Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

저자들은 SARS-CoV-2 검사를 구현하고 관리하는 데 도움을 준 REDDI Lab의 Clemson의 경영진, 의료진 및 임상 실험실 직원에게 감사드립니다. 초기 프로젝트 컨설팅 및 장비 조달을 위한 업계 접촉을 위해 사우스캐롤라이나 대학교의 Phillip Buckhaults 박사와 Carolyn Bannister 박사에게 감사드립니다. 샘플 수집에 도움을 주신 많은 학생, 교수 및 교직원에게 감사드립니다. 표준 곡선 데이터 수집을 위해 Creative Inquiry 학생들에게 감사드립니다. 이 연구에 대한 기금은 National Institutes of Health grants P20GM121342 (DD 및 LGP에 수여), Clemson Athletic Department, Clemson University의 연구 담당 부사장 및 South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee에서 수령했습니다.

모든 연구는 Clemson University 및 Prisma Health Institutional Review Board (Prisma Health IRB # Pro00099491, July 1, 2020)에 따라 수행되었습니다.
1. 오픈 소스 액체 취급 로봇의 설정
<ol><li>고효율 미립자 공기(HEPA) 필터 모듈( 재료 표 참조)을 제조업체의 지침에 따라 각 액체 처리 로봇의 맨 위에 설치합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 마스터 믹스 플레이트 준비 로봇의 왼쪽 마운트에 8채널 P20 피펫을 부착합니다.</li>
	<li>P20 피펫을 제조업체의 지침에 따라 샘플 로딩 로봇의 오른쪽 마운트에 부착하십시오.</li>
	<li>적절한 컴퓨터에서 사용자 지정 Python 스크립트(보충 파일 1 및 보충 파일 2)를 다운로드합니다.</li>
	<li>TigerSaliva Full 384 Loading.py 를 샘플 로딩 로봇 컴퓨터의 데스크톱 응용 프로그램에서 엽니 다. 보정을 클릭하고 소프트웨어 지시에 따라 파이펫과 프로그램을 모두 설정합니다.</li>
	<li>마스터 믹스 로봇 컴퓨터의 데스크톱 응용 프로그램에서 12 전체 Plates.py 을 엽니 다. 보정을 클릭하고 소프트웨어 지시에 따라 파이펫과 프로그램을 모두 설정합니다.</li>
	<li>CAD(컴퓨터 지원 설계) 파일(https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363)을 사용하여 융합 증착 모델링 3차원(3D) 프린터로 사용자 정의 샘플 랙을 인쇄합니다. 샘플 로딩 로봇당 16개의 랙을 인쇄하여 두 세트의 랙을 여덟 개의 랙으로 인쇄합니다.</li>
</ol>2. 20x 멀티플렉스 N1+P1 프로브/프라이머 믹스의 제조
<ol><li>합성 SARS-CoV-2 RNA 또는 환자 검체로부터 멀리 떨어진 멸균 환경에서 50 mL 원뿔형 튜브에 20x 멀티플렉스 N1+P1 프로브/프라이머 믹스(총 부피 20 mL, 표 1)의 배치를 준비한다.</li>
	<li>분취량 1.6 mL를 혈청학적 피펫을 사용하여 멸균된 2.0 mL 원심분리 튜브에 넣고 적절하게 라벨링한다.</li>
	<li>분취량을 사용할 준비가 될 때까지 -20°C 냉동고에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 양성대조군 믹스의 제조
참고: 양성 대조군 혼합은 프로브/프라이머 믹스 또는 다른 마스터 믹스 성분과 동일한 멸균 환경에서 만들어서는 안 됩니다. 뉴클레아제가없는 물의 별도의 용기를 사용해야합니다.
<ol><li>SARS-CoV-2 합성 RNA (N1)를 1,000,000 유전자 카피 / μL (cpμ)에서 10,000 cpμ로 희석하여 10 μL의 원액을 990 μL의 뉴클레아제가없는 물에 첨가하십시오. 25 μL의 10,000 cpμ를 멸균된 0.2 mL 튜브에 넣고 적절하게 라벨을 붙인다. 사용하지 않은 분취량을 -80°C에서 보관하십시오. 참고: 합성 RNA는 분해를 방지하기 위해 -80°C에서 보관해야 합니다.</li>
	<li>Hs_RPP30 합성 DNA (P1)를 950 μL 뉴클레아제가 없는 물에 50 μL의 원액을 첨가하여 200,000 cpμ에서 10,000 cpμ로 희석한다. 25 μL의 10,000 cpμ를 멸균된 0.2 mL 튜브에 넣고 적절하게 라벨을 붙인다. 사용하지 않은 분취량을 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>SARS-CoV-2 및 Hs_RPP30 10,000 cpμ 스톡을 960 μL의 뉴클레아제가없는 물에 20 μL를 첨가하여 각 성분을 200 cpμ의 최종 농도로 희석하고, 총 1000 μL의 Aliquot 20 μL를 혼합한 200 cpμ 양성 대조군을 0.2 mL 튜브에 넣고 적절하게 라벨링한다. 사용 준비가 될 때까지 분취량을 -80°C에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 마스터 믹스 플레이트의 제조
참고: 합성 SARS-CoV-2 RNA 또는 환자 표본에서 멀리 떨어진 멸균 환경에서 마스터 믹스를 만드십시오. 모든 성분은 혼합물에 첨가하기 전에 완전히 해동되어야합니다. 적절한 해동이 없으면 농도가 올바르지 않을 수 있습니다. 부적절한 해동은 얼음의 존재 또는 시약의 고르지 않은 색으로 나타납니다. 혼합물을 준비하는 동안 냉동고 블록에 보관하십시오.
<ol><li>50 mL 원뿔형 튜브에서 멀티플렉스 마스터 믹스 (총 부피 48 mL, 표 2)의 배치를 준비한다.</li>
	<li>튜브를 3x 이상으로 돌려 혼합물을 균질화하십시오. 위아래로 피펫팅하거나 볼텍싱하면 효소가 손상되므로 혼합하지 마십시오.</li>
	<li>멸균된 96웰 깊은 웰 저장소의 컬럼 1-4를 채우고 마스터 믹스 1.48 mL를 각 웰로 옮깁니다. 하나의 50 mL 원뿔형이 네 개의 컬럼을 채우며, 12개의 플레이트에 충분합니다.</li>
	<li>깊은 우물 저수지를 호일 씰로 덮고 전용 마스터 믹스 액체 처리 로봇에 넣으십시오. 채워진 깊은 우물 저수지를 갑판 10에 놓고 갑판 1-6에 빈 384 웰 플레이트 6 개를 놓고 P20 팁 상자를 갑판 11에 놓습니다. 깊은 우물 플레이트와 팁 박스를 발견하고 로봇을 닫으십시오.</li>
	<li>로봇 데스크톱 응용 프로그램에서 실행 시작 을 클릭하여 사용자 지정 Python 운영 프로토콜을 초기화합니다.</li>
	<li>40 분 후에 실행이 일시 중지됩니다. 채워진 384 웰 플레이트를 호일 씰로 덮고 로봇에 남아있는 동안 롤러로 눌러 부착을 보장합니다. 각 플레이트의 가장자리에 배치 식별자로 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>데크 1-6에 비어 있는 384웰 플레이트 6개를 새로 놓고 실행 재개를 클릭하여 작동 프로토콜을 다시 시작합니다. 실행이 완료되면 호일 씰로 384 웰 플레이트의 최종 세트를 덮으십시오.</li>
	<li>나머지 마스터 믹스 2 μL를 배치 품질 관리를 위해 빈 384-웰 플레이트의 컬럼 1-3 및 22-24에 피펫한다. 광학적으로 투명한 씰로 밀봉하고 열순환기(섹션 10.1-10.2)에서 실행합니다. 웰에 N1 임계값 주기(Ct) 값이 있거나 10개 이상의 웰에 P1 Ct 값이 있는 경우 배치는 오염되어 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>제조된 마스터 믹스 플레이트를 4°C에서 보관하고 준비 후 7일 이내에 사용한다.</li>
</ol>5. 견본 수집, 섭취 및 열처리
<ol><li>참가자들에게 타액 수집 30 분 전에 먹고, 마시고, 담배를 피우거나, 치과 위생을 실시하지 않도록 지시하십시오. 참가자들에게 입안에 자연적으로 웅크리는 타액 1mL 이상을 모아 방부제가 없는 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 넣은 다음 튜브를 뚜껑을 덮으라고 지시합니다(보충 파일 3).</li>
	<li>타액 수집 튜브의 외부를 70 % 에탄올로 오염 제거하거나 물티슈를 소독하고 테스트를 위해 실험실로 옮깁니다.</li>
	<li>각 샘플 바코드를 일일 섭취량 스프레드시트에 스캔하여 샘플 도착을 기록합니다(보충 파일 4).</li>
	<li>스캔된 샘플을 95°C 오븐에서 30분 동안 열처리한다. 내열 장갑을 착용하는 동안 샘플을 제거하십시오. 참고: 처리되지 않은 샘플은 실온(23°C)에서 최대 72시간 동안 안정합니다. 일단 열처리되면, 샘플은 즉시 처리되지 않을 경우 4°C에서 저장되어야 한다.</li>
</ol>6. 샘플 할당
<ol><li>샘플 할당 스테이션의 컴퓨터에서 각 샘플 로딩 로봇(보충 파일 5)에 대한 일일 샘플 로딩 스프레드시트를 엽니다.</li>
	<li>샘플 1-48은 쿼터 1로 간주되고, 샘플 49-96은 쿼터 2로 간주되고, 샘플 97-144는 쿼터 3으로 간주되고, 샘플 145-188은 쿼터 4로 간주된다. 샘플은 중복으로 분석됩니다.</li>
	<li>트레이에 플레이트 이름, 날짜 및 분기 번호로 레이블을 지정합니다. 샘플을 순서대로 스캔하여 샘플 로딩 스프레드시트로 들어갑니다. 주: 이전 플레이트의 샘플은 그림 3에 정의된 대로 수동으로 실행해야 할 수도 있습니다. 수동 샘플 할당 및 로딩 지침은 섹션 8.1-8.3을 참조하십시오.</li>
</ol>7. 샘플 로딩 로봇 작동
<ol><li>샘플 로딩 스테이션에서 로봇의 데크 배치에 해당하는 여덟 개의 3D 프린트 랙으로 구성된 두 개의 전체 세트를 정렬합니다.</li>
	<li>쿼터 1 튜브의 캡을 풀고 랙 1의 A1 위치부터 시작하여 3D 프린트된 랙에 배치합니다. 각 랙을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 채웁니다. 랙 2에서 이 로딩 패턴을 계속한 다음 랙 4와 5로 진행하십시오( 그림 2C 참조). 주: 랙은 로봇 프로그램 매개변수로 인해 연속적으로 번호가 매겨지지 않습니다.</li>
	<li>로드된 쿼터 1 샘플 랙을 데크 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11에 놓습니다. P20 팁을 데크 3과 9에 놓습니다. 설정 프로세스를 단순화하려면 로봇에 재료를 앞뒤로 로드합니다.</li>
	<li>4°C에서 미리 만들어진 마스터 믹스 플레이트를 가져와 플레이트 이름으로 라벨을 붙이고 날카로운 블레이드를 사용하여 컨트롤 웰 주변의 호일(N23/24, O23/24 및 P23/24)의 선을 자릅니다.</li>
	<li>마스터 믹스 플레이트를 데크 6에 놓고 호일 커버를 벗겨 내고 컨트롤 웰을 덮고있는 작은 사각형을 남겨 둡니다. 팁 박스를 발견하고 로봇을 닫습니다.</li>
	<li>로봇 데스크톱 응용 프로그램을 통해 실행 시작 을 클릭하여 사용자 지정 Python 운영 프로토콜을 초기화합니다. 매 분기마다 플레이트에로드하는 데 24.5 분이 걸립니다. 타이머를 미리 알림으로 설정합니다.</li>
	<li>로봇이 작동하는 동안 섹션 7.2에 설명된 대로 쿼터 2 샘플 튜브의 캡을 해제하고 두 번째 3D 프린트 랙 세트에 로드합니다.</li>
	<li>로봇이 일시 중지되면 쿼터 1 랙을 제거하고 쿼터 2 랙으로 교체하십시오. 데스크톱 응용 프로그램에서 실행 다시 시작 을 클릭합니다.</li>
	<li>쿼터 1 샘플 튜브를 요약하고 결과를 기다리는 동안 4°C 냉장고에 보관한다. 분기 3과 4에 대해 이 로딩 프로세스를 반복하십시오.</li>
	<li>적재 된 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 오염을 최소화하려면 이송 중에 플레이트를 덮어 두십시오.</li>
</ol>8. 수동 샘플 로딩
참고: 로봇 로드가 부적절한 경우 반복 샘플(N1 재실행 또는 재실행, 그림 3 참조)에 대해 단일 수동 실행을 수행하십시오.
<ol><li>반복 샘플을 수집하여 분기 4의 마지막 샘플로 할당합니다(섹션 6.2 참조). 샘플 번호를 매기고, 바코드를 스캔하고, 원래 샘플 위치와 결과를 샘플 로딩 스프레드시트에 입력합니다.</li>
	<li>반복 샘플을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 반복 샘플 튜브를 로봇 로딩 랙에 로드하지 마십시오.</li>
	<li>각 반복 샘플의 2 μL를 플레이트 레이아웃 다이어그램 (보충 파일 6)에 따라 올바른 웰로 피펫합니다. 환자 샘플을 추가하기 위해 지정된 피펫을 사용하십시오. 오염을 최소화하기 위해 샘플을 추가하는 동안 호일로 덮인 제어 웰을 유지하십시오.</li>
</ol>9. 테스트 플레이트에 컨트롤 추가
<ol><li>포셉을 사용하여 제어 웰 위에 호일 커버를 벗겨냅니다.</li>
	<li>2 μL의 뉴클레아제-비함유 물(주형 대조군 없음)을 웰 N23-N24 및 200 cpμ의 2 μL의 혼합 양성 대조군(섹션 3 참조)을 웰 O23-O24에 피펫한다. 확인된 양성 환자 샘플 대조군의 2 μL를 추가 대조군으로서 웰 M23-M24로 피펫한다. 웰 P23-P24를 비워 두어 마스터 믹스 배치 품질을 모니터링합니다.</li>
	<li>플레이트를 광학적으로 투명한 씰로 덮고 어플리케이터 롤러를 사용하여 모든 웰에 씰을 부착하십시오. 플레이트를 2500 rpm에서 30초 동안 볼텍스하여 완전히 혼합한다. 플레이트를 500 x g 에서 1분 동안 원심분리한다.</li>
</ol>10. RT-qPCR 수행
<ol><li>설명된 조건에 따라 thermocycler 소프트웨어에 프로토콜 프로그램을 작성하십시오(표 3). 향후 플레이트를 위해 프로토콜을 저장하십시오. 밀봉 된 플레이트를 열 순환기에 놓고 프로토콜을 실행하십시오.</li>
	<li>Ct 값을 .xslx 파일로 내보내고 값을 샘플 로드 스프레드시트에 복사합니다(보충 파일 5). 참고: 이 시트는 제조업체 소프트웨어의 Ct 출력 파일을 위해 맞춤 설계되었으며 다른 형식을 허용하려면 수정해야 할 수 있습니다.</li>
</ol>11. 플레이트 유효성 결정
<ol><li>양성 대조군 및/또는 알려진 양성 샘플과 음성 대조군 모두를 검증하여 플레이트 결과를 유효한 것으로 간주하십시오. 다음 기준으로 컨트롤 웰을 평가합니다.<ol>
<li>양성 대조군의 경우, 적어도 하나의 양성 대조군 웰(O23/O24)이 P1 및 N1 프로브 모두에 대해 22-28 사이의 Ct 값을 생성하는지 확인하십시오. 대안적으로, 공지된 양성 샘플 웰(M23/M24)은 P1 및 N1 프로브 상에서 P1 및 N1 Ct 값<33을 생성한다.</li>
		<li>음성 대조군의 경우 두 개의 음성 컨트롤 웰(N23/N24) 중 하나에 N1 또는 P1 Ct 값이 없는지 확인합니다. 플레이트를 무효화하기 전에 Ct 값이 유효한 증폭 곡선을 가지고 있는지 확인하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. 샘플 결과 해석
<ol><li>다이어그램(그림 3)에 따라 환자 결과를 확인하고 해결된 샘플을 보고합니다.<ol>
<li>P1 결과를 유효하거나 유효하지 않은 것으로 평가합니다. P1이 Ct<33의 결과를 생성하면 우물 유효성을 고려하고 N1의 결과로 진행하십시오. P1이 Ct>=33의 결과를 생성하거나 Ct 값이 없는 경우 우물이 유효하지 않다고 간주하십시오.<ol>
<li>N1 결과를 YES, NO 또는 NO*로 평가합니다. N1이 Ct<33의 결과를 생성한다면, 웰은 YES이다. N1이 Ct 값을 생성하지 않는 경우, 웰은 NO이다. N1이 Ct>=33을 생성하면 웰은 NO*입니다. 모든 N1 Ct 값이 실제 증폭 곡선과 연관되어 있는지 확인합니다. N1에 대한 Ct 값이 증폭 곡선이 없는 경우, 웰은 NO이다.</li>
			<li>반복 샘플(N1 재실행 또는 재실행)을 식별하고, 내부 샘플 번호 및 샘플 유형으로 레이블을 지정한 다음 로드 워크플로로 반환합니다(섹션 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. 실험실 정리
<ol><li>액체 취급 로봇<ol>
<li>중간 수준의 소독제로 모든면을 청소하십시오. 에탄올은 플라스틱을 분해하므로 사용하지 마십시오.</li>
		<li>피펫 끝 부분과 폐통을 알코올(70% 에탄올 또는 100% 이소프로판올)로 부드럽게 닦아냅니다. 키보드와 마우스를 닦아냅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생물안전 캐비닛<ol>
<li>중간 수준의 소독제로 모든 표면을 청소하십시오. 자외선을 15 분 동안 켭니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다. 프로토콜에 설명 된 분석은 Yale School of Public Health가 제출 한 SalivaDirect EUA에 속합니다.

프로토콜에 기재된 검정은 독립적인 검증 연구에 의해 평가되었다. 이 분석은 동시에 복용한 쌍을 이루는 비인두 면봉에 대해 평가했을 때 98.9% 특이성(1.1% 위양성) 및 90.0% 민감도(10.0% 위음성)를 갖는 것으로 밝혀졌다(n=837; 817 음성, 20 양성). 중요한 것은 TigerSaliva에서 양성 반응을 보였고 비인두 면봉으로 음성으로 검사 한 세 명의 참가자가 48 시간 후에 면봉으로 다시 검사를하고 긍정적 인 결과를 반환하여 TigerSaliva가 질병 초기에 SARS-CoV-2 감염을 발견 할 수 있음을 나타냅니다.
우리는 SARS-CoV-2 합성 RNA의 알려진 농도로 바이러스가없는 타액 (열처리 및 열처리되지 않은 둘 다)을 스파이킹하여 양성 타액 샘플을 시뮬레이션하고 타액의 Ct 한계를 결정하기 위해 10 배 희석을 수행했습니다. N1 유전자는 시뮬레이션된 양성 샘플에서 10,000 유전자 카피 (대략 Ct = 28) 미만으로 검출가능하지 않았다. 우리는 이것이 RNase 분해 또는 다른 혼란스러운 요인 때문이라고 의심합니다. 그러나 타액 RNases와 벌거 벗은 합성 RNA의 상호 작용은 열에 의해 변성 된 후에도 바이러스 입자와의 상호 작용과 다를 수 있습니다. 양성 타액 샘플은 Ct >30으로 확인되었으며 외부 실험실은 이러한 샘플로부터 SARS-CoV-2 유전자 서열 데이터를 획득했습니다. 우리는 바이러스 단백질이 환자 타액 샘플에서 RNA 분해로부터 보호를 제공한다고 추측합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 마스터 믹스 준비 및 타액 샘플 처리를위한 자동화의 구현입니다 (각각 섹션 4 및 7). 이를 통해 작업 프로세스가 겹치게 되어 처리 시간이 크게 줄어듭니다. 또 다른 중요한 단계는 임상 결과 해석입니다 (섹션 11 및 12). 중간 결과 범주(재실행 및 N1 재실행)를 설정하면 결정적이지 않은 테스트 결과의 발생도 최소화되었습니다.
수동 및 자동 타액 샘플 로딩 방법 간의 변동은 무시할 수 있으며(그림 5A), 자동화가 SARS-CoV-2 검출의 재현성을 향상시킬 수 있음을 입증했습니다(그림 5B). 자동화는 임상 실험실을 설계하고 확장할 때 테스트를 용이하게 하기 위해 선호되어야 합니다25. 실험실 워크플로우는 로봇 자동화 작업의 구현으로 개선됩니다26. 액체 처리 로봇의 오픈 소스 기능을 통해 프로토콜 설계를 위한 맞춤형 스크립팅을 구현할 수 있습니다. 이로 인해 액체 처리 로봇은 기존의 임상 자동화 방법에 비해 저렴하고 수정 가능한 시스템이됩니다. 또한 매우 반복적 인 실험실 작업을 실행하기위한 이상적인 전략입니다. 시스템의 높은 수준의 사용자 정의 가능성은 부족한 경우 랩웨어 (예 : 수집 튜브, 피펫 팁 또는 384 웰 플레이트)를 자유롭게 변경할 수있는 자유로 해석됩니다. 따라서 액체 취급 로봇을 사용한 자동화는 대규모 및 소규모 감시 및 연구 모두에서 실행 가능합니다.
이 테스트 전략의 가장 큰 장점은 다른 임상 실험실에 비해 처리 시간이 훨씬 짧다는 것입니다. 자동 액체 처리 로봇의 활용은 처리 시간을 줄이는 데 중요한 역할을하지만 로봇과 열 사이클러를 동시에 사용하는 것은 테스트 효율성을 극대화하는 데에도 도움이됩니다. 하나의 로봇과 열순환기는 한 쌍으로 작동해야 하며, 두 기계는 중단 없는 샘플 로딩 및 샘플 결과 분석을 위해 함께 사용됩니다. 할당 된 샘플의 꾸준한 흐름이 설정되면 모든 기계 쌍을 동시에 작동 할 수 있습니다. 로봇과 열사이클러를 지속적으로 동시에 사용하면 테스트 용량과 효율성이 크게 향상되며, 이는 높은 테스트 볼륨을 수용하는 데 매우 중요합니다.
기존의 다른 SARS-CoV-2 RT-qPCR 프로토콜과는 달리, 우리는 표적 유전자에 대한 프로브 및 프라이머 세트의 어닐링을 개선하기 위해 써모사이클러 프로토콜에 터치다운 단계를 포함시켰고27, 증폭 실패의 위험을 줄였다. 결과는 터치다운이 특이적 프라이머 결합의 손실 위험 없이 양성 샘플의 검출을 개선한다는 것을 입증하였다(표 4). 우리는 광범위한 SARS-CoV-2 RNA 카피 (도 4A) 및 Hs_RPP30 DNA 카피 (도 4B)가 RT-qPCR 분석에 의해 동시에 검출 될 수 있음을 결정했다.
액체 처리 로봇의 한 가지 한계는 타액 전달 중에 양성 샘플로부터 교차 오염 될 가능성입니다. 타액은 점탄성 유체(28)이며, 피펫 팁으로부터 분배된 후 인접한 웰을 가로질러 스트링될 수 있다. 더욱이, 타액29의 이질성은 샘플 전체에 걸쳐 바이러스 입자의 고르지 않은 분포를 야기할 수 있다. 이로 인해 가양성과 부정의 가능성이 증가하므로 N1 재실행 및 재실행 샘플을 지정해야 합니다. 그러나 처음에 N1 Rerun으로 지정된 샘플의 14.1 %가 SARS-CoV-2에 대해 양성으로 확인되었으며 재검사 후 양성으로 해결 될 가능성이 재실행 샘플보다 30 배 이상 높았습니다. 결과적으로 Rerun과 N1 Rerun(그림 3)을 차별화하면 잠재적으로 양성인 샘플을 보다 정확하게 분리할 수 있었으며, 진단 분석의 민감도와 특이성이 향상되었습니다. 진단 타액 검사를위한 다른 결과 매개 변수는 이러한 구별을하지 않았다12,14,24,30,31.
타액 표본은 이질성 및 점도로 인해 피펫을 하기 어려울 수 있다32. 열처리는 타액 바이오매트릭스의 단백질을 적절하게 변성시켜 점도를 감소시키고 전염병의 초기 단계에서 부족했던 RNA 추출 시약9의 필요성을 제거합니다10. 연장된 열처리는 또한 현재의 바이러스33를 불활성화시켜 더 낮은 생물안전성 수준에서 실험실 처리를 가능하게 한다. 결과적으로, 단백질 변성을 통해 점도를 감소시키기 위해 열 기반 RNA 추출 (섹션 5.4에 설명되어 있음)이 구현되었습니다 (그림 6). 결과에 기초하여, 우리는 열처리가 단백질 바이오매트릭스를 변성시키는 것 외에도 타액 샘플을 균질화할 수 있다고 가정한다. 다른 그룹들은 열처리와 프로테이나제 K 처리를 조합하여 균질성을 증가시켰다9,14,34. 우리는 바이러스 RNA가 열 분해에 노출되는 속도로 비리온 단백질을 변성 할 수 있기 때문에이 단계를 구현하지 않기로 결정했습니다35. 또한, 프로테이나제 K로 희석된 샘플은 더 적은 바이러스 입자를 함유하는 양성 샘플을 마스킹할 수 있고, 따라서 민감도가 감소한다. 또한, 상기 분석 결과는 자성 비드 RNA 추출을 사용하는 시판되는 타액계 SARS-CoV-2 분석법(Logix Smart COVID-19)과 비교하였다(표 5). 현재의 분석이 상업적으로 이용가능한 검정과 비교하여 약한 양성 샘플을 검출하는데 더 적합하다는 것을 발견하였다.
qPCR이 반정량적이기 때문에 RT-qPCR만을 사용하여 타액의 바이러스 카피 수를 정량화하는 것은 어렵습니다. 기술적 한계에서 비롯된 Ct 값 간에는 고유한 차이가 있습니다. 유전자 카피 수는 Ct 값(도 4)으로부터 결정될 수 있으며, 바이러스 카피 수와 대략 동등하다. 타액 샘플에서 바이러스 카피 수를 결정하는 한 가지 가능한 해결책은 ddPCR이며, 이는 반응에서 유전자 카피의 하드 정량화를 제공한다. 그러나 우리는 임상의에게 질적 인 결과를 제공하는 것이 적절하다고 생각하며 상대적 바이러스 함량은 우리의 방법으로 처리 된 샘플에서 비교 될 수 있습니다.
타액을 사용할 때 발생하는 몇 가지 제한 사항에도 불구하고 타액 기반 RT-qPCR에 의한 SARS-CoV-2 분석은 모든 규모의 테스트에서 빠르고 신뢰할 수있는 바이러스 RNA 검출을위한 효과적인 방법임이 입증되었습니다. 이것은 오픈 소스 액체 처리 시스템의 활용과 결합 될 때 특히 그렇습니다. 이러한 시험 접근법은 감염성 질환 작용제, 질병 마커, 또는 다른 바이러스와 같은 진단과 관련된 다른 핵산 서열을 검출하도록 변형될 수 있다. 이것은 분석이 임상 및 연구 진단 노력 모두에 적용 할 수있게 해줍니다.

신종 코로나바이러스인 중증급성호흡기증후군과 관련된 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2)는 2019년 말에 출현하여 전 세계 인구에 빠르게 퍼졌다1. SARS-CoV-2 감염은 잠재적으로 심각한 호흡기 및 염증 증상을 가진 전염성이 높은 질병 인 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19)를 유발합니다. 높은 전염성과 낮은 사망률은 바이러스가 인구를 통해 빠르게 확산 될 것이며 진단 검사를 증가시켜야한다는 것을 나타 냈습니다.2,3. 공중 보건 권고안은 사례를 격리하고 전염률을 줄이기 위해 광범위한 인구 검진을 장려했습니다.4,5,6. 또한, 집단 감시 모델은 테스트 빈도를 늘리고 보고 시간을 줄이는 것이 테스트 감도를 높이는 것보다 전송을 줄이는 데 더 큰 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다7. 이것은 감염된 개인이 더 일찍 격리되어 감염의 사슬을 끊을 수 있기 때문일 수 있습니다.
원래의 핵산 증폭 시험 (NAAT) 표준은 RT-qPCR8에 의해 처리된 비인두 (NP) 면봉이었다. 그러나 상대적 비용 증가 및 공급망 압력 악화와 같은 매우 많은 인구에 대한 이러한 형태의 테스트로 인해 합병증이 발생합니다9,10. 또한, 일반적인 NAAT 방법(NP 면봉, 구인두 면봉, 중간 터비네이트 면봉 및 비강 면봉 포함)의 표본 수집 및 처리 모두 특수 장비, 시약 및 의료 인력에 의존합니다9,10.
NP 면봉 RT-qPCR 검사의 적절한 대체품은 SARS-CoV-2 검출을위한 정확한 진단 도구 인 타액 기반 검사입니다11,12,13,14. 타액 샘플에서 RT-qPCR을 직접 수행하면 NP 면봉15와 유사한 민감도 및 특이성이 생성됩니다. 타액 검사가 NP 면봉 검사보다 갖는 한 가지 주요 이점은 시편의 자체 수집을 허용한다는 것입니다16. 이것은 의료진의 필요성을 최소화하고 NP 면봉보다 덜 침습적이어서 환자의 샘플 수집의 용이성을 극대화합니다. 또한, 타액 샘플은 면봉에서 샘플을 제거하기 위해 버퍼를 필요로하지 않기 때문에 (NP 샘플의 경우와 같이), 타액 기반 검사는 열 기반 리보 핵산 (RNA) 추출을 직접 활용할 수 있으며, 이는 추가 버퍼, 수송 매체 및 / 또는 RNA 추출 시약의 필요성을 제거함으로써 테스트 비용을 절감합니다 14,17.
Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab은 COVID-19 테스트 및 감시에 대한 대학의 요구를 해결하기 위해 설립되었습니다. 대학을 포함한 폐쇄 된 인구에서 사회적 거리두기와 결합 된 빈번한 감시 테스트는 질병 유병률의 역학 모델에서 가장 유리한 결과를 낳았습니다18. 통합 CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 및 SalivaDirect14 프로토콜이 적용되었으며 비용을 절감하고 처리 시간을 개선하기 위해 임상 워크플로우에서 자동화를 활용했습니다. 이전 그룹은 SARS-CoV-2 RNA 추출 단계20,21에 오픈 소스 액체 처리 로봇을 사용했지만 테스트 플레이트를 준비하고 표본을 적재하기 위해 로봇의 사용을 극대화했습니다22. 여기서, 우리는 적응된 프로토콜과 오픈 소스 액체 처리 시스템의 활용(그림 1)이 빠르고 정확한 타액 기반 RT-qPCR을 가능하게 하며 대규모 공중 보건 감시를 위한 효과적인 전략임을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

최근 SARS-CoV-2 글로벌 건강 위기의 출현은 역학 연구 및 임상 테스트를위한 주요 과제를 도입했습니다. 전염률이 높고 사망률이 낮은 것을 특징으로하는 COVID-19 전염병은 특히 주거 대학과 같은 폐쇄 된 인구에서 정확하고 효율적인 진단 테스트가 필요했습니다. 비인두 면봉과 같은 핵산 검사의 초기 가용성은 공급망 압력으로 인해 제한되었으며 이로 인해 테스트 결과의보고가 지연되었습니다. 타액 기반 역전사 효소 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR) 검사는 다른 검사 방법에 대한 민감도와 특이성에서 필적하는 것으로 밝혀졌으며 타액 수집은 참가자에게 신체적으로 덜 침습적입니다. 결과적으로, 우리는 클렘슨 대학과 주변 지역 사회의 인구 감시를위한 멀티플렉스 RT-qPCR 진단 분석을 개발했습니다. 이 분석은 복잡한 임상 자동화 시스템 대신 오픈 소스 액체 처리 로봇과 열 사이클러를 활용하여 워크 플로우와 시스템 유연성을 최적화했습니다. 타액 기반 RT-qPCR의 자동화를 통해 대규모 및 소규모 테스트 요구 사항에 대해 광범위한 바이러스 RNA 농도를 신속하고 정확하게 탐지할 수 있습니다. 자동화 시스템의 평균 턴어라운드는 샘플의 95%에 대해 < 9시간, 샘플의 99%에 대해 24시간 <었습니다. 단일 시험의 비용은 모든 시약을 대량으로 구입할 때 $ 2.80이었습니다.

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Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

이 프로토콜은 오픈 소스 자동화를 활용하여 타액 샘플의 RT-qPCR 분자 테스트를 수행하는 SARS-CoV-2 진단 방법을 설명합니다. 이 확장 가능한 접근 방식은 임상 공중 보건 감시뿐만 아니라 소규모 대학 실험실의 용량을 늘리는 데 적용될 수 있습니다.

오픈 소스 피펫팅 로봇을 활용한 효율적인 SARS-CoV-2 정량적 역전사효소 PCR 타액 진단 전략

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

우리는 대규모 커뮤니티 스크리닝 응용 프로그램을 위해 구현하고 확장하기 쉬운 저렴한 타액 기반 COVID 19 진단 테스트 및 워크 플로우를 개발했습니다. 여기서 우리는 오픈 소스 액체 처리 로봇, 표준 온도 조절기 및 소프트웨어를 사용하여 추출 또는 안정화 버퍼없이 타액의 직접 테스트를 수행하면서 정확한 진단 결과를 제공합니다. 자동화된 병렬 워크플로우가 단순하기 때문에 최소한의 장비, 공간 및 인력 요구 사항으로 매일 수천 건의 테스트를 수행하도록 시스템을 확장할 수 있습니다.카일리 킹 외에도 임상 실험실 감독자이자 오스틴 스마더스 교육 코디네이터인 레이첼 햄(Rachel Ham)은 70% 에탄올로 타액 수집 튜브 외부를 오염제거하고 테스트를 위해 실험실로 옮겨 시작하는 절차를 시연하는 데 도움을 줄 것입니다. 각 샘플 바코드를 일일 섭취량 스프레드시트로 스캔하여 샘플 도착을 기록합니다. 스캔된 샘플을 섭씨 95도 오븐에서 30분 동안 열처리한 다음, 내열 장갑을 사용하여 샘플을 제거하였다.샘플 할당 스테이션에서 각 샘플 로딩 로봇에 대한 일일 샘플 로딩 스프레드시트를 엽니다. 그런 다음 각 384 웰 플레이트에 188 개의 샘플을 할당하십시오. 트레이에 플레이트 이름, 날짜 및 분기 번호로 레이블을 지정합니다.샘플을 순서대로 스캔하여 샘플 로딩 스프레드시트로 들어갑니다. 샘플 로딩 스테이션에서 로봇의 데크 배치에 해당하는 여덟 개의 3D 프린트 랙으로 구성된 두 개의 전체 세트를 정렬합니다. 쿼터 1개의 튜브의 캡을 풀고 랙 1의 A1 위치부터 시작하여 3D 프린트된 랙에 놓습니다.각 랙을 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 채웁니다. 이 로딩 패턴을 랙 두 개에서 계속한 다음, 랙 네 개와 다섯 개로 진행하십시오. 적재된 쿼터 하나의 샘플 랙을 데크에 1개, 두 개, 네 개, 다섯 개, 일곱 개, 여덟 개, 10개, 11개 배치합니다.P20 팁을 세 개와 아홉 개의 갑판에 놓습니다. 설정 프로세스를 단순화하려면 로봇에 재료를 앞뒤로 로드합니다. 마스터 믹스 플레이트는 전용 로봇에서 생산되며 섭씨 네 도에 보관됩니다.한 번에 하나의 플레이트가 사용되며 플레이트 이름이 표시되어 있으며 날카로운 블레이드를 사용하여 제어 웰 주변의 호일에 선을 자릅니다. 마스터 믹스 플레이트를 데크 여섯 개에 놓고 호일 커버를 벗겨 내고 컨트롤 웰을 덮고있는 작은 사각형을 남겨 둡니다. 팁 박스를 발견하고 로봇을 닫습니다.로봇 데스크톱 응용 프로그램을 통해 실행 시작을 클릭하여 사용자 지정 Python 운영 프로토콜을 초기화합니다. 매 분기마다 플레이트에로드하는 데 24.5 분이 걸립니다. 타이머를 미리 알림으로 설정합니다.로봇이 작동하는 동안 두 개의 샘플 튜브를 캡을 풀고 두 번째 3D 인쇄 랙 세트에 로드합니다. 로봇이 일시 중지되면 분기 하나의 랙을 제거하고 분기 두 개의 랙으로 교체한 다음 데스크톱 응용 프로그램에서 다시 실행을 클릭합니다. 분기 하나의 샘플 튜브를 요약하여 결과를 기다리는 동안 섭씨 네 도의 냉장고에 보관하십시오.이 로딩 과정을 분기 셋과 넷에 대해 반복하십시오. 적재 된 플레이트를 바이오 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 오염을 최소화하려면 이송 중에 플레이트를 덮어 두십시오.반복 샘플을 수집하여 네 번째 분기의 마지막 샘플로 할당합니다. 샘플 번호를 매기고 바코드를 스캔한 다음 원래 샘플 위치와 결과를 샘플 로딩 스프레드시트에 입력합니다. 반복 샘플을 바이오 안전 캐비닛으로 옮깁니다.반복 샘플 튜브를 로봇 로딩 랙에 로드하지 마십시오. 각 반복 샘플의 두 마이크로 리터를 올바른 웰에 피펫하십시오. 지정된 피펫을 사용하여 환자 샘플을 추가합니다.오염을 최소화하기 위해 샘플을 추가하는 동안 호일로 덮인 제어 웰을 유지하십시오. 포셉을 사용하여 제어 웰 위에 호일 커버를 벗겨냅니다. 확인된 양성 환자 샘플 2마이크로리터를 웰 M23 및 M24에 피펫팅한다.N23 내지 N24를 웰에 2 마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터와 웰스 O23 내지 O24에 양성 대조군을 혼합한 마이크로리터 당 200 마이크로리터의 피펫. 웰 P23 ~ P24를 비워 두어 마스터 믹스 배치 품질을 모니터링합니다. 플레이트를 광학적으로 투명한 씰로 덮고 어플리케이터 롤러를 사용하여 모든 웰에 씰을 부착하십시오.플레이트를 2, 500 RPM에서 30초 동안 볼텍스하여 완전히 혼합한 다음, 플레이트를 500배 G에서 1분 동안 원심분리한다. thermocycler 소프트웨어에서 프로토콜 프로그램을 선택하고 향후 플레이트를 위해 프로토콜을 저장하십시오. 밀봉 된 플레이트를 열 순환기에 놓고 프로토콜을 실행하십시오.CT 값을 내보내고 값을 샘플 로딩 스프레드시트에 복사합니다. 양성 대조군의 경우, 적어도 하나의 양성 대조군 웰이 P1 및 N1 프로브 모두에 대해 22에서 28 사이의 CT 값을 생성하는지 확인하십시오. 대안적으로, 공지된 양성 샘플 웰은 P1 및 N1 프로브 상에서 33 미만의 P1 및 N1 CT 값을 생성한다.음성 대조군의 경우 두 개의 음성 대조군 웰 중 하나에 N1 또는 P1 CT 값이 없는지 확인하십시오. 플레이트를 무효화하기 전에 CT 값에 유효한 증폭 곡선이 있는지 확인합니다. P1이 CT의 결과를 33보다 적게 생성하는 경우, 유효함을 고려하고 N1의 결과로 진행하십시오. P1이 CT가 33보다 크거나 같거나 CT 값이 없는 결과를 생성하는 경우 해당 결과가 유효하지 않은 것으로 간주합니다.N1이 CT의 결과를 33 미만으로 생성하는 경우, 예 뿐만 아니라 도 평가한다. N1이 CT 값을 생성하지 않는 경우, 아니오 뿐만 아니라 도 평가한다. N1이 33보다 크거나 같은 CT 값을 생성하면 별이 없는 상태도 평가합니다.모든 N1 CT 값이 실제 증폭 곡선과 연관되어 있는지 확인합니다. N1에 대한 CT 값이 증폭 곡선이 없는 경우, 웰은 아니오이다. 반복 샘플을 식별하고 내부 샘플 번호 및 샘플 유형으로 레이블을 지정한 다음 로딩 워크플로로 반환합니다.대표적인 이미지는 N1 또는 SARS CoV-2 합성 RNA 및 P1 또는 HSRPP30 합성 DNA의 RTQ PCR 검출을 보여준다. 표준 곡선은 이러한 프로브 프라이머 조합을 사용하여 정확한 검출의 범위를 결정하기 위해 표준 편차로 플롯팅되었다. 각각의 희석액에서 수득된 평균 CT 값을 합성 RNA 및 합성 DNA의 추정된 양에 대해 플롯팅하였다.두 경우 모두에서, 선형 곡선은 광범위한 유전자 카피 농도에 걸쳐 양호한 상관 계수를 보였다. 로봇 및 수동 샘플 로딩 둘 다를 사용하여 독특한 샘플로부터 수득된 N1 CT 값을 수동 로딩과 로봇 로딩 사이의 인터 어세이 가변성을 결정하기 위해 트랜스포즈하였다. 수동 방법과 자동화 된 방법 간의 선형 관계는 두 방법이 기능적으로 동등하다는 것을 나타내는 높은 상관 계수를 생성했습니다.인트라 어세이 가변성은 또한 로봇 및 수동 샘플 로딩 둘 다로부터 수득된 전이된 복제 N1 CT 값을 사용하여 결정되었다. 타액의 점도 감소를 위한 열처리 방법의 평가가 여기에 제시되어 있다. SARS CoV-2 음성 타액은 단일 공급원으로부터 수집되었고, 분취량은 섭씨 95도에서 0분, 30분 또는 60분 동안 열처리되었다.각 조건의 기술적 반복실험으로부터의 P1 CT 값을 치료 방법 사이의 가변성을 결정하기 위해 플롯팅하였다. 30분 및 60분 열처리 방법 모두 처리 대조군이 없는 것에 비해 시료 가변성이 현저히 감소하였다. 30분 치료와 60분 치료 사이에는 유의한 차이가 없었다.따라서 처리 시간을 줄이기 위해 30분 열처리 방법을 구현하였다. 적절한 무균 기술을 사용하여 특히 수동 샘플 및 컨트롤을 적재 할 때 테스트 플레이트의 오염을 최소화하십시오. 손이나 소매로 접시를 건너지 마십시오.임상 결과가 생성된 후, 샘플은 생물학적 유해성 폐기물에 폐기되거나 특정 균주를 결정하기 위해 전체 게놈 시퀀싱과 같은 추가 분석을 위해 저장될 수 있다. 이 기술을 통해 광범위한 지역 사회 테스트를 통해 검사 적용 범위와 Covid 19의 무증상 확산의 영향을 조사 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

연구

면역학 및 감염병학

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...