Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
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Die Autoren danken Clemsons Verwaltung, dem medizinischen Personal und den Mitarbeitern des klinischen Labors im REDDI Lab, die bei der Implementierung und Verwaltung von SARS-CoV-2-Tests geholfen haben. Wir danken Dr. Phillip Buckhaults und Dr. Carolyn Bannister von der University of South Carolina für die erste Projektberatung und Branchenkontakte für die Beschaffung von Ausrüstungen. Wir danken vielen Studenten, Professoren und Mitarbeitern für ihre Unterstützung bei der Probensammlung. Vielen Dank an die Creative Inquiry-Studenten für die Standard-Kurvendatenerfassung. Die Finanzierung für diese Studie wurde aus dem National Institutes of Health-Zuschuss P20GM121342 (vergeben an DD und LGP), dem Clemson Athletic Department, dem Vice President for Research der Clemson University und dem South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee erhalten.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den Clemson University und den Prisma Health Institutional Review Boards durchgeführt (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1. Juli 2020).
1. Einrichtung eines Open-Source-Liquid-Handling-Roboters
<ol><li>Installieren Sie hocheffiziente Partikelluftfiltermodule (HEPA) (siehe Materialtabelle) an der Oberseite jedes Liquid-Handling-Roboters gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 8-Kanal-P20-Pipette gemäß den Anweisungen des Herstellers an der linken Halterung des/der Master-Mischplattenvorbereitungsroboters.</li>
	<li>Befestigen Sie eine P20-Pipette gemäß den Anweisungen des Herstellers an der rechten Halterung des/der Probenladeroboters/-roboter.</li>
	<li>Laden Sie die benutzerdefinierten Python-Skripts (Supplemental File 1 und Supplemental File 2) auf die entsprechenden Computer herunter.</li>
	<li>Öffnen Sie TigerSaliva Full 384 Loading.py in der Desktop-Anwendung an den Beispiel-Laderoboter-Computern. Klicken Sie auf Kalibrieren und richten Sie sowohl die Pipette als auch das Programm gemäß den Anweisungen der Software ein.</li>
	<li>Öffnen Sie 12 Full Plates.py in der Desktop-Anwendung am Master-Mix-Robotercomputer. Klicken Sie auf Kalibrieren und richten Sie sowohl die Pipette als auch das Programm gemäß den Anweisungen der Software ein.</li>
	<li>Drucken Sie benutzerdefinierte Musterregale mit einem fusionierten dreidimensionalen (3D)-Drucker mit einer CAD-Datei (Computer-Aided Design, https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Drucken Sie 16 Racks pro Probenladeroboter für zwei Sätze von acht Racks.</li>
</ol>2. Vorbereitung von 20x Multiplex-Sonden-/Primer-Mix N1+P1
<ol><li>Bereiten Sie eine Charge eines 20-fachen Multiplex-N1+P1-Sonden-/Primer-Mixes (Gesamtvolumen von 20 ml, Tabelle 1) in einem konischen 50-ml-Röhrchen in einer sterilen Umgebung fern von synthetischer SARS-CoV-2-RNA oder Patientenproben vor.</li>
	<li>Aliquot 1,6 ml der Mischung mit einer serologischen Pipette in sterile 2,0 ml Zentrifugenröhrchen und entsprechend etikettieren.</li>
	<li>Bewahren Sie Aliquots in einem -20 °C Gefrierschrank auf, bis sie gebrauchsfertig sind.</li>
</ol>3. Herstellung eines positiven Kontrollmixes
HINWEIS: Die Positivkontrollmischung sollte nicht in derselben sterilen Umgebung wie die Sonde / Primer-Mischung oder andere Master-Mix-Komponenten hergestellt werden. Es sollte ein separater Behälter mit nukleasefreiem Wasser verwendet werden.
<ol><li>Verdünnen Sie die synthetische SARS-CoV-2-RNA (N1) von 1.000.000 Genkopien/μL (cpμ) auf 10.000 cpμ, indem Sie 10 μL Stammlösung zu 990 μL nukleasefreiem Wasser hinzufügen. Aliquot 25 μL von 10.000 cpμ in sterile 0,2 mL Röhrchen und entsprechend etikettieren. Lagern Sie ungenutzte Aliquots bei -80°C. HINWEIS: Synthetische RNA muss bei -80 ° C gelagert werden, um einen Abbau zu verhindern.</li>
	<li>Verdünnen Sie Hs_RPP30 synthetische DNA (P1) von 200.000 cpμ auf 10.000 cpμ, indem Sie 50 μL Stammlösung zu 950 μL nukleasefreiem Wasser hinzufügen. Aliquot 25 μL von 10.000 cpμ in sterile 0,2 mL Röhrchen und entsprechend etikettieren. Lagern Sie ungenutzte Aliquots bei -80°C.</li>
	<li>Verdünnen Sie jede Komponente auf eine Endkonzentration von 200 cpμ, indem Sie 20 μL SARS-CoV-2 und Hs_RPP30 10.000 cpμ-Bestände zu 960 μL nukleasefreiem Wasser hinzufügen, was insgesamt 1000 μL entspricht. Aliquot 20 μL gemischte 200 cpμ positive Kontrolle in 0,2 ml-Röhrchen und beschriftete sie entsprechend. Aliquots bis zur Gebrauchsfertigkeit bei -80°C lagern.</li>
</ol>4. Herstellung von Master-Mixplatten
HINWEIS: Stellen Sie die Mastermischung in einer sterilen Umgebung vor, weg von synthetischer SARS-CoV-2-RNA oder Patientenproben. Alle Bestandteile müssen vor der Zugabe zum Gemisch vollständig aufgetaut sein; Ohne richtiges Auftauen können die Konzentrationen falsch sein. Unzureichendes Auftauen wird durch das Vorhandensein von Eis oder eine ungleichmäßige Farbe von Reagenzien angezeigt. Während der Zubereitung der Mischung auf einem Gefrierblock aufbewahren.
<ol><li>Bereiten Sie eine Charge Multiplex-Master-Mix (Gesamtvolumen von 48 ml, Tabelle 2) in einem konischen 50-ml-Rohr vor.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Mischung, indem Sie das Rohr 3x drehen. Mischen Sie nicht, indem Sie auf und ab pipettieren oder wirbeln, da dies das Enzym schädigt.</li>
	<li>Füllen Sie die Säulen 1-4 eines sterilen 96-Well-Tiefbrunnenreservoirs, indem Sie 1,48 ml Master-Mix in jedes Bohrloch übertragen. Ein 50 ml konisch füllt vier Säulen, genug für 12 Platten.</li>
	<li>Decken Sie den Tiefbrunnenbehälter mit einer Folienversiegelung ab und legen Sie ihn in den speziellen Master-Mix-Liquid-Handling-Roboter. Platzieren Sie das gefüllte Tiefbrunnenreservoir auf Deck 10, platzieren Sie sechs leere 384-Well-Platten auf den Decks 1-6 und die P20-Spitzenbox auf Deck 11. Entdecken Sie die Tiefbrunnenplatte und die Spitzenboxen und schließen Sie den Roboter.</li>
	<li>Initialisieren Sie das benutzerdefinierte Python-Betriebsprotokoll, indem Sie in der Roboter-Desktopanwendung auf Start Run klicken.</li>
	<li>Nach 40 Minuten pausiert der Lauf. Decken Sie die gefüllten 384 Wellplatten mit Foliendichtungen ab, während sie im Roboter verbleiben, und drücken Sie sie mit der Walze nach unten, um die Haftung zu gewährleisten. Beschriften Sie den Rand jeder Platte mit einer Chargenkennung.</li>
	<li>Legen Sie sechs neue leere 384-Well-Platten auf die Decks 1-6 und setzen Sie das Betriebsprotokoll fort, indem Sie auf Resume Run klicken. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, bedecken Sie den letzten Satz von 384 Bohrlochplatten mit Foliendichtungen.</li>
	<li>Pipette 2 μL der verbleibenden Mastermischung in die Spalten 1-3 und 22-24 einer leeren 384-Well-Platte zur Chargenqualitätskontrolle. Mit einer optisch undurchsichtigen Abdichtung abdichten und auf dem Thermocycler laufen (Abschnitt 10.1-10.2). Wenn Bohrungen N1-Schwellenwerte (Ct) aufweisen oder wenn mehr als 10 Bohrlöcher P1-Ct-Werte aufweisen, ist die Charge kontaminiert und kann nicht verwendet werden.</li>
	<li>Lagern Sie die vorbereiteten Master-Mixplatten bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 7 Tagen nach der Zubereitung.</li>
</ol>5. Probenentnahme, -aufnahme und -wärmebehandlung
<ol><li>Weisen Sie die Teilnehmer an, 30 Minuten vor der Speichelentnahme nicht zu essen, zu trinken, zu rauchen oder Zahnhygiene durchzuführen. Weisen Sie die Teilnehmer an, mindestens 1 ml Speichel zu sammeln, der sich auf natürliche Weise im Mund sammelt, und ihn in einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen ohne Konservierungsstoffe abzuscheiden und dann das Röhrchen zu verschließen (Supplemental File 3).</li>
	<li>Dekontaminieren Sie die Außenseite von Speichelsammelröhrchen mit 70% Ethanol oder Desinfektionstüchern und geben Sie sie zur Prüfung ins Labor.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Probenankunft auf, indem Sie jeden Proben-Barcode in die tägliche Aufnahmetabelle (Supplemental File 4) scannen.</li>
	<li>Behandeln Sie die gescannten Proben 30 min lang in einem 95 °C heißen Ofen. Entfernen Sie Proben, während Sie hitzebeständige Handschuhe tragen. HINWEIS: Unbehandelte Proben sind bei Raumtemperatur (23 °C) bis zu 72 h stabil. Nach der Wärmebehandlung müssen die Proben bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden.</li>
</ol>6. Beispielzuordnung
<ol><li>Öffnen Sie die täglichen Probenladetabellen für jeden Probenladeroboter (Supplemental File 5) auf dem Computer an der Probenzuweisungsstation.</li>
	<li>Weisen Sie jeder 384-Well-Platte 188 Proben wie folgt zu: Die Proben 1-48 gelten als Quartal 1, die Proben 49-96 als Quartal 2, die Proben 97-144 als Quartal 3 und die Proben 145-188 als Quartal 4. Die Proben werden doppelt analysiert.</li>
	<li>Beschriften Sie Tabletts mit Plattenname, Datum und Viertelnummer. Scannen Sie die Proben der Reihe nach in die Probenladetabelle. HINWEIS: Proben von früheren Platten müssen möglicherweise manuell ausgeführt werden, wie in Abbildung 3 definiert. Manuelle Anweisungen zur Probenzuweisung und zum Laden finden Sie in den Abschnitten 8.1-8.3.</li>
</ol>7. Bedienung von Probenladerobotern
<ol><li>Stellen Sie an der Probenladestation zwei vollständige Sätze von acht 3D-gedruckten Racks auf, die der Deckplatzierung im Roboter entsprechen.</li>
	<li>Schließen Sie die Tuben von Viertel 1 auf und legen Sie sie in 3D-gedruckte Racks, beginnend mit der Position A1 in Rack 1. Füllen Sie jedes Rack von links nach rechts und von oben nach unten. Setzen Sie dieses Lademuster in Rack 2 fort, und fahren Sie dann mit den Racks 4 und 5 fort (siehe Abbildung 2C). HINWEIS: Racks werden aufgrund der Roboterprogrammparameter nicht fortlaufend nummeriert.</li>
	<li>Platzieren Sie beladene Quarter 1 Sample Racks auf den Decks 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Platzieren Sie P20-Tipps auf den Decks 3 und 9. Um den Rüstvorgang zu vereinfachen, laden Sie Materialien von hinten nach vorne in den Roboter.</li>
	<li>Nehmen Sie eine vorgefertigte Master-Mixplatte aus der 4 °C, beschriften Sie sie mit dem Plattennamen und schneiden Sie mit einer scharfen Klinge eine Linie in der Folie um die Steuerbrunnen (N23/24, O23/24 und P23/24).</li>
	<li>Legen Sie die Master-Mixplatte auf Deck 6 und ziehen Sie die Folienabdeckung ab, wobei das kleine Rechteck, das die Steuerschächte bedeckt, zurückbleibt. Entdecken Sie die Tip-Boxen und schließen Sie den Roboter.</li>
	<li>Initialisieren Sie das benutzerdefinierte Python-Betriebsprotokoll, indem Sie über die Roboterdesktopanwendung auf Ausführen starten klicken. Jedes Viertel benötigt 24,5 Minuten, um auf die Platte geladen zu werden; Legen Sie einen Timer als Erinnerung fest.</li>
	<li>Während der Roboter läuft, öffnen Sie die Kappe und laden Sie Viertel-2-Probenröhrchen in den zweiten Satz 3D-gedruckter Regale, wie in Abschnitt 7.2 beschrieben.</li>
	<li>Wenn der Roboter pausiert, entfernen Sie die Racks von Viertel 1 und ersetzen Sie sie durch die Racks von Viertel 2. Klicken Sie in der Desktopanwendung auf Ausführen fortsetzen .</li>
	<li>Fassen Sie die Probenröhrchen von Quartal 1 zusammen und lagern Sie sie in einem 4 ° C-Kühlschrank, während Sie auf die Ergebnisse warten. Wiederholen Sie diesen Ladevorgang für die Quartale 3 und 4.</li>
	<li>Überführen Sie die beladene Platte in eine Biosicherheitswerkbank. Um die Kontamination zu minimieren, halten Sie die Platte während des Transfers bedeckt.</li>
</ol>8. Manuelles Laden der Probe
HINWEIS: Führen Sie bei wiederholten Proben (N1 Rerun oder Rerun, siehe Abbildung 3) bei unzureichender Roboterbelastung einen einzelnen manuellen Lauf durch.
<ol><li>Sammeln Sie alle Wiederholungsproben und weisen Sie sie als letzte Proben in Quartal 4 zu (siehe Abschnitt 6.2). Nummerieren Sie Proben, scannen Sie die Barcodes, geben Sie den ursprünglichen Probenspeicherort und das Ergebnis in die Probenladetabelle ein.</li>
	<li>Erneute Proben an die Biosicherheitskabine übergeben. Laden Sie keine Wiederholungsprobenröhrchen in die Roboterladegestelle.</li>
	<li>Pipette 2 μL jeder Wiederholungsprobe zu den richtigen Vertiefungen gemäß dem Plattenlayoutdiagramm (Supplemental File 6). Verwenden Sie eine spezielle Pipette zum Hinzufügen von Patientenproben. Halten Sie die Kontrollbrunnen mit Folie bedeckt, während Sie Proben hinzufügen, um die Kontamination zu minimieren.</li>
</ol>9. Hinzufügen von Kontrollen zu den Prüfplatten
<ol><li>Ziehen Sie die Folienabdeckung über den Kontrollvertiefungen mit einer Pinzette ab.</li>
	<li>Pipette 2 μL nukleasefreies Wasser (keine Schablonenkontrolle) zu den Brunnen N23-N24 und 2 μL von 200 cpμ gemischter positiver Kontrolle (siehe Abschnitt 3) zu den Brunnen O23-O24. Pipette 2 μL einer bestätigten positiven Patientenprobenkontrolle in die Vertiefungen M23-M24 als zusätzliche Kontrolle. Lassen Sie die Bohrlöcher P23-P24 leer, um die Qualität der Master-Mix-Chargen zu überwachen.</li>
	<li>Decken Sie die Platte mit einer optisch klaren Abdichtung ab und verwenden Sie die Applikatorwalze, um die Dichtung an allen Vertiefungen festzuhalten. Wirbeln Sie die Platte bei 2500 U / min für 30 Sekunden, um gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 x g für 1 min.</li>
</ol>10. Durchführung der RT-qPCR
<ol><li>Erstellen Sie in der Thermocycler-Software ein Protokollprogramm gemäß den beschriebenen Bedingungen (Tabelle 3). Speichern Sie das Protokoll für zukünftige Platten. Legen Sie die versiegelte Platte in den Thermocycler und führen Sie das Protokoll aus.</li>
	<li>Exportieren Sie Ct-Werte als XSLX-Datei, und kopieren Sie die Werte in die Beispieltabelle zum Laden von Beispielen (Ergänzende Datei 5). HINWEIS: Diese Blätter wurden speziell für Ct-Ausgabedateien von der Herstellersoftware entworfen und müssen möglicherweise geändert werden, um andere Formate zu akzeptieren.</li>
</ol>11. Bestimmung der Gültigkeit des Tellers
<ol><li>Validieren Sie sowohl die Positivkontrolle und/oder bekannte positive Proben als auch die Negativkontrolle, um die Plattenergebnisse als gültig zu betrachten. Bewerten Sie die Kontrollbohrungen anhand der folgenden Kriterien.<ol>
<li>Überprüfen Sie bei der Positivkontrolle, ob mindestens eine Positivkontrollquelle (O23/O24) Ct-Werte zwischen 22 und 28 für P1- und N1-Sonden erzeugt. Alternativ erzeugen die bekannten positiven Probenvertiefungen (M23/M24) P1- und N1-Ct-Werte <33 auf den P1- und N1-Sonden.</li>
		<li>Überprüfen Sie bei der Negativkontrolle, ob in keinem der beiden Negativkontrollbohrungen (N23/N24) N1- oder P1-Ct-Werte vorhanden sind. Vergewissern Sie sich, dass Ct-Werte gültige Verstärkungskurven aufweisen, bevor Sie die Platte ungültig machen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Interpretation von Stichprobenergebnissen
<ol><li>Bestimmen Sie das Patientenergebnis anhand des Diagramms (Abbildung 3) und melden Sie aufgelöste Proben.<ol>
<li>Bewerten Sie das P1-Ergebnis als GÜLTIG oder UNGÜLTIG. Wenn P1 ein Ergebnis von Ct <33 ergibt, betrachten Sie den Well als VALID und fahren Sie fort, aus N1 zu resultieren. Wenn P1 ein Ergebnis von Ct >=33 oder keinem Ct-Wert ergibt, betrachten Sie die Vertiefung als INVALID.<ol>
<li>Bewerten Sie das N1-Ergebnis als JA, NEIN oder NEIN*. Wenn N1 ein Ergebnis von Ct <33 erzeugt, ist der Brunnen JA. Wenn N1 keinen Ct-Wert erzeugt, ist der Brunnen NO. Wenn N1 eine Ct->=33 erzeugt, ist die Vertiefung NO*. Vergewissern Sie sich, dass alle N1 Ct-Werte einer realen Verstärkungskurve zugeordnet sind. Wenn ein Ct-Wert für N1 keine Verstärkungskurve hat, ist der Brunnen NO.</li>
			<li>Identifizieren Sie Wiederholungsproben (N1 Rerun oder Rerun), kennzeichnen Sie sie mit einer internen Sample-Nummer und einem Sample-Typ und geben Sie sie an den Lade-Workflow zurück (Abschnitt 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laborreinigung
<ol><li>Liquid-Handling-Roboter<ol>
<li>Reinigen Sie alle Seiten mit Desinfektionsmittel mittlerer Ebene. Verwenden Sie kein Ethanol, da es den Kunststoff abbaut.</li>
		<li>Pipettenspitzenende und Abfallbehälter vorsichtig mit einem Alkohol (70% Ethanol oder 100% Isopropanol) abwischen. Wischen Sie Tastatur und Maus nach unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biosicherheitswerkbank<ol>
<li>Reinigen Sie alle Oberflächen mit Desinfektionsmittel auf mittlerer Ebene. Schalten Sie das UV-Licht für 15 Minuten ein.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen. Der im Protokoll beschriebene Assay fällt unter die von der Yale School of Public Health eingereichte SalivaDirect EUA.

Der im Protokoll beschriebene Assay wurde durch eine unabhängige Validierungsstudie bewertet. Es wurde festgestellt, dass der Assay eine Spezifität von 98,9% (1,1% falsch positiv) und eine Sensitivität von 90,0% (10,0% falsch negativ) aufwies, wenn er gegen paarweise Nasopharynxabstriche ausgewertet wurde, die gleichzeitig genommen wurden (n = 837; 817 negative, 20 positiv). Wichtig ist, dass drei Teilnehmer, die positiv mit TigerSaliva und negativ mit einem Nasopharynxabstrich getestet wurden, 48 h später erneut mit Tupfern getestet wurden und positive Ergebnisse lieferten, was darauf hindeutet, dass TigerSaliva in der Lage sein könnte, SARS-CoV-2-Infektionen früher im Krankheitsverlauf zu erkennen.
Wir simulierten positive Speichelproben, indem wir virusfreien Speichel (sowohl wärmebehandelte als auch nicht wärmebehandelte) mit bekannten Konzentrationen von synthetischer SARS-CoV-2-RNA spizierten und eine 10-fache Verdünnung durchführten, um die Ct-Grenze im Speichel zu bestimmen. Das N1-Gen war unter 10.000 Genkopien (ca. Ct = 28) in simulierten positiven Proben nicht nachweisbar. Wir vermuten, dass dies auf den RNase-Abbau oder andere Störfaktoren zurückzuführen ist. Die Wechselwirkung von Speichel-RNasen mit nackter synthetischer RNA unterscheidet sich jedoch wahrscheinlich von der Wechselwirkung mit viralen Partikeln, selbst nachdem sie durch Hitze denaturiert wurden. Positive Speichelproben wurden mit Ct >30 identifiziert und externe Labore erhielten aus diesen Proben genetische Sequenzdaten zu SARS-CoV-2. Wir spekulieren, dass die viralen Proteine in Speichelproben von Patienten vor dem RNA-Abbau schützen.
Der kritischste Schritt im Protokoll ist die Implementierung der Automatisierung für die Master-Mix-Vorbereitung und die Speichelprobenverarbeitung (Abschnitte 4 bzw. 7). Dies ermöglicht überlappende Aufgabenprozesse, was die Durchlaufzeit drastisch reduziert. Ein weiterer kritischer Schritt ist die klinische Ergebnisinterpretation (Abschnitte 11 und 12). Die Festlegung von Zwischenergebniskategorien (Wiederholung und N1-Wiederholung) minimierte auch das Auftreten von nicht schlüssigen Testergebnissen.
Wir zeigten, dass die Variation zwischen manuellen und automatisierten Speichelprobenlademethoden vernachlässigbar ist (Abbildung 5A) und dass die Automatisierung die Reproduzierbarkeit der SARS-CoV-2-Detektion verbessern kann (Abbildung 5B). Automatisierung sollte bevorzugt werden, um das Testen bei der Gestaltung und Erweiterung klinischer Labore zu erleichtern25. Der Labor-Workflow wird durch die Implementierung von roboterautomatisierten Aufgaben verbessert26. Open-Source-Funktionen der Liquid-Handling-Roboter ermöglichen die Implementierung von benutzerdefiniertem Scripting für das Protokolldesign. Dies macht Liquid-Handling-Roboter zu einem kostengünstigen und hochgradig modifizierbaren System im Vergleich zu herkömmlichen klinischen Automatisierungsmethoden. Es ist auch eine ideale Strategie für die Ausführung von sich wiederholenden Laboraufgaben. Die hohe Anpassbarkeit des Systems führt zu der Freiheit, Laborgeräte (z. B. Auffangrohre, Pipettenspitzen oder 384-Well-Platten) im Falle von Engpässen zu ändern. Daher ist die Automatisierung durch den Einsatz von Liquid-Handling-Robotern sowohl für die Überwachung und Forschung im großen als auch im kleinen Maßstab praktikabel.
Ein großer Vorteil dieser Teststrategie ist eine viel kürzere Durchlaufzeit im Vergleich zu anderen klinischen Labors. Der Einsatz von automatisierten Liquid-Handling-Robotern spielt eine Schlüsselrolle bei der Verkürzung der Durchlaufzeit, aber auch der gleichzeitige Einsatz von Robotern und Thermocyclern trägt zur Maximierung der Testeffizienz bei. Ein Roboter und ein Thermocycler sollten als Paar betrieben werden, wobei beide Maschinen zusammen für die ununterbrochene Probenbeladung und die Analyse der Probenergebnisse eingesetzt werden. Sobald ein stetiger Fluss der zugeordneten Proben hergestellt ist, können alle Maschinenpaare gleichzeitig betrieben werden. Der ständige gleichzeitige Einsatz von Robotern und Thermocyclern erhöht die Testkapazität und -effizienz drastisch, was für das hohe Testvolumen von entscheidender Bedeutung ist.
Im Gegensatz zu anderen etablierten SARS-CoV-2 RT-qPCR-Protokollen haben wir einen Touchdown-Schritt in das Thermocycler-Protokoll aufgenommen, um das Abkühlen der Sonde und der Primer-Sets zu den Zielgenen27 zu verbessern, wodurch das Risiko einer fehlgeschlagenen Verstärkung verringert wird. Die Ergebnisse zeigten, dass das Touchdown die Detektion positiver Proben verbesserte, ohne den Verlust einer spezifischen Primerbindung zu riskieren (Tabelle 4). Wir stellten fest, dass eine breite Palette von SARS-CoV-2-RNA-Kopien (Abbildung 4A) und Hs_RPP30 DNA-Kopien (Abbildung 4B) gleichzeitig mit dem RT-qPCR-Assay nachgewiesen werden kann.
Eine Einschränkung von Liquid-Handling-Robotern ist die Möglichkeit einer Kreuzkontamination von positiven Proben während des Speicheltransfers. Speichel ist eine viskoelastische Flüssigkeit28 und kann sich nach der Abgabe von der Pipettenspitze über benachbarte Vertiefungen aneinanderreihen. Darüber hinaus kann die Heterogenität von Speichel29 zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Viruspartikel in der gesamten Probe führen. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit von False Positives und Negatives, was die Bezeichnung von N1 Rerun und Rerun Samples erforderlich macht. 14,1 % der Proben, die ursprünglich als N1 Rerun bezeichnet wurden, lösten sich jedoch als positiv für SARS-CoV-2 auf und waren mehr als 30-mal wahrscheinlicher als bei Rerun-Proben, dass sie nach erneuten Tests als positiv abklingen. Folglich ermöglichte die Unterscheidung zwischen Rerun und N1 Rerun (Abbildung 3) eine genauere Trennung potenziell positiver Proben, wodurch die Sensitivität und Spezifität unseres diagnostischen Assays erhöht wurde. Andere resultierende Parameter für diagnostische Speicheltests machten diese Unterscheidung nicht12,14,24,30,31.
Speichelproben können aufgrund von Heterogenität und Viskosität schwer zu pipettieren sein32. Die Wärmebehandlung denaturiert Proteine in der Speichel-Biomatrix angemessen, reduziert die Viskosität und eliminiert den Bedarf an RNA-Extraktionsreagenzien9, die in den frühen Stadien der Pandemie knapp waren10. Die erweiterte Wärmebehandlung inaktiviert auch vorhandene Viren33, was eine Laborverarbeitung bei niedrigeren Biosicherheitsniveaus ermöglicht. Folglich wurde eine hitzebasierte RNA-Extraktion (beschrieben in Abschnitt 5.4) implementiert, um die Viskosität durch Proteindenaturierung zu verringern (Abbildung 6). Basierend auf den Ergebnissen postulieren wir, dass die Wärmebehandlung neben der Denaturierung der Protein-Biomatrix auch Speichelproben homogenisieren kann. Andere Gruppen kombinierte Wärmebehandlung und Proteinase K Behandlung zur Erhöhung der Homogenität9,14,34. Wir haben uns entschieden, diesen Schritt nicht umzusetzen, da er Virionproteine mit einer Rate denaturieren kann, die virale RNA dem Wärmeabbau aussetzt35. Darüber hinaus kann die Probenverdünnung mit Proteinase K positive Proben mit weniger Viruspartikeln maskieren, wodurch die Empfindlichkeit verringert wird. Darüber hinaus wurden die Assay-Ergebnisse mit einem kommerziell erhältlichen Speichel-basierten SARS-CoV-2-Assay (Logix Smart COVID-19) verglichen, der eine magnetische Perlen-RNA-Extraktion verwendet (Tabelle 5). Es wurde festgestellt, dass der aktuelle Assay im Vergleich zum kommerziell erhältlichen Assay besser geeignet war, schwach positive Proben nachzuweisen.
Es ist schwierig, die Anzahl der Viruskopien im Speichel nur mit RT-qPCR zu quantifizieren, da die qPCR semi-quantitativ ist. Es gibt inhärente Unterschiede zwischen den Ct-Werten, die auf technische Einschränkungen zurückzuführen sind. Die Genkopienzahl kann aus Ct-Werten bestimmt werden (Abbildung 4) und entspricht in etwa der viralen Kopienzahl. Eine mögliche Lösung zur Bestimmung der viralen Kopienzahl in Speichelproben ist die ddPCR, die eine harte Quantifizierung von Genkopien in der Reaktion ermöglicht. Wir glauben jedoch, dass es angemessen ist, Klinikern qualitative Ergebnisse zu liefern, und der relative virale Gehalt kann über Proben hinweg verglichen werden, die mit unseren Methoden verarbeitet werden.
Trotz einiger Einschränkungen, die sich bei der Verwendung von Speichel ergeben, erweist sich der SARS-CoV-2-Assay durch speichelbasierte RT-qPCR als effektive Methode für den schnellen und zuverlässigen Nachweis viraler RNA in jeder Testskala. Dies gilt insbesondere in Verbindung mit dem Einsatz von Open-Source-Liquid-Handling-Systemen. Dieser Testansatz kann modifiziert werden, um andere für die Diagnostik relevante Nukleinsäuresequenzen wie Infektionserreger, Krankheitsmarker oder andere Viren nachzuweisen. Dies macht den Assay sowohl für klinische als auch für Forschungsdiagnosebemühungen anwendbar.

Das schwere akute respiratorische Syndrom-assoziierte Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), ein neuartiges Coronavirus, trat Ende 2019 auf und breitete sich schnell in der Weltbevölkerung aus1. Die SARS-CoV-2-Infektion verursacht die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), eine hochansteckende Krankheit mit potenziell schweren Atemwegs- und Entzündungssymptomen. Eine hohe Übertragbarkeit in Verbindung mit einer niedrigen Mortalität deutete darauf hin, dass sich das Virus rasch in den Populationen ausbreiten und verstärkte diagnostische Tests erfordern würde2,3. In den Empfehlungen im Bereich der öffentlichen Gesundheit wurde ein breit angelegtes Bevölkerungsscreening gefördert, um Fälle zu isolieren und anschließend die Übertragungsraten zu senken4,5,6. Darüber hinaus zeigten Modelle der Bevölkerungsüberwachung, dass die Erhöhung der Testhäufigkeit und die Verringerung der Meldezeit einen größeren Effekt auf die Verringerung der Übertragung hatten als die Erhöhung der Testempfindlichkeit7. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass infizierte Personen früher unter Quarantäne gestellt werden könnten, wodurch Infektionsketten unterbrochen werden.
Der ursprüngliche Standard für Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) waren Nasopharynxabstriche (NP), die von RT-qPCR8 verarbeitet wurden. Bei dieser Form des Testens für sehr große Populationen treten jedoch Komplikationen auf, wie z. B. erhöhte relative Kosten und verschärfter Druck in der Lieferkette9,10. Darüber hinaus sind sowohl die Probensammlung als auch die Verarbeitung gängiger NAAT-Methoden (einschließlich NP-Tupfer, Oropharynxabstriche, Mittelturbinatabstriche und Nasenabstriche) auf spezielle Ausrüstung, Reagenzien und medizinisches Personal angewiesen9,10.
Ein geeigneter Ersatz für NP-Tupfer RT-qPCR-Tests sind Speichel-basierte Tests, die ein genaues Diagnosewerkzeug für den SARS-CoV-2-Nachweis sind11,12,13,14. Die direkte Durchführung der RT-qPCR an Speichelproben ergibt eine ähnliche Sensitivität und Spezifität wie NP-Tupfer15. Ein großer Vorteil der Speichelprüfung gegenüber der NP-Tupferprüfung besteht darin, dass sie die Selbstentnahme von Proben ermöglicht16. Dies minimiert den Bedarf an medizinischem Personal und maximiert die einfache Probenentnahme für Patienten, da es weniger invasiv ist als NP-Abstriche. Da Speichelproben keine Puffer benötigen, um die Probe aus einem Tupfer zu entfernen (wie im Fall von NP-Proben), können speichelbasierte Tests die hitzebasierte Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion direkt nutzen, was die Testkosten senkt, indem zusätzliche Puffer, Transportmedien und/oder RNA-Extraktionsreagenzien überflüssig werden14,17.
Das Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab wurde eingerichtet, um den Bedarf der Universität an COVID-19-Tests und -Überwachung zu decken. In geschlossenen Bevölkerungsgruppen, einschließlich Universitäten, führten häufige Überwachungstests in Verbindung mit sozialer Distanzierung zu den günstigsten Ergebnissen in epidemiologischen Modellen der Krankheitsprävalenz18. Die konsolidierten Protokolle CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 und SalivaDirect14 wurden angepasst, und die Automatisierung wurde im klinischen Workflow eingesetzt, um die Kosten zu senken und die Durchlaufzeit zu verbessern. Frühere Gruppen hatten Open-Source-Liquid-Handling-Roboter für SARS-CoV-2-RNA-Extraktionsschritte20,21 verwendet, aber wir haben den Einsatz der Roboter zur Vorbereitung von Testplatten und Ladeproben maximiert22. Hier zeigen wir, dass das angepasste Protokoll und der Einsatz von Open-Source-Liquid-Handling-Systemen (Abbildung 1) eine schnelle und genaue speichelbasierte RT-qPCR ermöglicht und eine effektive Strategie für die groß angelegte Überwachung der öffentlichen Gesundheit darstellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

Das Aufkommen der jüngsten globalen Gesundheitskrise SARS-CoV-2 stellte die epidemiologische Forschung und klinische Tests vor zentrale Herausforderungen. Die COVID-19-Pandemie, die durch eine hohe Übertragungsrate und eine niedrige Mortalität gekennzeichnet ist, erforderte genaue und effiziente diagnostische Tests, insbesondere in geschlossenen Bevölkerungsgruppen wie Wohnuniversitäten. Die anfängliche Verfügbarkeit von Nukleinsäuretests, wie Nasopharynxabstrichen, war aufgrund des Drucks in der Lieferkette, der auch die Meldung der Testergebnisse verzögerte, begrenzt. Speichelbasierte quantitative Transkriptase-Kettenreaktion (RT-qPCR) -Tests haben gezeigt, dass sie in Sensitivität und Spezifität mit anderen Testmethoden vergleichbar sind, und die Speichelentnahme ist für die Teilnehmer weniger physikalisch invasiv. Aus diesem Grund haben wir einen multiplen RT-qPCR-Diagnoseassay für die Bevölkerungsüberwachung der Clemson University und der umliegenden Gemeinde entwickelt. Der Assay verwendete Open-Source-Liquid-Handling-Roboter und Thermocycler anstelle komplexer klinischer Automatisierungssysteme, um den Workflow und die Systemflexibilität zu optimieren. Die Automatisierung der speichelbasierten RT-qPCR ermöglicht den schnellen und genauen Nachweis einer Vielzahl von viralen RNA-Konzentrationen für große und kleine Testanforderungen. Der durchschnittliche Turnaround für das automatisierte System betrug < 9 h für 95% der Proben und < 24 h für 99% der Proben. Die Kosten für einen einzelnen Test betrugen 2,80 US-Dollar, wenn alle Reagenzien in großen Mengen gekauft wurden.

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Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Das Protokoll beschreibt eine SARS-CoV-2-Diagnosemethode, die Open-Source-Automatisierung nutzt, um RT-qPCR-molekulare Tests von Speichelproben durchzuführen. Dieser skalierbare Ansatz kann sowohl auf die klinische Überwachung der öffentlichen Gesundheit als auch auf die Erhöhung der Kapazität kleinerer Universitätslabors angewendet werden.

Effiziente SARS-CoV-2 quantitative Reverse Transkriptase PCR Speicheldiagnostikstrategie unter Verwendung von Open-Source-Pipettierrobotern

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Wir haben einen kostengünstigen, speichelbasierten COVID-19-Diagnosetest und -workflow entwickelt, der für groß angelegte Community-Screening-Anwendungen einfach zu implementieren und zu skalieren ist. Hier verwenden wir Open-Source-Liquid-Handling-Roboter, Standard-Thermocycler und Software, um direkte Speicheltests ohne Extraktions- oder Stabilisierungspuffer durchzuführen und gleichzeitig genaue Diagnoseergebnisse zu liefern. Aufgrund der einfachen automatisierten parallelen Workflows kann das System so skaliert werden, dass täglich Tausende von Tests mit minimalem Ausrüstungs-, Platz- und Personalbedarf durchgeführt werden können.Neben Kylie King werden Rachel Ham, unsere klinische Laborleiterin, und Austin Smothers, unsere Bildungskoordinatorin, helfen, das Verfahren zu demonstrieren Beginnen Sie mit der Dekontamination der Außenseite der Speichelsammelröhrchen mit 70% Ethanol und der Übergabe an das Labor zum Testen. Zeichnen Sie die Probenankunft auf, indem Sie jeden Proben-Barcode in die tägliche Aufnahmetabelle scannen. Behandeln Sie die Scanproben 30 Minuten lang in einem 95 Grad Celsius-Ofen und entfernen Sie die Proben dann mit hitzebeständigen Handschuhen.Öffnen Sie die täglichen Probenladetabellen für jeden Probenladeroboter an der Probenzuordnungsstation. Weisen Sie dann jeder 384-Bohrlochplatte 188 Proben zu. Etikettenablagen mit Plattenname, Datum und Viertelnummer.Scannen Sie die Proben der Reihe nach in die Probenladetabelle. Stellen Sie an der Probenladestation zwei komplette Sätze von acht 3D-gedruckten Racks auf, die der Deckplatzierung im Roboter entsprechen. Lösen Sie die Kappe der Quarter-One-Tubes und legen Sie sie in 3D-gedruckte Racks, beginnend mit der Position A1 im ersten Rack.Füllen Sie jedes Rack von links nach rechts und von oben nach unten. Setzen Sie dieses Lademuster in Rack zwei fort und fahren Sie dann mit den Racks vier und fünf fort. Platzieren Sie geladene Viertel-Eins-Probenregale auf Decks eins, zwei, vier, fünf, sieben, acht, 10, 11.Platzieren Sie P20-Tipps auf den Decks drei und neun. Um den Rüstvorgang zu vereinfachen, laden Sie Materialien von hinten nach vorne in den Roboter. Die Master-Mixplatten werden auf einem speziellen Roboter produziert und bei vier Grad Celsius gelagert.Eine Platte wird jeweils verwendet und ist mit dem Plattennamen beschriftet, und eine scharfe Klinge wird verwendet, um eine Linie in der Folie um die Steuerbrunnen zu schneiden. Legen Sie die Master-Mixplatte auf Deck sechs und ziehen Sie die Folienabdeckung ab, wobei das kleine Rechteck, das die Steuerschächte bedeckt, zurückbleibt. Entdecken Sie die Tip-Boxen und schließen Sie den Roboter.Initialisieren Sie das benutzerdefinierte Python-Betriebsprotokoll, indem Sie auf Start run through the robot desktop application klicken. Jedes Viertel benötigt 24,5 Minuten, um auf die Platte geladen zu werden. Legen Sie einen Timer als Erinnerung fest.Während der Roboter läuft, öffnen Sie die Kappe und laden Sie viertel zwei Probenröhrchen in den zweiten Satz 3D-gedruckter Racks. Wenn der Roboter pausiert, entfernen Sie die Quarter-One-Racks und ersetzen Sie sie durch die Quarter-Two-Racks, und klicken Sie dann in der Desktop-Anwendung auf Resume Run. Fassen Sie die ersten Probenröhrchen zusammen und lagern Sie sie in einem Kühlschrank mit vier Grad Celsius, während Sie auf die Ergebnisse warten.Wiederholen Sie diesen Ladevorgang für die Quartale drei und vier. Überführen Sie die beladene Platte in eine Biosicherheitswerkbank. Um die Kontamination zu minimieren, halten Sie die Platte während des Transfers bedeckt.Sammeln Sie alle Wiederholungsproben und weisen Sie sie als letzte Proben im vierten Quartal zu. Nummerieren Sie die Proben, scannen Sie die Barcodes und geben Sie den ursprünglichen Probenort und das Ergebnis in die Probenladetabelle ein. Überführen Sie die Wiederholungsproben in die Biosicherheitskabine.Laden Sie die Wiederholungsprobenröhrchen nicht in die Roboterladegestelle. Pipettieren Sie zwei Mikroliter jeder Wiederholungsprobe zu den richtigen Vertiefungen. Verwenden Sie die dafür vorgesehene Pipette zum Hinzufügen von Patientenproben.Halten Sie die Kontrollbrunnen mit Folie bedeckt, während Sie Proben hinzufügen, um die Kontamination zu minimieren. Ziehen Sie die Folienabdeckung über den Kontrollvertiefungen mit einer Pinzette ab. Pipette zwei Mikroliter bestätigter positiver Patientenproben in die Vertiefungen M23 und M24.Pipettieren Sie zwei Mikroliter nukleasefreies Wasser zu den Brunnen N23 bis N24 und zwei Mikroliter von 200 Kopien pro Mikroliter gemischter positiver Kontrolle zu den Brunnen O23 bis O24. Lassen Sie die Vertiefungen P23 bis P24 leer, um die Qualität der Master-Mix-Chargen zu überwachen. Decken Sie die Platte mit einer optisch klaren Abdichtung ab und verwenden Sie die Applikatorwalze, um die Dichtung an allen Vertiefungen festzuhalten.Wirbeln Sie die Platte bei 2, 500 U / min für 30 Sekunden, um gründlich zu mischen, und zentrigrieren Sie dann die Platte bei 500 mal G für eine Minute. Wählen Sie das Protokollprogramm in der Thermocycler-Software aus und speichern Sie das Protokoll für zukünftige Platten. Legen Sie die versiegelte Platte in den Thermocycler und führen Sie das Protokoll aus.Exportieren Sie CT-Werte, und kopieren Sie die Werte in die Beispiel-Ladetabelle. Überprüfen Sie bei der Positivkontrolle, ob mindestens eine Positivkontrollquelle CT-Werte zwischen 22 und 28 für P1- und N1-Sonden erzeugt. Alternativ erzeugen die bekannten positiven Probenvertiefungen P1- und N1-CT-Werte von weniger als 33 auf den Sonden P1 und N1.Überprüfen Sie bei der Negativkontrolle, ob in keiner der beiden Negativkontrollquellen N1- oder P1-CT-Werte vorhanden sind. Vergewissern Sie sich, dass CT-Werte gültige Verstärkungskurven aufweisen, bevor Sie die Platte ungültig machen. Wenn P1 ein Ergebnis von CT kleiner als 33 ergibt, betrachten Sie den Brunnen als gültig und fahren Sie fort, um von N1 zu resultieren. Wenn P1 ein Ergebnis von CT erzeugt, das größer oder gleich 33 oder kein CT-Wert ist, betrachten Sie den Well als ungültig.Wenn N1 ein Ergebnis von CT weniger als 33 erzeugt, beurteilen Sie den Brunnen als ja. Wenn N1 keinen CT-Wert erzeugt, bewerten Sie den Brunnen als nein. Wenn N1 einen CT-Wert größer oder gleich 33 erzeugt, bewerten Sie den Brunnen als keinen Stern.Vergewissern Sie sich, dass alle N1-CT-Werte einer realen Verstärkungskurve zugeordnet sind. Wenn ein CT-Wert für N1 keine Verstärkungskurve hat, ist der Brunnen nein. Identifizieren Sie die wiederholten Proben, kennzeichnen Sie sie mit einer internen Stichprobennummer und einem Probentyp und geben Sie sie an den Ladeworkflow zurück.Die repräsentativen Bilder zeigen den RTQ PCR-Nachweis von N1 oder SARS CoV-2 synthetischer RNA und P1 oder HSRPP30 synthetischer DNA. Standardkurven wurden mit Standardabweichungen gezeichnet, um den Bereich der genauen Detektion mit dieser Sondenprimerkombination zu bestimmen. Die mittleren CT-Werte, die in den jeweiligen Verdünnungen erhalten wurden, wurden gegen die geschätzte Menge an synthetischer RNA und synthetischer DNA aufgetragen.In beiden Fällen zeigten die linearen Kurven gute Korrelationskoeffizienten über einen weiten Bereich von Genkopienkonzentrationen. N1-CT-Werte, die aus einzigartigen Proben sowohl unter Verwendung der Roboter- als auch der manuellen Probenbeladung erhalten wurden, wurden transponiert, um die Inter-Assay-Variabilität zwischen der manuellen und der Roboterbeladung zu bestimmen. Die lineare Beziehung zwischen den manuellen und automatisierten Methoden führte zu einem hohen Korrelationskoeffizienten, der darauf hindeutet, dass beide Methoden funktional gleichwertig sind.Die Intra-Assay-Variabilität wurde auch unter Verwendung transponierter replizierter N1-CT-Werte bestimmt, die sowohl aus dem Roboter als auch aus der manuellen Probenbeladung erhalten wurden. Hier wird die Bewertung von Wärmebehandlungsmethoden zur Viskositätsreduktion im Speichel gezeigt. SARS CoV-2 negativer Speichel wurde aus einer einzigen Quelle gesammelt und Aliquots wurden entweder für null Minuten, 30 Minuten oder 60 Minuten bei 95 Grad Celsius wärmebehandelt.P1-CT-Werte aus technischen Replikaten jeder Bedingung wurden aufgetragen, um die Variabilität zwischen den Behandlungsmethoden zu bestimmen. Sowohl 30-minütige als auch 60-minütige Wärmebehandlungsmethoden führten zu einer signifikant verringerten Probenvariabilität im Vergleich zu keiner Behandlungskontrolle. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen 30-minütigen und 60-minütigen Behandlungen.Daher wurde die 30-minütige Wärmebehandlungsmethode implementiert, um die Bearbeitungszeit zu reduzieren. Verwenden Sie die richtige aseptische Technik, um die Kontamination der Prüfplatten zu minimieren, insbesondere beim Laden manueller Proben und Kontrollen. Vermeiden Sie es, den Teller mit den Händen oder Ärmeln zu überqueren.Nachdem klinische Ergebnisse vorliegen, können Proben in biogefährlichen Abfällen entsorgt oder für weitere Analysen aufbewahrt werden, z. B. für die Sequenzierung des gesamten Genoms, um bestimmte Stämme zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht breit angelegte Community-Tests, die es uns ermöglichen, die Auswirkungen der Testabdeckung und die nicht-symptomatische Ausbreitung von Covid 19 zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Ein schneller Multiplex-Dual-Reporter-IgG- und IgM-SARS-CoV-2-Neutralisationsassay für ein multiplexed Bead-basiertes Durchflussanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Nachweis eines SARS-CoV-2-Rezeptor-bindenden Domänenantikörpers mit einem HiBiT-basierten Bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...