Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Авторы благодарят администрацию Клемсона, медицинский персонал и сотрудников клинической лаборатории в лаборатории REDDI, которые помогли внедрить и управлять тестированием SARS-CoV-2. Мы благодарим д-ра Филиппа Бакхолтса и д-ра Кэролин Баннистер из Университета Южной Каролины за первоначальный консалтинг по проектам и отраслевые контакты по закупкам оборудования. Мы благодарим многих студентов, преподавателей и сотрудников за помощь в сборе образцов. Спасибо студентам Creative Inquiry за стандартный сбор данных кривых. Финансирование этого исследования было получено от гранта Национального института здравоохранения P20GM121342 (присуждается DD и LGP), Спортивного департамента Клемсона, вице-президента по исследованиям Университета Клемсона и Комитета губернатора Южной Каролины и Объединенного комитета по рассмотрению облигаций.

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать. Анализ, описанный в протоколе, подпадает под действие SalivaDirect EUA, поданного Йельской школой общественного здравоохранения.

Анализ, описанный в протоколе, был оценен независимым валидационным исследованием. Было обнаружено, что анализ имел 98,9% специфичности (1,1% ложноположительных) и 90,0% чувствительности (10,0% ложноотрицательных) при оценке по парным мазкам из носоглотки, взятым в то же время (n = 837; 817 отрицательных, 20 положительных). Важно отметить, что три участника, которые дали положительный результат с TigerSaliva и отрицательный с мазком из носоглотки, были повторно протестированы с мазками через 48 часов и вернули положительные результаты, указывающие на то, что TigerSaliva может быть в состоянии обнаружить инфекции SARS-CoV-2 ранее в ходе болезни.
Мы смоделировали положительные образцы слюны путем всплеска невирусной слюны (как термически обработанной, так и нетермически обработанной) с известными концентрациями синтетической РНК SARS-CoV-2 и выполнили 10-кратное разведение для определения предела Ct в слюне. Ген N1 не был обнаружен ниже 10 000 копий генов (приблизительно Ct = 28) в смоделированных положительных образцах. Мы подозреваем, что это связано с деградацией РНКазы или другими мешающими факторами. Однако взаимодействие РНаз слюны с голой синтетической РНК, вероятно, отличается от взаимодействия с вирусными частицами, даже после того, как они были денатурированы теплом. Положительные образцы слюны были идентифицированы с помощью Ct >30, и внешние лаборатории получили данные генетической последовательности SARS-CoV-2 из этих образцов. Мы предполагаем, что вирусные белки обеспечивают защиту от деградации РНК в образцах слюны пациентов.
Наиболее важным этапом в протоколе является внедрение автоматизации подготовки мастер-микса и обработки проб слюны (разделы 4 и 7 соответственно). Это позволяет перекрывать процессы задач, что значительно сокращает время выполнения работ. Другим важным этапом является интерпретация клинических результатов (разделы 11 и 12). Установление промежуточных категорий результатов (повторный запуск и повторный запуск N1) также сводило к минимуму возникновение неубедительных результатов испытаний.
Мы продемонстрировали, что различия между ручными и автоматизированными методами загрузки образцов слюны незначительны (рисунок 5A) и что автоматизация может улучшить воспроизводимость обнаружения SARS-CoV-2 (рисунок 5B). Следует отдавать предпочтение автоматизации для облегчения тестирования при проектировании и расширении клинических лабораторий25. Улучшается лабораторный документооборот с реализацией роботизированных автоматизированных задач26. Возможности роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей позволяют реализовать пользовательские сценарии для разработки протоколов. Это делает роботов для обработки жидкостей недорогой и легко модифицируемой системой по сравнению с традиционными методами клинической автоматизации. Это также идеальная стратегия для выполнения повторяющихся лабораторных задач. Высокий уровень настраиваемости системы приводит к свободе изменять лабораторную посуду (например, коллекторные трубки, наконечники пипеток или пластины на 384 скважины) в случае нехватки. Таким образом, автоматизация с использованием роботов для обработки жидкостей жизнеспособна как для крупномасштабного, так и для мелкомасштабного наблюдения и исследований.
Основным преимуществом этой стратегии тестирования является гораздо более короткое время обработки по сравнению с другими клиническими лабораториями. Использование автоматизированных роботов для обработки жидкостей играет ключевую роль в сокращении времени обработки, но одновременное использование роботов и термоциклеров также играет важную роль в максимизации эффективности тестирования. Один робот и термоциклер должны работать как пара, где обе машины используются в тандеме для непрерывной загрузки образцов и анализа результатов проб. Как только постоянный поток назначенных образцов установлен, все пары машин могут работать одновременно. Постоянное одновременное использование роботов и термоциклеров резко увеличивает производительность и эффективность тестирования, что имеет решающее значение для размещения большого объема испытаний.
В отличие от других установленных протоколов SARS-CoV-2 RT-qPCR, мы включили шаг приземления в протокол термоциклера для улучшения отжига набора зонда и праймера к генам-мишеням27, снижая риск неудачной амплификации. Результаты показали, что приземление улучшило обнаружение положительных образцов без риска потери специфического связывания грунтовки (таблица 4). Мы определили, что широкий спектр как копий РНК SARS-CoV-2 (рисунок 4A), так и Hs_RPP30 копий ДНК (рисунок 4B) может быть одновременно обнаружен с помощью анализа RT-qPCR.
Одним из ограничений роботов для обработки жидкостей является возможность перекрестного загрязнения от положительных образцов во время переноса слюны. Слюна представляет собой вязкоупругую жидкость28 и может нанизываться на соседние колодцы после дозирования из кончика пипетки. Кроме того, неоднородность слюны29 может привести к неравномерному распределению вирусных частиц по всему образцу. Это увеличивает вероятность как ложноположительных, так и отрицательных результатов, что требует обозначения образцов N1 Rerun и Rerun. Тем не менее, 14,1% образцов, первоначально обозначенных как N1 Rerun, разрешились как положительные для SARS-CoV-2 и более чем в 30 раз чаще, чем повторные образцы, разрешались как положительные после повторного тестирования. Следовательно, дифференциация Rerun от N1 Rerun (рисунок 3) позволила более точно разделить потенциально положительные образцы, повысив чувствительность и специфичность нашего диагностического анализа. Другие результирующие параметры для диагностического тестирования слюны не сделали этого различия12,14,24,30,31.
Образцы слюны может быть трудно пипеткой из-за неоднородности и вязкости32. Термическая обработка адекватно денатурирует белки в биоматрице слюны, снижая вязкость и устраняя необходимость в реагентах для экстракции РНК9, которых не хватало на ранних стадиях пандемии10. Расширенная термическая обработка также инактивирует присутствующие вирусы33, что позволяет проводить лабораторную обработку при более низких уровнях биобезопасности. Следовательно, экстракция РНК на тепловой основе (описанная в разделе 5.4) была реализована для снижения вязкости за счет денатурации белка (рисунок 6). Основываясь на результатах, мы постулируем, что термическая обработка может также гомогенизировать образцы слюны в дополнение к денатурации белковой биоматрицы. Другие группы комбинировали термическую обработку и обработку протеиназой К для повышения однородности9,14,34. Мы решили не реализовывать этот шаг, поскольку он может денатурировать белки вириона со скоростью, которая оставляет вирусную РНК подверженной тепловой деградации35. Кроме того, разбавление проб протеиназой К может маскировать положительные образцы, содержащие меньше вирусных частиц, тем самым снижая чувствительность. Кроме того, результаты анализа сравнивались с коммерчески доступным анализом SARS-CoV-2 на основе слюны (Logix Smart COVID-19), в котором используется магнитная экстракция РНК (таблица 5). Было обнаружено, что текущий анализ лучше подходит для обнаружения слабых положительных образцов по сравнению с коммерчески доступным анализом.
Трудно количественно оценить количество копий вируса в слюне, используя только RT-qPCR, потому что qPCR является полуколичественным. Существуют внутренние различия между значениями Ct, которые проистекают из технических ограничений. Номер копии гена может быть определен по значениям Ct (рисунок 4) и примерно эквивалентен номеру вирусной копии. Одним из возможных решений для определения числа вирусных копий в образцах слюны является ddPCR, который обеспечивает жесткую количественную оценку копий генов в реакции. Тем не менее, мы считаем, что достаточно предоставить качественные результаты клиницистам, и относительное содержание вируса может быть сравнено с образцами, обработанными нашими методами.
Несмотря на некоторые ограничения, возникающие при использовании слюны, анализ SARS-CoV-2 методом RT-qPCR на основе слюны оказывается эффективным методом быстрого и надежного обнаружения вирусной РНК в любом масштабе тестирования. Это особенно верно в сочетании с использованием систем обработки жидкостей с открытым исходным кодом. Этот подход к тестированию может быть модифицирован для обнаружения других последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих отношение к диагностике, таких как агенты инфекционных заболеваний, маркеры заболеваний или другие вирусы. Это делает анализ применимым как для клинических, так и для исследовательских диагностических усилий.

Тяжелый острый респираторный синдром,ассоциированный коронавирус-2 (SARS-CoV-2), новый коронавирус, появился в конце 2019 года и быстро распространился среди населения мира1. Инфекция SARS-CoV-2 вызывает коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), очень заразное заболевание с потенциально тяжелыми респираторными и воспалительными симптомами. Высокая трансмиссивность в сочетании с низкой смертностью указывает на то, что вирус будет быстро распространяться среди населения и потребует расширения диагностического тестирования2,3. Рекомендации общественного здравоохранения поощряли широкомасштабный скрининг населения для выявления случаев заболевания и последующего снижения показателей передачи4,5,6. Кроме того, модели популяционного эпиднадзора показали, что увеличение частоты тестирования и сокращение времени отчетности оказывают большее влияние на снижение передачи, чем повышение чувствительности тестов7. Вероятно, это связано с тем, что инфицированные люди могут быть помещены в карантин раньше, тем самым разрывая цепочки инфекции.
Первоначальным стандартом тестирования амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) были мазки из носоглотки (NP), обработанные RT-qPCR8. Однако с этой формой тестирования для очень больших групп населения возникают осложнения, такие как увеличение относительной стоимости и обострение давления в цепочке поставок9,10. Кроме того, как сбор образцов, так и обработка общих методов NAAT (включая тампоны NP, ротоглоточные тампоны, мазки средней раковины и мазки из носа) зависят от специализированного оборудования, реагентов и медицинского персонала9,10.
Адекватной заменой тестированию NP-мазка RT-qPCR является тестирование на основе слюны, которое является точным диагностическим инструментом для обнаружения SARS-CoV-211,12,13,14. Непосредственное выполнение RT-qPCR на образцах слюны дает ту же чувствительность и специфичность, что и NP-мазки15. Одним из основных преимуществ тестирования слюны по сравнению с тестированием мазка NP является то, что оно позволяет самостоятельно собирать образцы16. Это сводит к минимуму потребность в медицинском персонале и максимизирует простоту сбора образцов для пациентов, будучи менее инвазивным, чем мазки NP. Кроме того, поскольку образцы слюны не требуют буферов для извлечения образца из тампона (как в случае образцов NP), тесты на основе слюны могут напрямую использовать экстракцию рибонуклеиновой кислоты (РНК) на тепловой основе, что снижает затраты на тестирование за счет устранения необходимости в дополнительных буферах, транспортных средах и / или реагентах экстракции РНК14,17.
Научно-исследовательская и образовательная лаборатория Университета Клемсона в области диагностики и вмешательства в болезни (REDDI) была создана для удовлетворения потребностей университета в тестировании и эпиднадзоре за COVID-19. В закрытых группах населения, включая университеты, частое тестирование эпиднадзора в сочетании с социальным дистанцированием дало наиболее благоприятные результаты в эпидемиологических моделях распространенности заболевания18. Консолидированные протоколы CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 и SalivaDirect14 были адаптированы, а автоматизация была использована в клиническом рабочем процессе для снижения затрат и сокращения времени выполнения работ. Предыдущие группы использовали роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей для этапов экстракции РНК SARS-CoV-220,21, но мы максимизировали использование роботов для подготовки тестовых пластин и образцов нагрузки22. Здесь мы показываем, что адаптированный протокол и использование систем обработки жидкостей с открытым исходным кодом (рисунок 1) позволяют быстро и точно проводить RT-qPCR на основе слюны и являются эффективной стратегией для крупномасштабного эпиднадзора за общественным здравоохранением.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

Появление недавнего глобального кризиса в области здравоохранения SARS-CoV-2 создало ключевые проблемы для эпидемиологических исследований и клинических испытаний. Пандемия COVID-19, характеризующаяся высоким уровнем передачи и низкой смертностью, потребовала точного и эффективного диагностического тестирования, особенно в закрытых группах населения, таких как университеты-интернаты. Первоначальная доступность тестирования нуклеиновых кислот, таких как мазки из носоглотки, была ограничена из-за давления в цепочке поставок, которое также задерживало представление результатов испытаний. Тестирование количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR) на основе слюны показало, что оно сопоставимо по чувствительности и специфичности с другими методами тестирования, а сбор слюны менее физически инвазивный для участников. Следовательно, мы разработали мультиплексный диагностический анализ RT-qPCR для наблюдения за населением Университета Клемсона и окружающего сообщества. В анализе использовались роботы с открытым исходным кодом для обработки жидкостей и термоциклеры вместо сложных систем клинической автоматизации для оптимизации рабочего процесса и гибкости системы. Автоматизация RT-qPCR на основе слюны позволяет быстро и точно обнаруживать широкий диапазон концентраций вирусных РНК как для крупномасштабных, так и для небольших испытаний. Средний оборот автоматизированной системы составил < 9 ч для 95% образцов и < 24 ч для 99% образцов. Стоимость одного теста составляла 2,80 доллара, когда все реагенты закупались в больших количествах.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Протокол описывает диагностический метод SARS-CoV-2, который использует автоматизацию с открытым исходным кодом для выполнения молекулярного тестирования образцов слюны RT-qPCR. Этот масштабируемый подход может быть применен к клиническому надзору за общественным здравоохранением, а также для увеличения потенциала небольших университетских лабораторий.

Эффективная sars-CoV-2 количественная обратная транскриптаза ПЦР стратегия диагностики слюны с использованием роботов для пипетирования с открытым исходным кодом

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Мы разработали недорогой диагностический тест на COVID-19 на основе слюны, который легко внедрить и масштабировать для крупномасштабных приложений скрининга сообщества. Здесь мы используем роботов с открытым исходным кодом для обработки жидкостей, стандартные термоциклеры и программное обеспечение для выполнения прямого тестирования слюны без буферов экстракции или стабилизации, обеспечивая при этом точные диагностические результаты. Благодаря простым автоматизированным параллельным рабочим процессам система может быть масштабирована для выполнения тысяч тестов в день с минимальными требованиями к оборудованию, пространству и персоналу.В дополнение к Кайли Кинг, Рэйчел Хэм, наш руководитель клинической лаборатории и Остин Смотерс, наш координатор по образованию, помогут продемонстрировать процедуру Начните с дезактивации наружной части пробирок для сбора слюны с 70% этанолом и передачи их в лабораторию для тестирования. Запишите прибытие образца, отсканировав каждый образец штрих-кода в электронную таблицу ежедневного приема. Термически обработайте сканирующие образцы в течение 30 минут в печи с температурой 95 градусов Цельсия, а затем извлеките образцы с помощью термостойких перчаток.Откройте электронные таблицы ежедневной загрузки образцов для каждого робота-загрузчика образцов на станции назначения образцов. Затем назначают 188 образцов на каждую плиту из 384 скважин. Лотки для этикеток с названием пластины, датой и номером квартала.Отсканируйте образцы по порядку в электронную таблицу загрузки образцов. На станции загрузки образцов выстройте два полных комплекта из восьми 3D-печатных стеллажей, соответствующих размещению палубы в роботе. Снимите крышку с четверти одной трубки и поместите их в стойки для 3D-печати, начиная с позиции A1 в стойке.Заполняйте каждую стойку слева направо и сверху вниз. Продолжайте эту схему загрузки во второй стойке, затем переходите к стойкам четыре и пять. Разместите загруженные четверть одной пробы стеллажей на палубах один, два, четыре, пять, семь, восемь, 10, 11.Разместите наконечники P20 на палубах три и девять. Чтобы упростить процесс настройки, загрузите материалы сзади наперед в робота. Пластины мастер-микса производятся на специальном роботе и хранятся при четырех градусах Цельсия.Одна пластина используется за один раз и маркируется именем пластины, а острое лезвие используется для резки линии в фольге вокруг контрольных скважин. Поместите основную табличку смеси на шестую палубу и снимите крышку из фольги, оставив после себя небольшой прямоугольник, покрывающий контрольные колодцы. Откройте коробки с наконечниками и закройте робота.Инициализируйте пользовательский операционный протокол Python, нажав кнопку Начать запуск через настольное приложение робота. Каждый квартал занимает 24,5 минуты для загрузки на тарелку. Установите таймер в качестве напоминания.Пока робот работает, открутите и загрузите четверть двух пробирок для образцов во второй комплект 3D-печатных стоек. Когда робот сделает паузу, снимите четверть одной стойки и замените их четвертью двумя стойками, затем нажмите возобновить запуск в настольном приложении. Подведите итоги четверти одной пробы и храните их в холодильнике с температурой четыре градуса Цельсия в ожидании результатов.Повторите этот процесс загрузки в течение третьего и четвертого кварталов. Перенесите загруженную пластину в шкаф биобезопасности. Чтобы свести к минимуму загрязнение, держите пластину закрытой во время переноса.Соберите любые повторные образцы и назначьте их в качестве последних образцов в четвертом квартале. Пронумеруйте образцы, отсканируйте штрих-коды и введите исходное местоположение образца и результат в электронную таблицу загрузки образца. Перенесите повторные образцы в шкаф биобезопасности.Не загружайте повторные пробоотборники в загрузочные стойки робота. Пипетка по два микролитра каждого повторного образца в нужные скважины. Используйте специальную пипетку для добавления образцов пациента.Держите контрольные колодцы покрытыми фольгой, добавляя образцы, чтобы свести к минимуму загрязнение. Снимите крышку из фольги над контрольными колодцами с помощью щипцов. Пипетка двух микролитров подтвержденных положительных образцов пациентов в скважины М23 и М24.Пипетка двух микролитров воды без нуклеазы в скважины от N23 до N24 и два микролитра по 200 копий на микролитр смешанного положительного контроля к скважинам O23 до O24. Оставьте скважины от P23 до P24 пустыми, чтобы контролировать качество основной партии смеси. Накройте пластину оптически прозрачным уплотнением и используйте аппликаторный ролик, чтобы прикрепить уплотнение ко всем скважинам.Вихрьте пластину при 2 500 об/мин в течение 30 секунд, чтобы тщательно перемешать, затем центрифугируйте пластину в 500 раз G в течение одной минуты. Выберите программу протокола в программном обеспечении термоциклера и сохраните протокол для будущих пластин. Поместите герметичную пластину в термоциклер и запустите протокол.Экспортируйте значения CT и скопируйте их в таблицу загрузки образца. Для положительного контроля проверьте, дает ли по крайней мере одна положительная контрольная скважина значения КТ от 22 до 28 для зондов P1 и N1. Альтернативно, известные положительные пробовые скважины дают значения P1 и N1 CT менее 33 на зондах P1 и N1.Для отрицательного контроля убедитесь, что ни в одной из двух отрицательных контрольных скважин нет значений КТ N1 или P1. Убедитесь, что значения КТ имеют допустимые кривые усиления, прежде чем аннулировать пластину. Если P1 дает результат КТ менее 33, считайте скважину действительной и переходите к результату из N1. Если P1 дает результат КТ больше или равен 33 или не имеет значения КТ, считайте скважину недопустимой.Если N1 дает результат КТ менее 33, оцените скважину как да. Если N1 не дает значения КТ, оцените скважину как нет. Если N1 дает значение КТ больше или равно 33, оцените колодец как нет звезды.Убедитесь, что все значения N1 CT связаны с реальной кривой усиления. Если значение КТ для N1 не имеет кривой усиления, то скважина — нет. Определите повторяющиеся образцы, пометьте их внутренним номером образца и типом образца и верните их в рабочий процесс загрузки.Репрезентативные изображения показывают обнаружение RTQ PCR синтетической РНК N1 или SARS CoV-2 и синтетической ДНК P1 или HSRPP30. Стандартные кривые были построены со стандартными отклонениями для определения диапазона точного обнаружения с использованием этой комбинации грунтовки зонда. Средние значения КТ, полученные в соответствующих разведениях, были построены по отношению к расчетному количеству синтетической РНК и синтетической ДНК.В обоих случаях линейные кривые показали хорошие коэффициенты корреляции в широком диапазоне концентраций копий генов. Значения N1 CT, полученные из уникальных образцов с использованием как робота, так и ручной загрузки образца, были перенесены для определения межпробирной изменчивости между ручной и роботизированной загрузкой. Линейная зависимость между ручным и автоматизированным методами дала высокий коэффициент корреляции, указывающий на то, что оба метода функционально эквивалентны.Вариабельность внутри анализа также определяли с использованием транспонированных реплицированных значений КТ N1, полученных как от робота, так и от ручной загрузки образца. Здесь показана оценка методов термообработки для снижения вязкости слюны. Отрицательная слюна SARS CoV-2 собиралась из одного источника, а аликвоты подвергались термической обработке в течение нулевых минут, 30 минут или 60 минут при 95 градусах Цельсия.Значения P1 CT из технических реплик каждого состояния были построены для определения изменчивости между методами лечения. Как 30-минутный, так и 60-минутный методы термической обработки приводили к значительному снижению изменчивости образца по сравнению с отсутствием контроля обработки. Не было существенной разницы между 30-минутными и 60-минутными процедурами.Поэтому для сокращения времени обработки был реализован 30-минутный метод термообработки. Используйте надлежащую асептическую технику для минимизации загрязнения испытательных пластин, особенно при загрузке ручных образцов и элементов управления. Избегайте пересечения тарелки руками или рукавами.После получения клинических результатов образцы могут быть утилизированы в отходах биологической опасности или сохранены для дальнейшего анализа, такого как секвенирование всего генома для определения конкретных штаммов. Этот метод позволяет проводить широкомасштабное тестирование сообщества, что позволяет нам исследовать последствия охвата тестированием и несимптоматическое распространение Covid-19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Используя антиген капсида-РЕГИСТРАЦИИ Стратегию развития подходов аденовируса серотипа 5-Vectored вакцин

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Количественная ПЦР бактериофага Т7 от Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

Экспресс-мультиплексный двойной репортер IgG и IgM SARS-CoV-2 нейтрализуя для мультиплексированной системы анализа потоков на основе шариков

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Обнаружение рецептор-связывающего домена антитела SARS-CoV-2 с помощью биорепортера на основе HiBiT

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Живая визуализация и количественная оценка вирусной инфекции у трансгенных мышей K18 hACE2 с использованием репортер-экспрессирующего рекомбинантного SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...