Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

המחברים מודים להנהלתו של קלמסון, לצוות הרפואי ולעובדי המעבדה הקלינית במעבדת REDDI שעזרו ליישם ולנהל את בדיקות SARS-CoV-2. אנו מודים לד"ר פיליפ באקהולטס ולד"ר קרולין בניסטר מאוניברסיטת דרום קרוליינה על ייעוץ ראשוני לפרויקטים וקשרים בתעשייה לרכישת ציוד. אנו מודים לסטודנטים, פרופסורים ואנשי צוות רבים על עזרתם באיסוף דגימות. תודה לתלמידי חקירה יצירתית על איסוף נתוני עקומה סטנדרטית. המימון למחקר זה התקבל ממענק המכונים הלאומיים לבריאות P20GM121342 (הוענק ל- DD ו- LGP), מחלקת האתלטיקה של קלמסון, סגן נשיא אוניברסיטת קלמסון למחקר, ומושל דרום קרוליינה & ועדת ביקורת אג"ח משותפת.

כל המחקרים בוצעו בהתאם לאוניברסיטת קלמסון ולוועדות הביקורת המוסדית לבריאות פריזמה (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 ביולי 2020).
1. התקנה של רובוט טיפול בנוזל בקוד פתוח
<ol><li>התקן מודולי סינון אוויר חלקיקי (HEPA) בעלי יעילות גבוהה (ראה טבלת חומרים) בחלק העליון של כל רובוט שמטפל בנוזלים בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>צרף פיפטה P20 8 ערוצים להרכבה השמאלית של רובוטי הכנת צלחת המיקס הראשית בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>חברו פיפטה P20 להרכבה הימנית של רובוטי הטעינה לדוגמה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>הורד את סקריפטים מותאמים אישית Python (קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2) במחשבים המתאימים.</li>
	<li>פתח את TigerSaliva Full 384 Loading.py ביישום שולחן העבודה בדגימת טעינת מחשבים רובוטיים. לחץ על כיול והגדר הן את הפיפטה והן את התוכנית לפי הוראות התוכנה.</li>
	<li>פתח את 12 Plates.py מלא ביישום שולחן העבודה במחשב הרובוט הראשי Mix. לחץ על כיול והגדר הן את הפיפטה והן את התוכנית לפי הוראות התוכנה.</li>
	<li>הדפס ארונות תקשורת לדוגמה מותאמים אישית עם מדפסת תלת-ממדית תלת-ממדית (3D) מותכת עם קובץ עיצוב (CAD) בעזרת מחשב (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). הדפס 16 ארונות תקשורת לכל רובוט טעינה לדוגמה, עבור שני סטים של שמונה מתלים.</li>
</ol>2. הכנה של 20x מולטיפלקס N1 + P1 בדיקה / תערובת פריימר
<ol><li>הכן אצווה של 20x מולטיפלקס N1 + P1 בדיקה / פריימר לערבב (נפח כולל של 20 מ"ל, טבלה 1) בצינור חרוטי 50 מ"ל בסביבה סטרילית הרחק SARS-CoV-2 RNA סינתטי או דגימות המטופל.</li>
	<li>Aliquot 1.6 מ"ל של התערובת באמצעות פיפטה סרולוגית לתוך צינורות צנטריפוגה סטריליים 2.0 מ"ל תווית כראוי.</li>
	<li>יש לאחסן את האליקוטים במקפיא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד לקבלת אפשרות מוכנה לשימוש.</li>
</ol>3. הכנת תערובת שליטה חיובית
הערה: אין ליצור תערובת שליטה חיובית באותה סביבה סטרילית כמו תערובת בדיקה/פריימר או רכיבי תערובת ראשיים אחרים. יש להשתמש במיכל נפרד של מים ללא נוקלאז.
<ol><li>לדלל SARS-CoV-2 RNA סינתטי (N1) מ 1,000,000 עותקים גנים / μL (cpμ) ל 10,000 cpμ על ידי הוספת 10 μL של פתרון מלאי 990 μL של מים ללא נוקלאז. Aliquot 25 μL של 10,000 cpμ לתוך צינורות סטריליים 0.2 מ"ל תווית כראוי. יש לאחסן את ה-aliquots שאינם בשימוש בטמפרטורה של -80°C. הערה: יש לאחסן RNA סינתטי בטמפרטורה של -80°C כדי למנוע השפלה.</li>
	<li>לדלל Hs_RPP30 DNA סינתטי (P1) מ 200,000 cpμ ל 10,000 cpμ על ידי הוספת 50 μL של פתרון מלאי למים 950 μL ללא נוקלאז. Aliquot 25 μL של 10,000 cpμ לתוך צינורות סטריליים 0.2 מ"ל תווית כראוי. יש לאחסן את ה-aliquots שאינם בשימוש בטמפרטורה של -80°C.</li>
	<li>לדלל כל רכיב לריכוז סופי של 200 cpμ על ידי הוספת 20 μL של SARS-CoV-2 ו- Hs_RPP30 10,000 מניות cpμ ל 960 μL של מים ללא נוקלאז, עבור סך של 1000 μL. Aliquot 20 μL של מעורב 200 cpμ שליטה חיובית לתוך 0.2 mL צינורות תווית כראוי. יש לאחסן aliquots בטמפרטורה של -80°C עד לקבלת מוכנות לשימוש.</li>
</ol>4. הכנת צלחות תערובת מאסטר
הערה: צרו תערובת ראשית בסביבה סטרילית הרחק מרנ"א סינתטי של SARS-CoV-2 או מדגימות מטופלים. כל הרכיבים חייבים להיות מופשרים לחלוטין לפני הוספת לתערובת; ללא הפשרה מתאימה, הריכוזים עשויים להיות שגויים. הפשרה לקויה מסומנת על ידי נוכחות של קרח או צבע לא אחיד של ריאגנטים. יש לאחסן על בלוק מקפיא בעת הכנת התערובת.
<ol><li>הכן אצווה של תערובת מאסטר מולטיפלקס (נפח כולל של 48 מ"ל, טבלה 2) בצינור חרוטי 50 מ"ל.</li>
	<li>הומוגניזציה התערובת על ידי הפיכת הצינור מעל 3x. אין לערבב על ידי צנרת למעלה ולמטה או מערבולת כמו זה יפגע באנזים.</li>
	<li>מלאו עמודים 1-4 של מאגר באר סטרילי בעומק 96-באר על ידי העברת 1.48 מ"ל של תערובת מאסטר לכל באר. חרוטי אחד 50 מ"ל ממלא ארבעה עמודים, מספיק עבור 12 צלחות.</li>
	<li>מכסים את המאגר העמוק עם אטם רדיד אלומיניום ומניחים אותו ברובוט הטיפול בנוזלים של תערובת מאסטר ייעודית. מניחים את מאגר הבאר העמוקה המלאה על סיפון 10, מניחים שש צלחות ריקות של 384 בארות על סיפונים 1-6, ואת תיבת הקצה P20 על סיפון 11. לחשוף את צלחת הבאר העמוקה ותיבות קצה ולסגור את הרובוט.</li>
	<li>אתחל את פרוטוקול ההפעלה המותאם אישית של Python על-ידי לחיצה על התחל הפעלה ביישום שולחן העבודה של הרובוט.</li>
	<li>לאחר 40 דקות, הריצה תושהה. כסו את 384 לוחות הבאר המלאים עם אטמי נייר כסף בזמן שהם נשארים ברובוט ולחצו עם הרולר כדי להבטיח דבקות. סמן את הקצה של כל צלחת באמצעות מזהה אצווה.</li>
	<li>מקם שש לוחות ריקים חדשים של 384 בארות על סיפונים 1-6 וחדש את פרוטוקול ההפעלה על-ידי לחיצה על המשך הפעלה. לאחר השלמת הריצה, לכסות את הסט הסופי של 384 לוחות היטב עם חותמות רדיד.</li>
	<li>Pipette 2 μL של תערובת המאסטר הנותרת לעמודים 1-3 ו 22-24 של צלחת ריקה 384-well לבקרת איכות אצווה. לאטום עם חותם ברור אופטי ולהפעיל על התרמוציקלר (סעיף 10.1-10.2). אם לבארות כלשהן יש ערכי מחזור סף N1 (Ct) או אם ליותר מ- 10 בארות יש ערכי P1 Ct, האצווה מזוהמת ולא ניתן להשתמש בה.</li>
	<li>יש לאחסן את צלחות התערובת המוכנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בהן תוך 7 ימים ממועד ההכנה.</li>
</ol>5. איסוף מדגם, צריכה וטיפול בחום
<ol><li>הנחו את המשתתפים להימנע מאכילה, שתייה, עישון או היגיינת שיניים 30 דקות לפני איסוף הרוק. להנחות את המשתתפים לאסוף לפחות 1 מ"ל של רוק כי באופן טבעי בריכות בפה ולהפקיד אותו לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל ללא חומרים משמרים, ולאחר מכן לכסות את הצינור (קובץ משלים 3).</li>
	<li>לטהר את החלק החיצוני של צינורות איסוף רוק עם 70% אתנול או חיטוי מגבונים ולהעביר אותם למעבדה לבדיקה.</li>
	<li>רשום הגעה לדוגמה על-ידי סריקת כל ברקוד לדוגמה בגיליון האלקטרוני של הצריכה היומית (קובץ משלים 4).</li>
	<li>יש לטפל בחום בדגימות הסרוקות במשך 30 דקות בתנור בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. יש להסיר דגימות בעת לבישת כפפות עמידות בחום. הערה: דגימות לא מטופלות יציבות בטמפרטורת החדר (23 °C (60 °F) עבור עד 72 שעות. לאחר טיפול בחום, דגימות חייב להיות מאוחסן ב 4 °C (60 °F), אם לא מעובד באופן מיידי.</li>
</ol>6. הקצאה לדוגמה
<ol><li>פתח את הגיליונות האלקטרוניים היומיים של טעינת מדגם עבור כל רובוט טעינה לדוגמה (קובץ משלים 5) במחשב בתחנת הקצאת הדגימה.</li>
	<li>הקצה 188 דגימות לכל צלחת 384-well כדלקמן: דגימות 1-48 נחשבות לרבעון 1, דגימות 49-96 נחשבות לרבע 2, דגימות 97-144 נחשבות לרבע 3, ודגימות 145-188 נחשבות לרבע 4. המדגם מנותח בכפילות.</li>
	<li>מגשי תוויות עם שם צלחת, תאריך ומספר רבעון. סרוק את הדגימות לפי הסדר לתוך גיליון העבודה של טעינת הדגימה לדוגמה. הערה: ייתכן שיהיה צורך להפעיל באופן ידני דוגמאות מלוחות קודמים, כפי שהוגדר באיור 3. עיין בסעיפים 8.1-8.3 לקבלת הוראות הקצאה וטעינה ידניות לדוגמה.</li>
</ol>7. הפעלת רובוטים לטעינת מדגם
<ol><li>בתחנת הטעינה לדוגמה, בשורה שני סטים מלאים של שמונה מתלים מודפסים 3D המתאים למיקום הסיפון ברובוט.</li>
	<li>בטלו את התקלה בצינורות רבע 1 והניחו אותם במתלים מודפסים בתלת-ממד, החל ממיקום A1 בארון תקשורת 1. מלאו כל ארון תקשורת משמאל לימין ומלמעלה למטה. המשיכו בתבנית טעינה זו בארון תקשורת 2, ולאחר מכן המשיכו למתלים 4 ו-5 (עיינו באיור 2C). הערה: ארונות תקשורת אינם ממוספרים ברציפות עקב הפרמטרים של תוכנית הרובוטים.</li>
	<li>מקם מתלים טעונים רבע 1 מדגם על סיפונים 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. מניחים טיפים P20 על סיפונים 3 ו -9. כדי לפשט את תהליך ההגדרה, טען חומרים מהחלק האחורי לחזית לתוך הרובוט.</li>
	<li>קח צלחת תערובת מאסטר מוכנה מראש מן 4 °C (60 °F), לתייג אותו עם שם צלחת ולהשתמש להב חד לחתוך קו בנייר כסף סביב בארות הבקרה (N23/24, O23/24, ו P23/24).</li>
	<li>מניחים את צלחת התערובת הראשית על סיפון 6 ומקלפים את כיסוי נייר הכסף, ומשאירים מאחור את המלבן הקטן המכסה את בארות הבקרה. לחשוף את תיבות הקצה ולסגור את הרובוט.</li>
	<li>אתחל את פרוטוקול ההפעלה המותאם אישית של Python על-ידי לחיצה על התחל הפעלה דרך יישום שולחן העבודה הרובוטי. כל רבעון לוקח 24.5 דקות כדי לטעון על הצלחת; הגדר שעון עצר כתזכורת.</li>
	<li>בזמן שהרובוט פועל, שחררו וטענו את צינורות הדגימה של רבע 2 לקבוצה השנייה של מתלים מודפסים בתלת-ממד כמתואר בסעיף 7.2.</li>
	<li>כאשר הרובוט עוצר, הסר את המתלים של רבע 1 והחלף אותם במתלים רבע 2. לחץ על חדש הפעלה ביישום שולחן העבודה.</li>
	<li>סכום רבע 1 צינורות מדגם ולאחסן אותם במקרר 4 °C (4 °F) בזמן ההמתנה לתוצאות. חזור על תהליך טעינה זה עבור רבעים 3 ו- 4.</li>
	<li>מעבירים את הצלחת הטעונה לארון בטיחות ביולוגית. כדי למזער את הזיהום, יש לשמור על צלחת מכוסה במהלך ההעברה.</li>
</ol>8. טעינה ידנית מדגם
הערה: בצע הפעלה ידנית אחת בדגימות חוזרות (N1 שידור חוזר או הפעלה חוזרת, ראה איור 3) במקרה של טעינה רובוטית לקויה.
<ol><li>אסוף דגימות חוזרות והקצה אותן כדוגמאות האחרונות ברבעון 4 (ראה סעיף 6.2). מספר דוגמאות, סרוק את הברקודים והזן את המיקום לדוגמה המקורי והתוצאה היא גיליון העבודה לטעינת הדגימה לדוגמה.</li>
	<li>העבר דגימות חוזרות לארון הבטיחות הביולוגית. אין לטעון צינורות מדגם חוזרים למתלי הטעינה של הרובוטים.</li>
	<li>Pipette 2 μL של כל מדגם חוזר לבארות הנכונות בעקבות דיאגרמת פריסת הלוח (קובץ משלים 6). השתמש בפיפטה ייעודית להוספת דגימות מטופלים. שמור על בארות בקרה מכוסות בנייר כסף תוך הוספת דגימות כדי למזער את הזיהום.</li>
</ol>9. הוספת פקדים ללוחות בדיקה
<ol><li>לקלף את כיסוי נייר הכסף מעל בארות בקרה באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>Pipette 2 μL של מים ללא נוקלאז (ללא בקרת תבנית) לבארות N23-N24 ו 2 μL של 200 cpμ שליטה חיובית מעורבת (עיין בסעיף 3) לבארות O23-O24. פיפטה 2 μL של שליטה מדגם חולה חיובי מאושר לתוך בארות M23-M24 כמו בקרה נוספת. השאר בארות P23-P24 ריק כדי לפקח על איכות אצוות תערובת מאסטר.</li>
	<li>לכסות את הצלחת עם חותם ברור אופטית ולהשתמש רולר אפליקטור כדי לדבוק חותם לכל הבארות. מערבולת את הצלחת ב 2500 סל"ד במשך 30 שניות לערבב ביסודיות. צנטריפוגה הצלחת ב 500 x g במשך 1 דקה.</li>
</ol>10. ביצוע RT-qPCR
<ol><li>צור תוכנית פרוטוקול בתוכנת התרמו-מחזור בהתאם לתנאים המתוארים (טבלה 3). שמור את הפרוטוקול עבור לוחות עתידיים. מניחים את הצלחת האטומה בתרמוציקלר ומפעילים את הפרוטוקול.</li>
	<li>יצא ערכי Ct כקובץ .xslx והעתק את הערכים לגיליון האלקטרוני של הטעינה לדוגמה (קובץ משלים 5). הערה: גליונות אלה תוכננו בהתאמה אישית עבור קבצי פלט Ct מתוכנות היצרן וייתכן שיהיה צורך בשינוי כדי לקבל תבניות אחרות.</li>
</ol>11. קביעת תוקף הלוח
<ol><li>אמת הן את הפקד החיובי והן את הדגימות החיוביות הידועות ו/או את הפקד השלילי כדי לשקול את תוצאות הלוחות כחוקות. להעריך את בארות הבקרה עם הקריטריונים הבאים.<ol>
<li>לשליטה חיובית, בדוק אם לפחות בקרה חיובית אחת (O23/O24) מייצרת ערכי Ct של בין 22-28 עבור בדיקות P1 ו- N1. לחלופין, בארות המדגם החיוביות הידועות (M23/M24) מייצרות ערכי P1 ו- N1 Ct <33 בבדיקות P1 ו- N1.</li>
		<li>לשליטה שלילית, ודא שאין ערכי N1 או P1 Ct באחת משתי הבקרות השליליות היטב (N23/N24). ודא שערכי Ct כוללים עקומות הגברה חוקיות לפני ביטול תוקף הלוח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. פירוש תוצאות מדגם
<ol><li>קבעו את תוצאת המטופל בעקבות הדיאגרמה (איור 3) ודיווחו על דגימות שנפתרו.<ol>
<li>הערך את תוצאת P1 כתקפה או כלא חוקית. אם P1 מפיק תוצאה של Ct <33, שקול את הבאר תקפה והמשיך לתוצאה מ- N1. אם P1 מפיק תוצאה של ערך Ct >=33 או ללא Ct, שקול את הבאר לא חוקית.<ol>
<li>הערך את תוצאת N1 ככן, לא או לא*. אם N1 מייצר תוצאה של Ct <33, הבאר היא כן. אם N1 אינו מפיק ערך Ct, הבאר היא לא. אם N1 מייצר > Ct =33, הבאר היא NO *. ודא שכל ערכי N1 Ct משויכים לעקומת הגברה אמיתית. אם לערך Ct עבור N1 אין עקומת הגברה, הבאר היא לא.</li>
			<li>זהה דוגמאות חוזרות (N1 הפעל מחדש או הפעל מחדש), תייג אותן במספר מדגם פנימי ובסוג מדגם והחזר אותן לזרימת העבודה של הטעינה (סעיף 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. ניקוי מעבדה
<ol><li>רובוטים לטיפול בנוזלים<ol>
<li>נקו את כל הצדדים עם חומר חיטוי ברמת הביניים. אין להשתמש באתנול מכיוון שהוא ישפיל את הפלסטיק.</li>
		<li>יש לנגב בעדינות קצה פיפטה ופח אשפה עם אלכוהול (70% אתנול או 100% איזופרופנול) לנגב. נגב את המקלדת והעכבר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ארון בטיחות ביולוגית<ol>
<li>נקו את כל המשטחים עם חומר חיטוי ברמת הביניים. הפעל את אור UV במשך 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף. הבדיקה המתוארת בפרוטוקול נופלת תחת רוקDirect EUA שהוגש על ידי בית הספר לבריאות הציבור של ייל.

הבדיקה המתוארת בפרוטוקול הוערכה על ידי מחקר אימות עצמאי. נמצא כי הבדיקה הייתה 98.9% ספציפיות (1.1% חיובי כוזב) ו 90.0% רגישות (10.0% שלילי כוזב) כאשר מוערך נגד דגימות nasopharyngeal מזווג נלקח באותו זמן (n = 837; 817 שלילי, 20 חיובי). חשוב לציין, שלושה משתתפים שנבדקו חיוביים עם TigerSaliva ושלילי עם ספוגית האף נבדקו מחדש עם מטליות 48 שעות מאוחר יותר והחזירו תוצאות חיוביות, מה שמצביע על כך ש- TigerSaliva עשוי להיות מסוגל לזהות זיהומי SARS-CoV-2 מוקדם יותר במהלך המחלה.
דימינו דגימות רוק חיוביות על ידי ספייק רוק ללא וירוסים (הן מטופלים בחום והן לא מטופלים בחום) עם ריכוזים ידועים של SARS-CoV-2 RNA סינתטי וביצע דילול של פי 10 כדי לקבוע את מגבלת ה- Ct ברוק. הגן N1 לא היה ניתן לזיהוי מתחת 10,000 עותקים גנטיים (כ Ct = 28) בדגימות חיוביות מדומות. אנו חושדים שזה בגלל השפלת RNase או גורמים מבלבלים אחרים. עם זאת, האינטראקציה של RNases רוק עם RNA סינתטי עירום הוא כנראה שונה מן האינטראקציה עם חלקיקים ויראליים, גם לאחר שהם כבר denatured על ידי חום. דגימות רוק חיוביות זוהו עם Ct >30 ומעבדות חיצוניות השיגו נתוני רצף גנטי SARS-CoV-2 מדגימות אלה. אנו משערים כי החלבונים הנגיפיים מספקים הגנה מפני השפלת RNA בדגימות רוק החולה.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא יישום אוטומציה להכנת תערובת ראשית ועיבוד מדגם רוק (סעיפים 4 ו -7 בהתאמה). הדבר מאפשר תהליכי משימה חופפים, מה שמקצר באופן דרסטי את זמן התפנית. צעד קריטי נוסף הוא פרשנות תוצאות קליניות (סעיפים 11 ו-12). יצירת קטגוריות תוצאות ביניים (שידור חוזר והפעלה חוזרת של N1) מזערה גם את התרחשותן של תוצאות בדיקה לא חד משמעיות.
הדגמנו שהשונות בין שיטות טעינה ידניות ואוטומטיות של דגימת רוק היא זניחה (איור 5A) ושאוטומציה עשויה לשפר את יכולת השכפול של זיהוי SARS-CoV-2 (איור 5B). אוטומציה צריכה להיות מועדפת כדי להקל על הבדיקות בעת תכנון והרחבה של מעבדות קליניות25. זרימת העבודה במעבדה משופרת עם יישום משימות אוטומטיות רובוט26. יכולות הקוד הפתוח של הרובוטים המטפלים בנוזל מאפשרות יישום של סקריפטים מותאמים אישית לעיצוב פרוטוקול. זה הופך רובוטים לטיפול בנוזלים למערכת זולה וניתנת לשינוי בהשוואה לשיטות אוטומציה קלינית מסורתיות. זוהי גם אסטרטגיה אידיאלית לביצוע משימות מעבדה שחוזרות על עצמן. הרמה הגבוהה של יכולת התאמה אישית של המערכת מתורגמת לחופש לשנות תוכנות מעבדה (למשל, צינורות איסוף, טיפים פיפטה, או לוחות 384-well) במקרה של מחסור. לכן, אוטומציה באמצעות רובוטים לטיפול בנוזלים היא בת קיימא הן עבור מעקב בקנה מידה גדול בקנה מידה קטן ומחקר.
היתרון העיקרי של אסטרטגיית בדיקה זו הוא זמן תפנית קצר בהרבה ביחס למעבדות קליניות אחרות. השימוש ברובוטים אוטומטיים לטיפול בנוזלים ממלא תפקיד מרכזי בהפחתת זמן התפנית, אך שימוש בו-זמני ברובוטים ותרמוציקלים הוא גם אינסטרומנטלי למקסם את יעילות הבדיקה. רובוט אחד ותרמוסיקר צריך להיות מופעל כזוג, שבו שתי המכונות משמשות יחד לטעינת מדגם ללא הפרעה וניתוח תוצאות מדגם. לאחר שנוצרת זרימה קבועה של דגימות שהוקצו, ניתן להפעיל את כל זוגות המכונות בו-זמנית. שימוש מתמיד בו-זמני ברובוטים ובתרמו-מחזורים מגדיל באופן דרסטי את יכולת הבדיקה ואת היעילות, וזה חיוני כדי להתאים לנפח הבדיקות הגבוה.
בניגוד לפרוטוקולים מבוססים אחרים של SARS-CoV-2 RT-qPCR, כללנו שלב טאצ'דאון בפרוטוקול התרמוציקלר כדי לשפר את חישול הגשושית וערכות הפריימר לגנים היעד27, ובכך להפחית את הסיכון להגברה כושלת. התוצאות הראו כי הטאצ'דאון שיפר את הזיהוי של דגימות חיוביות מבלי להסתכן באובדן של איגוד פריימר ספציפי (טבלה 4). קבענו שניתן לזהות בו-זמנית מגוון רחב של עותקי RNA של SARS-CoV-2 (איור 4A) ועותקי דנ"א Hs_RPP30 (איור 4B) על-ידי בדיקת RT-qPCR.
מגבלה אחת של רובוטים לטיפול בנוזלים היא האפשרות של זיהום צולב מדגימות חיוביות במהלך העברת רוק. רוק הוא נוזל ויסקולסטי28 ועשוי להיגרר על פני בארות סמוכות לאחר שהופץ מקצה הפיפטה. יתר על כן, ההטרוגניות של הרוק29 עלולה לגרום להפצה לא אחידה של חלקיקים ויראליים בכל המדגם. זה מגדיל את האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות ושליליות, המחייבות את ייעודן של דגימות N1 Rerun ו- Rerun. עם זאת, 14.1% מהדגימות שהוגדרו בתחילה כ- N1 Rerun נפתרו כחיוביות עבור SARS-CoV-2 והיו בסיכון גבוה פי 30 מאשר דגימות שידור חוזר כדי לפתור כחיוביות לאחר בדיקה חוזרת. כתוצאה מכך, הבחנה בין שידור חוזר ל-N1 Rerun (איור 3) אפשרה הפרדה מדויקת יותר של דגימות שעשויות להיות חיוביות, והגבירה את הרגישות והספציפיות של בדיקת האבחון שלנו. פרמטרים אחרים שהתקבלו לבדיקות רוק אבחנתיות לא עשו הבחנה זו12,14,24,30,31.
דגימות רוק יכול להיות קשה פיפטה בשל הטרוגניות וצמיגות32. טיפול בחום מפחית כראוי חלבונים בביומטריקס הרוק, מפחית את הצמיגות ומבטל את הצורך בריאגנטים להפקת RNA9, שהיו נדירים בשלבים המוקדמים של המגפה10. טיפול בחום ממושך גם מנטרל וירוסים קיימים33 המאפשר עיבוד מעבדה ברמות בטיחות ביולוגית נמוכות יותר. כתוצאה מכך, מיצוי RNA מבוסס חום (המתואר בסעיף 5.4) יושם כדי להפחית את הצמיגות באמצעות denaturation חלבון (איור 6). בהתבסס על התוצאות, אנו מניחים כי טיפול בחום עשוי גם הומוגניזציה דגימות רוק בנוסף denaturing ביומטריקס החלבון. קבוצות אחרות שילבו טיפול בחום וטיפול בחלבון K כדי להגביר את ההומוגניות9,14,34. בחרנו שלא ליישם את הצעד הזה מכיוון שהוא עלול לפגוע בחלבוני וריון בקצב שמשאיר את הרנ"א הנגיפי חשוף לירידה בחום35. יתר על כן, דילול מדגם עם proteinase K עשוי להסוות דגימות חיוביות המכילות פחות חלקיקים ויראליים ובכך, הפחתת הרגישות. בנוסף, תוצאות הבדיקה הושוו לבדיקת SARS-CoV-2 מבוססת רוק זמינה מסחרית (Logix Smart COVID-19) המשתמשת בהפקת RNA חרוז מגנטי (טבלה 5). נמצא כי הבדיקה הנוכחית התאימה יותר לאיתור דגימות חיוביות חלשות בהשוואה לבדיקה הזמינה מסחרית.
קשה לכמת מספר העתקת וירוס ברוק באמצעות RT-qPCR בלבד, כי qPCR הוא חצי כמותי. קיימת שונות אינהרנטית בין ערכי Ct שמקורם במגבלות טכניות. ניתן לקבוע את מספר עותק הגן מערכי Ct (איור 4) והוא שווה בערך למספר עותק נגיפי. פתרון אפשרי אחד כדי לקבוע את מספר העותק הנגיפי בדגימות רוק הוא ddPCR, המספק כימות קשה של עותקי גנים בתגובה. עם זאת, אנו מאמינים כי זה מספיק כדי לספק תוצאות איכותיות לרופאים ותוכן ויראלי יחסית ניתן להשוות על פני דגימות מעובדות עם השיטות שלנו.
למרות כמה מגבלות המתעוררות בעת שימוש ברוק, בדיקת SARS-CoV-2 על ידי RT-qPCR מבוסס רוק מוכיחה להיות שיטה יעילה לזיהוי RNA ויראלי מהיר ואמין בכל קנה מידה של בדיקות. הדבר נכון במיוחד כאשר יחד עם ניצול של מערכות טיפול בנוזל קוד פתוח. ניתן לשנות גישה זו לבדיקה כדי לזהות רצפי חומצות גרעין אחרים הרלוונטיים לאבחון, כגון סוכני מחלות זיהומיות, סמני מחלות או וירוסים אחרים. זה הופך את הבדיקה ישימה הן למאמצי אבחון קליניים והן למאמצי אבחון מחקריים.

נגיף נשימה חריף חמור הקשור לקורונה-2 (SARS-CoV-2), נגיף קורונה חדש, הופיע בסוף 2019 והתפשט במהירות באוכלוסיות העולם1. זיהום SARS-CoV-2 גורם למחלת קורונה 2019 (COVID-19), מחלה מדבקת מאוד עם תסמינים נשימתיים ודלקתיים חמורים. יכולת קבילות גבוהה בשילוב עם תמותה נמוכה הצביעו על כך שהנגיף יתפשט במהירות דרך אוכלוסיות וידרוש בדיקות אבחון מוגברות 2,3. המלצות בריאות הציבור עודדו סינון רחב היקף של אוכלוסיות כדי לבודד מקרים ולאחר מכן להפחית את שיעורי ההדבקה4,5,6. יתר על כן, מודלים של מעקב אוכלוסין גילו כי הגדלת תדירות הבדיקות והפחתת זמן הדיווח השפיעו יותר על הפחתת השידור מאשר הגברת הרגישות לבדיקה7. הסיבה לכך היא ככל הנראה כי אנשים נגועים יכולים להיות בהסגר מוקדם יותר, ובכך לשבור את שרשראות ההדבקה.
תקן ההגברה המקורי של חומצת הגרעין (NAAT) היה מטליות האף (NP) שעובדו על ידי RT-qPCR8. עם זאת, סיבוכים מתעוררים עם צורה זו של בדיקות עבור אוכלוסיות גדולות מאוד, כגון עלות יחסית מוגברת ולחץ שרשרת אספקה מוגברת9,10. יתר על כן, הן איסוף ועיבוד דגימות של שיטות NAAT נפוצות (כולל מטליות NP, דגימות oropharyngeal, מטליות טורבינות באמצע, ודגימות האף) מסתמכים על ציוד מיוחד, ריאגנטים, ואנשי צוות רפואי9,10.
תחליף הולם לבדיקות NP RT-qPCR ספוגיות הוא בדיקות מבוססות רוק, המהווה כלי אבחון מדויק לזיהוי SARS-CoV-211,12,13,14. ביצוע ישיר של RT-qPCR על דגימות רוק מניב רגישות וספציפיות דומות כמו מטליות NP15. אחד היתרונות העיקריים של בדיקות רוק יש על בדיקות ספוגית NP הוא שזה מאפשר איסוף עצמי של דגימות16. זה מצמצם את הצורך בצוותים רפואיים וממקסם את הקלות של איסוף מדגם עבור חולים על ידי היותו פחות פולשני מאשר דגימות NP. בנוסף, מאז דגימות רוק אינם דורשים חוצצים כדי להסיר את המדגם מספוגית (כמו במקרה של דגימות NP), בדיקות מבוססות רוק יכול לנצל חומצה ריבונוקלאית מבוססת חום (RNA) מיצוי ישירות, אשר מקטין את עלויות הבדיקה על ידי הסרת הצורך במאגרים נוספים, מדיה הובלה, ו / או ריאגנטים חילוץ RNA14,17.
המעבדה למחקר וחינוך באוניברסיטת קלמסון לאבחון מחלות והתערבות (REDDI) הוקמה כדי לענות על צרכי האוניברסיטה לבדיקות ומעקב של COVID-19. באוכלוסיות סגורות, כולל אוניברסיטאות, בדיקות מעקב תכופות בשילוב עם ריחוק חברתי הניבו את התוצאות החיוביות ביותר במודלים האפידמיולוגיים של שכיחות המחלה18. הפרוטוקולים המאוחדים של CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 ו- RockivaDirect14 הותאמו, ואוטומציה נוצלה בזרימת העבודה הקלינית כדי להפחית את העלות ולשפר את זמן התפנית. קבוצות קודמות השתמשו ברובוטים לטיפול בנוזל בקוד פתוח עבור שלבי חילוץ SARS-CoV-2 RNA20,21, אך הגדלנו את השימוש ברובוטים להכנת לוחות בדיקה ודגימות עומס22. כאן אנו מראים כי הפרוטוקול המותאם והשימוש במערכות טיפול בנוזל בקוד פתוח (איור 1) מאפשרים RT-qPCR מהיר ומדויק המבוסס על רוק ומהווה אסטרטגיה יעילה למעקב נרחב אחר בריאות הציבור.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

הופעתו של משבר הבריאות העולמי SARS-CoV-2 לאחרונה הציבה אתגרים מרכזיים למחקר אפידמיולוגי ובדיקות קליניות. מגפת COVID-19, המאופיינת בשיעור הדבקה גבוה ובתמותה נמוכה, דרשה בדיקות אבחון מדויקות ויעילות, במיוחד באוכלוסיות סגורות כגון אוניברסיטאות מגורים. הזמינות הראשונית של בדיקות חומצת גרעין, כמו דגימות האף, הוגבלה עקב לחץ שרשרת האספקה שגם עיכב את הדיווח על תוצאות הבדיקה. בדיקת תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) המבוססת על רוק, הוכיחה כי היא דומה ברגישות ובספציפיות לשיטות בדיקה אחרות, ואיסוף הרוק פחות פולשני פיזית למשתתפים. כתוצאה מכך, פיתחנו בדיקת אבחון מולטיפלקס RT-qPCR למעקב אוכלוסין של אוניברסיטת קלמסון והקהילה שמסביב. הבדיקה השתמשה ברובוטים ובתרמוציקלים לטיפול בנוזל בקוד פתוח במקום במערכות אוטומציה קלינית מורכבות כדי לייעל את זרימת העבודה ואת גמישות המערכת. אוטומציה של RT-qPCR מבוסס רוק מאפשרת זיהוי מהיר ומדויק של מגוון רחב של ריכוזי RNA נגיפיים הן עבור דרישות בדיקה בקנה מידה גדול והן עבור דרישות בדיקה בקנה מידה קטן. התפנית הממוצעת עבור המערכת האוטומטית הייתה < 9 שעות עבור 95% מהדגימות < 24 שעות עבור 99% מהדגימות. העלות עבור בדיקה אחת הייתה $2.80 כאשר כל הריאגנטים נרכשו בכמויות גדולות.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

הפרוטוקול מתאר שיטת אבחון SARS-CoV-2 המשתמשת באוטומציה בקוד פתוח כדי לבצע בדיקות מולקולריות RT-qPCR של דגימות רוק. גישה מדרגית זו יכולה להיות מיושמת מעקב קליני בריאות הציבור, כמו גם כדי להגדיל את הקיבולת של מעבדות אוניברסיטאיות קטנות יותר.

יעיל SARS-CoV-2 כמותי הפוך Transcriptase PCR רוק אסטרטגיה אבחון באמצעות רובוטים צנרת קוד פתוח

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

פיתחנו מבחן אבחון COVID 19 מבוסס רוק בעלות נמוכה וזרימת עבודה שקל ליישם ולהגדיל עבור יישומי סינון קהילתיים בקנה מידה גדול. כאן אנו משתמשים רובוטים לטיפול בנוזל קוד פתוח, thermocyclers סטנדרטי ותוכנה כדי לבצע בדיקה ישירה של רוק ללא מיצוי או מאגרי ייצוב תוך מתן תוצאות אבחון מדויקות. בגלל זרימות העבודה המקבילות האוטומטיות הפשוטות, ניתן להגדיל את המערכת כדי לבצע אלפי בדיקות מדי יום עם ציוד מינימלי, מקום ודרישות כוח אדם.בנוסף לקיילי קינג, רייצ'ל האם, מפקחת המעבדה הקלינית שלנו ואוסטין סמות'רס, רכז החינוך שלנו, תסייע להדגים את ההליך בגין על ידי טיהור החלק החיצוני של צינורות איסוף הרוק עם 70% אתנול והעברתם למעבדה לבדיקה. תיעדו את הגעת הדגימה על-ידי סריקת כל ברקוד לדוגמה בגיליון האלקטרוני של הצריכה היומית. חום לטפל בדגימות הסריקה במשך 30 דקות בתנור 95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להסיר את הדגימות באמצעות כפפות עמידות בחום.פתח את הגיליונות האלקטרוניים היומיים של טעינת הדגימה עבור כל רובוט טעינה לדוגמה בתחנת ההקצאה לדוגמה. לאחר מכן להקצות 188 דוגמאות לכל צלחת 384 באר. מגשי תוויות עם שם צלחת, תאריך ומספר רבעון.סרוק את הדגימות לפי הסדר לתוך גיליון העבודה של טעינת הדגימה לדוגמה. בתחנת הטעינה לדוגמה, בשורה שני סטים מלאים של שמונה מתלים מודפסים 3D, המתאים למיקום הסיפון ברובוט. יש לנתק את הצינורות של רבע אחד ולהניח אותם במתלים מודפסים בתלת-ממד, החל ממיקום A1 בארון תקשורת אחד.מלאו כל ארון תקשורת משמאל לימין ומלמעלה למטה. המשך דפוס טעינה זה בארון תקשורת 2, ולאחר מכן להמשיך מתלים ארבע וחמש. שים טעון רבע אחד מדפי מדגם על סיפונים אחד, שניים, ארבעה, חמש, שבע, שמונה, 10, 11.מניחים טיפים P20 על סיפונים שלוש ותשע. כדי לפשט את תהליך ההתקנה, טען חומרים מהחלק האחורי לחזית לתוך הרובוט. לוחות המיקס הראשיים מיוצרים על רובוט ייעודי ומאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס.צלחת אחת משמשת בכל פעם ומסומנת בשם צלחת, ולהב חד משמש לחיתוך קו בנייר הכסף סביב בארות הבקרה. מניחים את צלחת התערובת הראשית על סיפון שש ומקלפים את כיסוי נייר הכסף, ומשאירים מאחור את המלבן הקטן המכסה את בארות הבקרה. לחשוף את תיבות הקצה ולסגור את הרובוט.אתחל את פרוטוקול ההפעלה המותאם אישית של Python על-ידי לחיצה על התחל לפעול דרך יישום שולחן העבודה הרובוטי. כל רבעון לוקח 24.5 דקות לטעון על הצלחת. הגדר טיימר כתזכורת.בזמן שהרובוט פועל, שחררו וטענו רבע שני צינורות מדגם לתוך הסט השני של מתלים מודפסים בתלת-ממד. כאשר הרובוט מושהה, הסר את ארונות התקשורת של רבע אחד והחלף אותם ברבע שני ארונות תקשורת, ולאחר מכן לחץ על חידוש הפעלה ביישום שולחן העבודה. סכום רבע אחד צינורות מדגם ולאחסן אותם במקרר ארבע מעלות צלזיוס תוך המתנה לתוצאות.חזור על תהליך טעינה זה עבור רבעים שלוש וארבע. מעבירים את הצלחת הטעונה לארון בטיחות ביולוגי. כדי למזער את הזיהום, לשמור על הצלחת מכוסה במהלך ההעברה.לאסוף את כל הדגימות החוזרות ולהקצות אותם כדגימות האחרונות ברבעון הרביעי. ספור את הדוגמאות, סרוק את הברקודים והזן את המיקום לדוגמה המקורי ואת התוצאה בגיליון האלקטרוני של טעינת הדגימה לדוגמה. העבר את הדגימות החוזרות לארון הבטיחות הביולוגית.אין לטעון את צינורות הדגימה החוזרים למתלי הטעינה של הרובוטים. פיפטה שני מיקרוליטרים של כל דגימה חוזרת לבארות הנכונות. השתמש בפיפטה המיועדת להוספת דגימות מטופלים.שמור על בארות הבקרה מכוסות בנייר כסף תוך הוספת דגימות כדי למזער את הזיהום. לקלף את כיסוי נייר הכסף מעל בארות בקרה באמצעות מלקחיים. פיפט שני מיקרוליטרים של דגימות חולים חיוביים מאומתים לתוך בארות M23 ו- M24.פיפטה שני מיקרוליטרים של מים ללא נוקלאז לבארות N23 עד N24 ושני מיקרוליטרים של 200 עותקים לכל מיקרוליטר מעורב שליטה חיובית וולס O23 ל O24. השאר בארות P23 עד P24 ריק כדי לפקח על איכות אצווה תערובת ראשית. לכסות את הצלחת עם חותם ברור אופטית ולהשתמש רולר אפליקטור כדי לדבוק חותם לכל הבארות.מערבולת את הצלחת ב 2, 500 סל"ד במשך 30 שניות לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה הצלחת ב 500 פעמים G במשך דקה אחת. בחר את תוכנית הפרוטוקול בתוכנת התרמו-מחזור ושמור את הפרוטוקול ללוחות עתידיים. מניחים את הצלחת האטומה בתרמוציקלר ומפעילים את הפרוטוקול.יצא ערכי CT והעתק את הערכים לגיליון האלקטרוני לדוגמה של טעינה. לשליטה חיובית, בדוק אם לפחות בקרה חיובית אחת מפיקה ערכי CT בין 22 ל- 28 עבור בדיקות P1 ו- N1. לחלופין, בארות המדגם החיוביות הידועות מייצרות ערכי P1 ו- N1 CT פחות מ-33 בבדיקות P1 ו- N1.לשליטה שלילית, ודא שאין ערכי N1 או P1 CT באחת משתי בארות הבקרה השליליות. ודא שלערכי CT יש עקומות הגברה חוקיות לפני ביטול תוקף הלוח. אם P1 מייצר תוצאה של CT פחות מ-33, שקול את הבאר תקפה והמשיך לתוצאה מ- N1. אם P1 מפיק תוצאה של CT הגדולה או שווה ל- 33 או ללא ערך CT, שקול את הבאר כלא חוקית.אם N1 מייצר תוצאה של CT פחות מ 33, להעריך את הבאר כמו כן. אם N1 אינו מפיק ערך CT, הערך את הבאר כמו לא. אם N1 מפיק ערך CT הגדול או שווה ל- 33, הערך את הבאר ללא כוכב.ודא שכל ערכי N1 CT משויכים לעקומת הגברה אמיתית. אם לערך CT עבור N1 אין עקומת הגברה, הבאר אינה. זהה את הדוגמאות החוזרות, תייג אותן במספר מדגם פנימי ובסוג מדגם והחזר אותן לזרימת העבודה של הטעינה.התמונות הייצוגיות מראות את זיהוי RTQ PCR של N1 או SARS CoV-2 RNA סינתטי ו- P1 או HSRPP30 DNA סינתטי. עקומות סטנדרטיות שורטטו עם סטיות תקן כדי לקבוע את טווח הזיהוי המדויק באמצעות שילוב פריימר בדיקה זה. ערכי ה- CT הממוצעים שהושגו בדילול בהתאמה שורטטו כנגד הכמות המשוערת של RNA סינתטי ודנ"א סינתטי.בשני המקרים, העקומות הליניאריות הראו מקדמי מתאם טובים על פני מגוון רחב של ריכוזי העתקת גנים. ערכי N1 CT שהתקבלו מדגימות ייחודיות באמצעות רובוט וטעינת מדגם ידנית הוחלפו כדי לקבוע את השונות הבין-מדומה בין טעינת המדריך לרובוט. הקשר הליניארי בין השיטות הידניות והאוטומטיות יצר מקדם מתאם גבוה המציין ששתי השיטות שוות ערך מבחינה פונקציונלית.שונות פנימית נקבעה גם באמצעות ערכי N1 CT משוכפלים שהוחלפו המתקבלים הן מהרובוט והן מטעינת מדגם ידנית. הערכה של שיטות טיפול בחום להפחתת צמיגות ברוק מוצגת כאן. סארס CoV-2 רוק שלילי נאסף ממקור אחד ו aliquots טופלו בחום במשך אפס דקות, 30 דקות או 60 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.ערכי P1 CT משכפלים טכניים של כל תנאי שורטטו כדי לקבוע את השונות בין שיטות הטיפול. הן 30 דקות והן 60 דקות שיטות טיפול בחום הפיקו ירידה משמעותית השתנות מדגם לעומת שום בקרת טיפול. לא היה הבדל משמעותי בין טיפולים של 30 דקות ל -60 דקות.לכן יושמה שיטת הטיפול בחום של 30 דקות כדי לקצר את זמן העיבוד. השתמש בטכניקה אספטית מתאימה כדי למזער את הזיהום של לוחות הבדיקה, במיוחד בעת טעינת דגימות ופקדים ידניים. הימנעו מלחצות את הצלחת עם הידיים או השרוולים.לאחר הפקת תוצאות קליניות, ניתן להיפטר מדגימות בפסולת ביולוגית או לשמור אותן לניתוח נוסף, כגון ריצוף גנום שלם כדי לקבוע זנים ספציפיים. טכניקה זו מאפשרת בדיקות קהילתיות בקנה מידה רחב, המאפשרת לנו לחקור את ההשפעות של כיסוי הבדיקה ואת ההתפשטות הלא סימפטומטית של Covid 19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...