoonden de lineaire curven goede correlatiecoëfficiënten over een breed scala aan genkopieconcentraties. N1 CT-waarden verkregen uit unieke monsters met behulp van zowel de robot als handmatige monsterbelasting werden getransponeerd om de inter assayvariabiliteit tussen de handmatige en robotbelading te bepalen. De lineaire relatie tussen de handmatige en geautomatiseerde methoden leverde een hoge correlatiecoëfficiënt op die aangeeft dat beide methoden functioneel gelijkwaardig zijn.Intra-assayvariabiliteit werd ook bepaald met behulp van getransponeerde replicerende N1 CT-waarden verkregen uit zowel de robot als handmatige monsterbelasting. Evaluatie van warmtebehandelingsmethoden voor viscositeitsreductie in het speeksel wordt hier getoond. SARS CoV-2 negatief speeksel werd verzameld uit een enkele bron en aliquots werden warmtebehandeld gedurende nul minuten, 30 minuten of 60 minuten bij 95 graden Celsius.P1 CT-waarden van technische replicaties van elke aandoening werden uitgezet om de variabiliteit tussen de behandelingsmethoden te bepalen. Zowel 30 minuten als 60 minuten warmtebehandelingsmethoden produceerden een significant verminderde monstervariabiliteit in vergelijking met geen behandelingscontrole. Er was geen significant verschil tussen behandelingen van 30 minuten en 60 minuten.Daarom werd de 30 minuten warmtebehandelingsmethode geïmplementeerd om de verwerkingstijd te verkorten. Gebruik de juiste aseptische techniek om verontreiniging van de testplaten te minimaliseren, met name bij het laden van handmatige monsters en controles. Vermijd het kruisen van de plaat met je handen of mouwen.Nadat klinische resultaten zijn geproduceerd, kunnen monsters worden verwijderd in biohazard afval of kunnen ze worden opgeslagen voor verdere analyse, zoals whole genome sequencing om specifieke stammen te bepalen. Deze techniek maakt grootschalige gemeenschapstests mogelijk, waardoor we de effecten van testdekking en de niet-symptomatische verspreiding van Covid 19 kunnen onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snelle screening van HIV reverse transcriptase en integrase-remmers

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Gebruik makend van de Antigen Capsid-Incorporation strategie voor de ontwikkeling van adenovirus serotype 5-Vectored Vaccin Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kwantitatieve PCR van T7 bacteriofaag van Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisatie van SARS-CoV-2 met behulp van Immuno RNA-Fluorescentie In Situ Hybridisatie

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Detectie van SARS-CoV-2 neutraliserende antilichamen met behulp van high-throughput fluorescerende beeldvorming van pseudovirusinfectie

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Een Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG en IgM SARS-CoV-2 Neutralisatie assay voor een Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie bij K18 hACE2 transgene muizen met reporter-expressing recombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...