Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Forfatterne takker Clemsons administrasjon, medisinske ansatte og kliniske laboratorieansatte ved REDDI Lab som hjalp til med å implementere og administrere SARS-CoV-2-testing. Vi takker Dr. Phillip Buckhaults og Dr. Carolyn Bannister fra University of South Carolina for innledende prosjektrådgivning og bransjekontakter for anskaffelser av utstyr. Vi takker mange studenter, professorer og ansatte for deres hjelp i utvalgsinnsamling. Takk til Creative Inquiry studenter for standard kurve datainnsamling. Støtten til denne studien ble mottatt fra National Institutes of Health grant P20GM121342 (tildelt DD og LGP), Clemson Athletic Department, Clemson University's Vice President for Research og South Carolina Governor &Joint Bond Review Committee.

All forskning ble utført i samsvar med Clemson University og Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1. juli 2020).
1. Oppsett av åpen kildekode væskehåndteringsrobot
<ol><li>Installer høyeffektive partikkelluftfiltermoduler (HEPA) (se Materialtabell) øverst på hver væskehåndteringsrobot i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	<li>Fest en 8-kanals P20-pipette til venstre montering av hovedblandingsplateforberedelsesroboten(e) i henhold til produsentens anvisninger.</li>
	<li>Fest en P20-pipette til høyre montering av prøvelasteroboten(e) i henhold til produsentens anvisninger.</li>
	<li>Last ned de egendefinerte Python-skriptene (Tilleggsfil 1 og Tilleggsfil 2) på de aktuelle datamaskinene.</li>
	<li>Åpne TigerSaliva Full 384 Loading.py i skrivebordsapplikasjonen på prøvelastingsrobotdatamaskinene. Klikk kalibrer og konfigurer både pipetten og programmet i henhold til programvareanvisninger.</li>
	<li>Åpne 12 Full Plates.py i skrivebordsapplikasjonen på hovedmiksrobotdatamaskinen. Klikk kalibrer og konfigurer både pipetten og programmet i henhold til programvareanvisninger.</li>
	<li>Skriv ut egendefinerte eksempelstativer med en tredimensjonal 3D-skriver (fused deposition modeling) ved hjelp av en CAD-fil (computer-aided design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Skriv ut 16 stativer per prøvelasterobot for to sett med åtte stativer.</li>
</ol>2. Tilberedning av 20x multiplex N1+P1 sonde/primerblanding
<ol><li>Forbered en batch med 20x multipleks N1+P1 sonde/primerblanding (totalt volum 20 ml, tabell 1) i et konisk rør på 50 ml i et sterilt miljø borte fra syntetiske SARS-CoV-2 RNA- eller pasientprøver.</li>
	<li>Aliquot 1,6 ml av blandingen ved hjelp av en serologisk pipette i sterile 2,0 ml sentrifugerør og etikett på riktig måte.</li>
	<li>Oppbevar aliquots i en -20 °C fryser til den er klar til bruk.</li>
</ol>3. Fremstilling av positiv kontrollblanding
MERK: Positiv kontrollblanding må ikke gjøres i samme sterile miljø som probe-/primerblanding eller andre mastermikskomponenter. En separat beholder med nukleasefritt vann bør brukes.
<ol><li>Fortynn SARS-CoV-2 syntetisk RNA (N1) fra 1000 000 genkopier/μL (cpμ) til 10 000 cpμ ved å tilsette 10 μL lagerløsning til 990 μL nukleasefritt vann. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ i sterile 0,2 ml rør og etikett på riktig måte. Oppbevar ubrukte aliquots ved -80 °C. MERK: Syntetisk RNA må oppbevares ved -80 °C for å unngå nedbrytning.</li>
	<li>Fortynn Hs_RPP30 syntetisk DNA (P1) fra 200.000 cpμ til 10.000 cpμ ved å tilsette 50 μL lagerløsning til 950 μL nukleasefritt vann. Aliquot 25 μL 10.000 cpμ i sterile 0,2 ml rør og etikett på riktig måte. Oppbevar ubrukte aliquots ved -80 °C.</li>
	<li>Fortynn hver komponent til en endelig konsentrasjon på 200 cpμ ved å tilsette 20 μL av både SARS-CoV-2 og Hs_RPP30 10.000 cpμ-lagre til 960 μL nukleasefritt vann, for totalt 1000 μL. Aliquot 20 μL blandet 200 cpμ positiv kontroll i 0,2 ml rør og etikett på riktig måte. Oppbevar aliquots ved -80 °C til de er klare til bruk.</li>
</ol>4. Tilberedning av master mix plater
MERK: Lag master mix i et sterilt miljø vekk fra syntetiske SARS-CoV-2 RNA eller pasientprøver. Alle komponenter må tines helt før de legges til blandingen; uten riktig opptining, kan konsentrasjonene være feil. Utilstrekkelig opptining indikeres ved tilstedeværelse av is eller ujevn farge på reagenser. Oppbevars på en fryseblokk mens du forbereder blandingen.
<ol><li>Forbered en batch multipleks master mix (totalt volum på 48 ml, tabell 2) i et 50 ml konisk rør.</li>
	<li>Homogeniser blandingen ved å snu røret over 3x. Ikke bland ved pipettering opp og ned eller vortexing, da dette vil skade enzymet.</li>
	<li>Fyll kolonne 1-4 i et sterilt 96-brønns dyp brønnreservoar ved å overføre 1,48 ml masterblanding i hver brønn. En 50 ml konisk fyller fire kolonner, nok til 12 plater.</li>
	<li>Dekk dypbrønnreservoaret med en folietetning og legg det i den dedikerte master mix væskehåndteringsroboten. Plasser det fylte dypbrønnreservoaret på dekk 10, plasser seks tomme 384-brønnsplater på dekk 1-6, og P20-spissboksen på dekk 11. Avdekk den dype brønnplaten og spissboksene og lukk roboten.</li>
	<li>Initialiser den egendefinerte Python-driftsprotokollen ved å klikke Start kjøring i robotskrivebordet.</li>
	<li>Etter 40 min vil løpet stoppe midlertidig. Dekk de fylte 384 brønnplatene med folietetninger mens de forblir i roboten og trykk ned med rullen for å sikre overholdelse. Merk kanten på hver plate med en batchidentifikator.</li>
	<li>Plasser seks nye tomme 384-brønnsplater på dekk 1-6 og fortsett driftsprotokollen ved å klikke på Fortsett kjøring. Etter at løpet er fullført, dekk det endelige settet med 384 brønnplater med folietetninger.</li>
	<li>Pipette 2 μL av den gjenværende hovedblandingen i kolonne 1-3 og 22-24 av en tom 384-brønnsplate for batchkvalitetskontroll. Tetning med en optisk klar forsegling og kjør på termosykleren (avsnitt 10.1-10.2). Hvis noen brønner har N1-terskelsyklusverdier (Ct), eller hvis mer enn 10 brønner har P1 Ct-verdier, er partiet forurenset og kan ikke brukes.</li>
	<li>Oppbevar de tilberedte masterblandingsplatene ved 4 °C og bruk dem innen 7 dager etter tilberedning.</li>
</ol>5. Prøvetaking, inntak og varmebehandling
<ol><li>Be deltakerne unngå å spise, drikke, røyke eller gjennomføre tannhygiene 30 min før spyttsamlingen. Be deltakerne samle minst 1 ml spytt som naturlig bassenger i munnen og deponere det i et sterilt 50 ml konisk rør uten konserveringsmidler, og deretter hette røret (Tilleggsfil 3).</li>
	<li>Dekontaminere utsiden av spyttoppsamlingsrør med 70% etanol eller desinfiserende våtservietter og overfør dem til laboratoriet for testing.</li>
	<li>Registrer eksempelankomst ved å skanne hver prøvestrekkode inn i det daglige inntaksregnearket (Tilleggsfil 4).</li>
	<li>Varmbehandle de skannede prøvene i 30 min i en ovn på 95 °C. Fjern prøver mens du bruker varmebestandige hansker. MERK: Ubehandlede prøver er stabile ved romtemperatur (23 °C) i opptil 72 timer. Når de er varmebehandlet, må prøvene oppbevares ved 4 °C, hvis de ikke behandles umiddelbart.</li>
</ol>6. Eksempeloppgave
<ol><li>Åpne de daglige eksempelinnlastingsregnearkene for hver prøvelasterobot (Tilleggsfil 5) på datamaskinen på prøveoppdragsstasjonen.</li>
	<li>Tilordne 188 prøver til hver 384-brønnsplate på følgende måte: Prøver 1-48 regnes som kvartal 1, prøver 49-96 regnes som kvartal 2, prøver 97-144 regnes som kvartal 3, og prøver 145-188 regnes som kvartal 4. Eksemplet analyseres i duplikat.</li>
	<li>Etikettbrett med platenavn, dato og kvartalsnummer. Skann eksemplene for å komme inn i regnearket for eksempelinnlasting. MERK: Prøver fra tidligere plater må kanskje kjøres manuelt, som definert i figur 3. Se pkt. 8.1-8.3 for manuell prøveoppgave og lasteinstruksjoner.</li>
</ol>7. Bruk av prøvelastingsroboter
<ol><li>På prøvelastestasjonen stiller du opp to komplette sett med åtte 3D-trykte stativer som tilsvarer dekkplasseringen i roboten.</li>
	<li>Løsne kvart 1 rør og plasser i 3D-trykte stativer, fra og med posisjon A1 i rack 1. Fyll hvert stativ fra venstre mot høyre og fra topp til bunn. Fortsett dette lastemønsteret i rack 2, og fortsett deretter til rack 4 og 5 (se figur 2C). MERK: Stativer nummereres ikke fortløpende på grunn av robotprogramparametrene.</li>
	<li>Plasser ladede prøvestativer for kvartal 1 på dekk 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Plasser P20-spisser på dekk 3 og 9. For å forenkle oppsettsprosessen, last materialer fra baksiden til forsiden inn i roboten.</li>
	<li>Ta en ferdiglaget master mix plate fra 4 °C, merk den med platenavn og bruk et skarpt blad til å kutte en linje i folien rundt kontrollbrønnene (N23/24, O23/24 og P23/24).</li>
	<li>Plasser hovedblandingsplaten på dekk 6 og skrell bort foliedekselet, og la det lille rektangelet dekke kontrollbrønnene. Avdekk tuppboksene og lukk roboten.</li>
	<li>Initialiser den egendefinerte Python-driftsprotokollen ved å klikke Start kjør gjennom robotskrivebordet. Hvert kvartal tar 24,5 min å laste på platen; angi en tidtaker som en påminnelse.</li>
	<li>Mens roboten går, løsner og laster du kvart 2 prøverør inn i det andre settet med 3D-trykte stativer som beskrevet i avsnitt 7.2.</li>
	<li>Når roboten stopper midlertidig, fjerner du 1. kvartalsstativ og bytter dem ut med 2.kvartalsstativer. Klikk Fortsett kjøring i skrivebordsprogrammet.</li>
	<li>Recap kvart 1 prøverør og lagre dem i et 4 °C kjøleskap mens du venter på resultater. Gjenta denne lasteprosessen for kvartal 3 og 4.</li>
	<li>Overfør den ladde platen til et biosikkerhetsskap. For å minimere forurensning, hold platen dekket under overføringen.</li>
</ol>8. Manuell prøvelasting
MERK: Utfør en enkelt manuell kjøring på gjentatte prøver (N1 Kjør på nytt eller Kjør på nytt, se figur 3) ved utilstrekkelig robotbelastning.
<ol><li>Samle eventuelle gjentatte prøver og tilordne dem som de siste prøvene i kvartal 4 (se pkt. 6.2). Nummerer prøver, skann strekkodene og skriv inn den opprinnelige prøveplasseringen og resultat i regnearket for prøveinnlasting.</li>
	<li>Overfør gjentatte prøver til biosikkerhetsskapet. Ikke last gjentatte prøverør inn i robotlastestativene.</li>
	<li>Pipette 2 μL av hver repetisjonsprøve til de riktige brønnene etter plateoppsettdiagrammet (Tilleggsfil 6). Bruk en angitt pipette for å legge til pasientprøver. Hold kontrollbrønnene dekket med folie mens du legger til prøver for å minimere forurensning.</li>
</ol>9. Tillegg av kontroller til testplater
<ol><li>Skrell bort foliedekselet over kontrollbrønner ved hjelp av tang.</li>
	<li>Pipette 2 μL nukleasefritt vann (ingen malkontroll) til brønnene N23-N24 og 2 μL 200 cpμ blandet positiv kontroll (se avsnitt 3) til brønnene O23-O24. Pipette 2 μL av en bekreftet positiv pasientprøvekontroll i brønnene M23-M24 som en ekstra kontroll. La brønnene P23-P24 stå tomme for å overvåke master mix batch kvalitet.</li>
	<li>Dekk platen med en optisk klar forsegling og bruk applikatorvalsen til å feste forseglingen til alle brønner. Virvel platen ved 2500 rpm i 30 sek for å blande grundig. Sentrifuger platen på 500 x g i 1 min.</li>
</ol>10. Utføre RT-qPCR
<ol><li>Lag et protokollprogram i termosirkuleringsprogramvaren i henhold til betingelsene som er beskrevet (tabell 3). Lagre protokollen for fremtidige plater. Plasser den forseglede platen i termosykleren og kjør protokollen.</li>
	<li>Eksporter Ct-verdier som en XSLX-fil, og kopier verdiene til regnearket for innlasting av eksempel (tilleggsfil 5). MERK: Disse arkene ble spesialdesignet for Ct-utdatafiler fra produsentprogramvare og kan trenge endring for å godta andre formater.</li>
</ol>11. Bestemme platevalighet
<ol><li>Valider både den positive kontrollen og/eller kjente positive prøver og den negative kontrollen for å betrakte plateresultatene som gyldige. Vurder kontrollbrønnene med følgende kriterier.<ol>
<li>For positiv kontroll, sjekk om minst en positiv kontrollbrønn (O23/O24) produserer Ct-verdier på mellom 22-28 for både P1- og N1-sonder. Alternativt produserer de kjente positive utvalgsbrønnene (M23/M24) P1- og N1 Ct-verdier <33 på P1- og N1-sondene.</li>
		<li>For negativ kontroll må du kontrollere at det ikke er noen N1- eller P1 Ct-verdier i en av de to negative kontrollbrønnene (N23/N24). Kontroller at Ct-verdier har gyldige forsterkningskurver før du gjør platen ugyldig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Tolke prøveresultater
<ol><li>Bestem pasientresultatet etter diagrammet (figur 3) og rapporter løste prøver.<ol>
<li>Vurder P1-resultatet som GYLDIG eller UGYLDIG. Hvis P1 gir et resultat av Ct <33, bør du vurdere brønnen VALID og fortsette å følge N1. Hvis P1 gir et resultat av Ct >=33 eller ingen Ct-verdi, bør du vurdere brønnen INVALID.<ol>
<li>Vurder N1-resultatet som JA, NEI eller NEI*. Hvis N1 gir et resultat av Ct <33, er brønnen JA. Hvis N1 ikke produserer en Ct-verdi, er brønnen NEI. Hvis N1 produserer en Ct >=33, er brønnen NO*. Kontroller at alle N1 Ct-verdier er knyttet til en reell forsterkningskurve. Hvis en Ct-verdi for N1 ikke har noen forsterkningskurve, er brønnen NEI.</li>
			<li>Identifiser gjentatte eksempler (N1 Rerun eller Rerun), merk dem med et internt eksempelnummer og eksempeltype, og returner dem til innlastingsarbeidsflyten (avsnitt 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laboratorieopprydding
<ol><li>Roboter for væskehåndtering<ol>
<li>Rengjør alle sider med desinfeksjonsmiddel på mellomnivå. Ikke bruk etanol, da det vil forringe plasten.</li>
		<li>Tørk forsiktig pipettespissenden og avfallsbeholderen med en alkohol (70% etanol eller 100% isopropanol) tørk. Tørk av tastaturet og musen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biosikkerhetsskap<ol>
<li>Rengjør alle overflater med desinfeksjonsmiddel på mellomnivå. Slå på UV-lyset i 15 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre. Analysen beskrevet i protokollen faller inn under SalivaDirect EUA arkivert av Yale School of Public Health.

Analysen beskrevet i protokollen ble vurdert av en uavhengig valideringsstudie. Det ble funnet at analysen hadde 98,9% spesifisitet (1,1% falsk positiv) og 90,0% følsomhet (10,0% falsk negativ) når den ble evaluert mot parrede nasopharyngeal vattpinner tatt samtidig (n =837; 817 negativer, 20 positive). Det er viktig at tre deltakere som testet positivt med TigerSaliva og negativ med en nasopharyngeal vattpinne ble testet på nytt med vattpinner 48 timer senere og returnerte positive resultater, noe som indikerer at TigerSaliva kan være i stand til å oppdage SARS-CoV-2-infeksjoner tidligere i sykdomsforløpet.
Vi simulerte positive spyttprøver ved å spytte virusfri spytt (både varmebehandlet og ikke-varmebehandlet) med kjente konsentrasjoner av SARS-CoV-2 syntetisk RNA og utførte en 10 ganger fortynning for å bestemme Ct-grensen i spytt. N1-genet var ikke påviselig under 10 000 genkopier (ca. Ct = 28) i simulerte positive prøver. Vi mistenker at dette skyldes RNase-forringelse eller andre forvirrende faktorer. Imidlertid er samspillet mellom spytt RNases med naken syntetisk RNA sannsynligvis forskjellig fra samspillet med virale partikler, selv etter at de har blitt denaturert av varme. Positive spyttprøver er identifisert med Ct >30 og eksterne laboratorier innhentet SARS-CoV-2 genetiske sekvensdata fra disse prøvene. Vi spekulerer i at virusproteinene gir beskyttelse mot RNA-nedbrytning i pasientspyttprøver.
Det mest kritiske trinnet i protokollen er implementering av automatisering for master mix forberedelse og spytt prøvebehandling (henholdsvis § 4 og 7). Dette gjør det mulig å overlappe aktivitetsprosesser, noe som reduserer behandlingstiden drastisk. Et annet kritisk skritt er klinisk resultattolkning (§ 11 og 12). Oppretting av mellomliggende resultatkategorier (Rerun og N1 Rerun) reduserte også forekomsten av inkonklusive testresultater.
Vi viste at variasjon mellom manuelle og automatiserte spyttprøvelastingsmetoder er ubetydelig (figur 5A), og at automatisering kan forbedre reproduserbarheten til SARS-CoV-2-deteksjon (figur 5B). Automatisering bør favoriseres for å lette testing når du designer og utvider kliniske laboratorier25. Laboratoriearbeidsflyten forbedres med implementeringen av robotautomatiske oppgaver26. Funksjoner med åpen kildekode for væskehåndteringsrobotene gjør det mulig å gjennomføre egendefinert skripting for protokollutforming. Dette gjør væskehåndteringsroboter til et billig og svært modifiserbart system sammenlignet med tradisjonelle kliniske automatiseringsmetoder. Det er også en ideell strategi for å utføre svært repeterende laboratorieoppgaver. Det høye nivået av tilpassbarhet av systemet betyr frihet til å endre labware (f.eks. oppsamlingsrør, pipettespisser eller 384-brønnsplater) ved mangel. Derfor er automatisering ved bruk av væskehåndteringsroboter levedyktig for både storskala og småskala overvåking og forskning.
En stor fordel med denne teststrategien er en mye kortere behandlingstid i forhold til andre kliniske laboratorier. Utnyttelsen av automatiserte væskehåndteringsroboter spiller en nøkkelrolle i å redusere behandlingstiden, men samtidig bruk av roboter og termosyklere er også medvirkende til å maksimere testeffektiviteten. En robot og termosykler skal betjenes som et par, hvor begge maskinene brukes sammen for uavbrutt prøvelasting og prøveresultatanalyse. Når en jevn strøm av tildelte prøver er etablert, kan alle maskinpar betjenes samtidig. Konstant samtidig bruk av roboter og termosirkler øker testkapasiteten og effektiviteten drastisk, noe som er avgjørende for å imøtekomme det høye testvolumet.
I motsetning til andre etablerte SARS-CoV-2 RT-qPCR-protokoller, inkluderte vi et touchdownsteg i thermocycler-protokollen for å forbedre glødingen av sonden og primersettene til målgenene27, noe som reduserte risikoen for mislykket forsterkning. Resultatene viste at touchdownen forbedret deteksjonen av positive prøver uten å risikere tap av spesifikk primerbinding (tabell 4). Vi fant ut at et bredt spekter av både SARS-CoV-2 RNA-kopier (figur 4A) og Hs_RPP30 DNA-kopier (figur 4B) samtidig kan oppdages av RT-qPCR-analysen.
En begrensning ved væskehåndtering av roboter er muligheten for krysskontaminering fra positive prøver under spyttoverføring. Spytt er en viskoelastisk væske28 og kan binde seg over tilstøtende brønner etter å ha blitt dispensert fra pipettespissen. Videre kan heterogeniteten til spytt29 forårsake ujevn fordeling av viruspartikler gjennom hele prøven. Dette øker muligheten for både falske positiver og negativer, noe som krever betegnelsen på N1 Rerun- og Rerun-prøver. 14,1 % av prøvene som opprinnelig ble angitt som N1 Rerun, ble imidlertid løst som positive for SARS-CoV-2 og var mer enn 30 ganger mer sannsynlige enn Rerun-prøver for å løses som positive etter ny testing. Differensiering av Rerun fra N1 Rerun (figur 3) tillot derfor mer nøyaktig separasjon av potensielt positive prøver, noe som økte følsomheten og spesifisiteten til vår diagnostiske analyse. Andre resulterende parametere for diagnostisk spytttesting gjorde ikke dette skillet12,14,24,30,31.
Spyttprøver kan være vanskelige å pipette på grunn av heterogenitet og viskositet32. Varmebehandling forringer proteiner tilstrekkelig i spyttbiomatrixen, reduserer viskositeten og eliminerer behovet for RNA-ekstraksjonsreagenser9, som var knappe i de tidlige stadiene av pandemien10. Utvidet varmebehandling inaktiverer også nåværende virus33 som muliggjør laboratoriebehandling ved lavere biosikkerhetsnivåer. Følgelig ble en varmebasert RNA-ekstraksjon (beskrevet i pkt. 5.4) implementert for å redusere viskositeten gjennom protein denaturering (figur 6). Basert på resultatene postulerer vi at varmebehandling også kan homogenisere spyttprøver i tillegg til å denaturere proteinbiomatrixen. Andre grupper kombinerte varmebehandling og proteinase K-behandling for å øke homogeniteten9,14,34. Vi valgte å ikke implementere dette trinnet, da det kan denature virion proteiner i en hastighet som etterlater viral RNA utsatt for varmeforringelse35. Videre kan prøvefortynning med proteinase K maskere positive prøver som inneholder færre virale partikler og dermed redusere følsomheten. I tillegg ble analyseresultatene sammenlignet med en kommersielt tilgjengelig spyttbasert SARS-CoV-2-analyse (Logix Smart COVID-19) som bruker magnetisk perle RNA-ekstraksjon (tabell 5). Det ble funnet at dagens analyse var bedre egnet til å oppdage svake positive prøver sammenlignet med den kommersielt tilgjengelige analysen.
Det er vanskelig å kvantifisere viruskopinummer i spytt ved hjelp av bare RT-qPCR, fordi qPCR er semi-kvantitativ. Det er iboende variasjon mellom Ct-verdier som stammer fra tekniske begrensninger. Genkopinummer kan bestemmes fra Ct-verdier (figur 4) og tilsvarer omtrent viralt kopinummer. En mulig løsning for å bestemme viralt kopinummer i spyttprøver er ddPCR, som gir hard kvantifisering av genkopier i reaksjonen. Vi mener imidlertid at det er tilstrekkelig å gi kvalitative resultater til klinikere, og relativt viralt innhold kan sammenlignes på tvers av prøver som behandles med metodene våre.
Til tross for noen begrensninger som oppstår ved bruk av spytt, viser SARS-CoV-2-analysen ved spyttbasert RT-qPCR seg å være en effektiv metode for rask og pålitelig viral RNA-deteksjon i alle skalaer av testing. Dette gjelder spesielt når det kombineres med bruken av åpen kildekode væskehåndteringssystemer. Denne testtilnærmingen kan endres for å oppdage andre nukleinsyresekvenser som er relevante for diagnostikk, for eksempel smittsomme sykdomsmidler, sykdomsmarkører eller andre virus. Dette gjør analysen gjeldende for både klinisk og forskningsdiagnostisk innsats.

Alvorlig akutt respiratorisk syndrom-assosiert coronavirus-2 (SARS-CoV-2), et nytt koronavirus, dukket opp i slutten av 2019 og spredte seg raskt over hele den globale befolkningen1. SARS-CoV-2-infeksjonen forårsaker koronavirussykdom 2019 (COVID-19), en svært smittsom sykdom med potensielt alvorlige respiratoriske og inflammatoriske symptomer. Høy transmissibility kombinert med lav dødelighet indikerte at viruset ville spre seg raskt gjennom populasjoner og ville kreve økt diagnostisk testing2,3. Folkehelseanbefalinger oppfordret til omfattende befolkningsscreening for å isolere saker og deretter redusere overføringsratene4,5,6. Videre viste modeller for befolkningsovervåking at økende testfrekvens og redusert rapporteringstid hadde større effekt på å redusere overføring enn å øke testfølsomheten7. Dette er sannsynligvis fordi smittede individer kan bli satt i karantene tidligere, og dermed bryte infeksjonskjeder.
Den opprinnelige standarden for nukleinsyreforsterkning (NAAT) var nasofaryngeal (NP) vattpinner behandlet av RT-qPCR8. Komplikasjoner oppstår imidlertid med denne formen for testing for svært store populasjoner, for eksempel økte relative kostnader og forverret press fra leverandørkjeden9,10. Videre er både prøveinnsamling og behandling av vanlige NAAT-metoder (inkludert NP-vattpinner, orofaryngeale vattpinner, mid-turbinate vattpinner og nesepinner) avhengige av spesialisert utstyr, reagenser og medisinsk personell9,10.
En tilstrekkelig erstatning for NP vattpinne RT-qPCR-testing er spyttbasert testing, som er et nøyaktig diagnostisk verktøy for SARS-CoV-2-deteksjon11,12,13,14. Direkte utførelse av RT-qPCR på spyttprøver gir lignende følsomhet og spesifisitet som NP vattpinner15. En stor fordel spytt testing har over NP vattpinne testing er at det tillater selvoppsamling av prøver16. Dette minimerer behovet for medisinsk personell og maksimerer enkel prøveinnsamling for pasienter ved å være mindre invasiv enn NP-vattpinner. I tillegg, siden spyttprøver ikke krever buffere for å fjerne prøven fra en vattpinne (som ved NP-prøver), kan spyttbaserte tester utnytte varmebasert ribonukleinsyre (RNA) ekstraksjon direkte, noe som reduserer testkostnadene ved å fjerne behovet for ekstra buffere, transportmedier og / eller RNA-ekstraksjonsreagenser14,17.
Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab ble etablert for å møte universitetets behov for COVID-19-testing og overvåking. I lukkede populasjoner, inkludert universiteter, ga hyppig overvåkningstesting kombinert med sosial distansering de gunstigste resultatene i epidemiologiske modeller for sykdomsprevalens18. De konsoliderte protokollene CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 og SalivaDirect14 ble tilpasset, og automatisering ble brukt i den kliniske arbeidsflyten for å redusere kostnader og forbedre behandlingstiden. Tidligere grupper hadde brukt åpen kildekode væskehåndteringsroboter for SARS-CoV-2 RNA-ekstraksjonstrinn20,21, men vi maksimerte bruken av robotene for å forberede testplater og lastprøver22. Her viser vi at den tilpassede protokollen og bruken av åpen kildekode væskehåndteringssystemer (figur 1) gir mulighet for rask og nøyaktig spyttbasert RT-qPCR og er en effektiv strategi for storskala folkehelseovervåking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

Fremveksten av den nylige globale helsekrisen SARS-CoV-2 introduserte viktige utfordringer for epidemiologisk forskning og klinisk testing. Covid-19-pandemien er preget av høy overføring og lav dødelighet, og nødvendiggjorde nøyaktig og effektiv diagnostisk testing, spesielt i lukkede populasjoner som boliguniversiteter. Den første tilgjengeligheten av nukleinsyretesting, som nasopharyngeal vattpinner, var begrenset på grunn av forsyningskjedetrykk som også forsinket rapportering av testresultater. Spyttbasert omvendt transkripsjons kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) testing har vist seg å være sammenlignbar i følsomhet og spesifisitet med andre testmetoder, og spyttsamling er mindre fysisk invasiv for deltakerne. Følgelig utviklet vi en multiplex RT-qPCR diagnostisk analyse for befolkningsovervåking av Clemson University og det omkringliggende samfunnet. Analysen benyttet åpen kildekode væskehåndteringsroboter og termosyklere i stedet for komplekse kliniske automatiseringssystemer for å optimalisere arbeidsflyt og systemfleksibilitet. Automatisering av spyttbasert RT-qPCR muliggjør rask og nøyaktig deteksjon av et bredt spekter av virale RNA-konsentrasjoner for både store og småskala testkrav. Den gjennomsnittlige snuoperasjonen for det automatiserte systemet var < 9 timer for 95% av prøvene og < 24 timer for 99% av prøvene. Kostnaden for en enkelt test var $ 2.80 da alle reagenser ble kjøpt i bulkmengder.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Protokollen beskriver en SARS-CoV-2 diagnostisk metode som bruker åpen kildekode-automatisering for å utføre RT-qPCR molekylær testing av spyttprøver. Denne skalerbare tilnærmingen kan brukes på klinisk folkehelseovervåking samt for å øke kapasiteten til mindre universitetslaboratorier.

Effektiv SARS-CoV-2 kvantitativ omvendt transkripsjon PCR spytt diagnostisk strategi ved hjelp av åpen kildekode pipettering roboter

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Vi har utviklet en lavpris, spyttbasert COVID 19-diagnostikktest og arbeidsflyt som er enkel å implementere og skalere opp for store samfunnsscreeningapplikasjoner. Her bruker vi åpen kildekode væskehåndteringsroboter, standard termosyklere og programvare for å utføre direkte testing av spytt uten ekstraksjons- eller stabiliseringsbuffere, samtidig som vi gir nøyaktige diagnostiske resultater. På grunn av de enkle automatiserte parallelle arbeidsflytene kan systemet skaleres opp for å utføre tusenvis av tester daglig med minimalt med krav til utstyr, plass og personell.I tillegg til Kylie King, rachel ham, vår kliniske lab veileder og Austin Smothers vår utdanningskoordinator, vil bidra til å demonstrere prosedyren Begynn med å dekontaminere utsiden av spytt samling rør med 70% etanol og overføre dem til laboratoriet for testing. Registrer eksempelankomsten ved å skanne hver eksempelstrekkode inn i det daglige inntaksregnearket. Varm opp skanneprøvene i 30 minutter i en 95 graders Celsius-ovn, og fjern deretter prøvene ved hjelp av varmebestandige hansker.Åpne de daglige eksempelinnlastingsregnearkene for hver prøvelasterobot på prøveoppdragsstasjonen. Tildel deretter 188 prøver til hver 384 brønnplate. Etikettbrett med platenavn, dato og kvartalsnummer.Skann eksemplene for å komme inn i regnearket for eksempelinnlasting. På prøvelastestasjonen stiller du opp to komplette sett med åtte 3D-trykte stativer, som tilsvarer dekkplasseringen i roboten. Pakk ut et kvart rør og plasser dem i 3D-trykte stativer, og start med posisjon A1 i rack 1.Fyll hvert stativ fra venstre mot høyre og fra topp til bunn. Fortsett dette lastemønsteret i rack to, og fortsett deretter til stativene fire og fem. Plasser ladede kvarteker på dekk en, to, fire, fem, syv, åtte, 10, 11.Plasser P20-spisser på dekk tre og ni. For å forenkle installasjonsprosessen, last materialer fra baksiden til forsiden inn i roboten. Hovedblandingsplatene produseres på en dedikert robot og lagres ved fire grader Celsius.En plate brukes om gangen og er merket med platenavn, og et skarpt blad brukes til å kutte en linje i folien rundt kontrollbrønnene. Plasser hovedblandingsplaten på dekk seks og skrell bort foliedekselet, og la det lille rektangelet dekke kontrollbrønnene. Avdekk tuppboksene og lukk roboten.Initialiser den egendefinerte Python-driftsprotokollen ved å klikke startkjøring gjennom robotskrivebordet. Hvert kvartal tar 24,5 minutter å laste på platen. Angi en tidtaker som en påminnelse.Mens roboten kjører, løsner og laster du inn to prøverør i det andre settet med 3D-trykte stativer. Når roboten stanser midlertidig, fjerner du de ene kvartalsstativene og erstatter dem med de to kvartalsstativene, og deretter klikker du på Fortsett kjøring i skrivebordsapplikasjonen. Oppsummer kvart en prøverør og lagre dem i et fire grader celsius kjøleskap mens du venter på resultater.Gjenta denne lasteprosessen for kvartal tre og fire. Overfør den ladde platen til et biosikkerhetsskap. For å minimere forurensning, hold platen dekket under overføringen.Samle eventuelle gjentatte prøver og tilordne dem som de siste prøvene i fjerde kvartal. Nummerer prøvene, skann strekkodene og skriv inn den opprinnelige prøveplasseringen og resultatet i eksempelinnlastingsregnearket. Overfør de gjentatte prøvene til biosikkerhetsskapet.Ikke last de gjentatte prøverørene inn i robotlastestativene. Pipette to mikroliter av hver repetisjonsprøve til de riktige brønnene. Bruk den angitte pipetten til å legge til pasientprøver.Hold kontrollbrønnene dekket med folie mens du legger til prøver for å minimere forurensning. Skrell bort foliedekselet over kontrollbrønner ved hjelp av tang. Pipette to mikroliter med bekreftede positive pasientprøver i brønnene M23 og M24.Pipette to mikroliter kjernefri vann til brønnene N23 til N24 og to mikroliter på 200 eksemplarer per mikroliter blandet positiv kontroll til brønn O23 til O24. La brønnene P23 til P24 stå tomme for å overvåke master mix batch kvalitet. Dekk platen med en optisk klar forsegling og bruk applikatorvalsen til å feste forseglingen til alle brønner.Virvel platen ved 2500 RPM i 30 sekunder for å blande grundig, og sentrifuger deretter platen ved 500 ganger G i ett minutt. Velg protokollprogrammet i termocycler-programvaren og lagre protokollen for fremtidige plater. Plasser den forseglede platen i termosykleren og kjør protokollen.Eksporter CT-verdier, og kopier verdiene til regnearket for innlasting av eksempel. For positiv kontroll, sjekk om minst en positiv kontrollbrønn produserer CT-verdier mellom 22 og 28 for både P1- og N1-sonder. Alternativt produserer de kjente positive prøvebrønnene P1- og N1 CT-verdier mindre enn 33 på P1- og N1-sondene.For negativ kontroll må du kontrollere at det ikke er noen N1- eller P1 CT-verdier i noen av de to negative kontrollbrønnene. Kontroller at CT-verdiene har gyldige forsterkningskurver før du gjør platen ugyldig. Hvis P1 gir et resultat av CT mindre enn 33, bør du vurdere brønnen som gyldig og fortsette å bli resultatet av N1. Hvis P1 gir et resultat av CT som er større enn eller lik 33 eller ingen CT-verdi, bør du vurdere brønnen som ugyldig.Hvis N1 gir et resultat av CT mindre enn 33, må du vurdere brønnen som ja. Hvis N1 ikke produserer en CT-verdi, må du vurdere samt nei. Hvis N1 produserer en CT-verdi som er større enn eller lik 33, må du vurdere brønnen og ingen stjerne.Kontroller at alle N1 CT-verdier er knyttet til en reell forsterkningskurve. Hvis en CT-verdi for N1 ikke har noen forsterkningskurve, er brønnen nei. Identifiser de gjentatte eksemplene, merk dem med et internt eksempelnummer og eksempeltype, og returner dem til innlastingsarbeidsflyten.De representative bildene viser RTQ PCR-deteksjon av N1 eller SARS CoV-2 syntetisk RNA og P1 eller HSRPP30 syntetisk DNA. Standardkurver ble plottet inn med standardavvik for å bestemme rekkevidden for nøyaktig deteksjon ved hjelp av denne probeprimerkombinasjonen. De gjennomsnittlige CT-verdiene oppnådd i respektive fortynninger ble plottet mot den estimerte mengden syntetisk RNA og syntetisk DNA.I begge tilfeller viste de lineære kurvene gode korrelasjonskoeffisienter på tvers av et bredt spekter av genkopikonsentrasjoner. N1 CT-verdier hentet fra unike prøver ved hjelp av både roboten og manuell prøvelasting ble transponert for å bestemme variasjonen mellom manuell og robotlasting. Den lineære sammenhengen mellom manuelle og automatiserte metoder ga en høy korrelasjonskoeffisient som indikerer at begge metodene er funksjonelt likeverdige.Intraanalysevariabilitet ble også bestemt ved hjelp av transponerte replikerte N1 CT-verdier hentet fra både roboten og manuell prøvelasting. Evaluering av varmebehandlingsmetoder for viskositetsreduksjon i spytt er vist her. SARS CoV-2 negativ spytt ble samlet inn fra en enkelt kilde og aliquots ble varmebehandlet i enten null minutter, 30 minutter eller 60 minutter ved 95 grader Celsius.P1 CT-verdier fra tekniske replikeringer av hver tilstand ble plottet inn for å bestemme variasjonen mellom behandlingsmetodene. Både 30 minutter og 60 minutter varmebehandlingsmetoder ga betydelig redusert prøvevariabilitet sammenlignet med ingen behandlingskontroll. Det var ingen signifikant forskjell mellom 30 minutter og 60 minutters behandling.Derfor ble den 30 minutters varmebehandlingsmetoden implementert for å redusere behandlingstiden. Bruk riktig aseptisk teknikk for å minimere kontaminering av testplatene, spesielt når du laster inn manuelle prøver og kontroller. Unngå å krysse over platen med hendene eller ermene.Etter at kliniske resultater er produsert, kan prøver avhendes i biofarlig avfall, eller de kan lagres for videre analyse, for eksempel genomsekvensering for å bestemme spesifikke stammer. Denne teknikken tillater bredskala samfunnstesting, noe som gjør at vi kan undersøke effekten av testdekning og den ikke-symptomatiske spredningen av Covid 19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Utnytte Antigen kapsidbindende innlemmelse strategi for utvikling av Adenovirus Serotype 5-vectored Vaksine tilnærminger

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Høy throughput Påvisning av respiratoriske patogener i dyr eksemplarer av nanoskala PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage fra Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 ved hjelp av Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisning av SARS-CoV-2 Nøytraliserende antistoffer ved bruk av fluorescerende avbildning av pseudovirusinfeksjon med høy gjennomstrømning

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En rask, Multiplex Dual Reporter IgG og IgM SARS-CoV-2 nøytraliseringsanalyse for et Multiplexed Bead-basert flytanalysesystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Påvisning av SARS-CoV-2 reseptorbindende domeneantistoff ved hjelp av en HiBiT-basert bioreporter

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levende avbildning og kvantifisering av virusinfeksjon hos K18 hACE2 transgene mus ved hjelp av Reporter-Expressing Rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...