Name: efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots
Uploaded: 2022-02-11T13:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Författarna tackar Clemsons administration, medicinsk personal och kliniska labbanställda på REDDI Lab som hjälpte till att implementera och hantera SARS-CoV-2-testning. Vi tackar Dr. Phillip Buckhaults och Dr. Carolyn Bannister från University of South Carolina för inledande projektkonsultation och branschkontakter för upphandling av utrustning. Vi tackar många studenter, professorer och personal för deras hjälp med provinsamling. Tack till Creative Inquiry-studenter för standardinsamling av kurvdata. Finansiering för denna studie erhölls från National Institutes of Health grant P20GM121342 (tilldelas DD och LGP), Clemson Athletic Department, Clemson Universitys Vice President for Research och South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee.

All forskning utfördes i enlighet med Clemson University och Prisma Health Institutional Review Boards (Prisma Health IRB # Pro00099491, 1 juli 2020).
1. Installation av vätskehanteringsrobot med öppen källkod
<ol><li>Installera högeffektiva partikelluftfiltermoduler (se Tabell över material) högst upp på varje vätskehanteringsrobot enligt tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Fäst en 8-kanals P20-pipett på det vänstra fästet på masterblandningsplattans beredningsrobotar enligt tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Fäst en P20-pipett på provlastningsrobotarnas högra fäste enligt tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Hämta anpassade Python-skript (Kompletterande fil 1 och kompletterande fil 2) på lämpliga datorer.</li>
	<li>Öppna TigerSaliva Full 384 Loading.py i skrivbordsprogrammet vid provladdning av robotdatorer. Klicka på Kalibrera och ställ in både pipetten och programmet enligt programvaruanvisningar.</li>
	<li>Öppna 12 Full Plates.py i skrivbordsprogrammet på huvudmixrobotdatorn. Klicka på Kalibrera och ställ in både pipetten och programmet enligt programvaruanvisningar.</li>
	<li>Skriv ut anpassade provställ med en smält depositionsmodellering av tredimensionell (3D) skrivare med hjälp av en CAD-fil (Computer-Aided Design) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). Skriv ut 16 rack per provladdningsrobot, för två uppsättningar med åtta rack.</li>
</ol>2. Beredning av 20x multiplex N1 +P1 sond/primer blandning
<ol><li>Förbered ett parti av 20x multiplex N1+P1 sond/primerblandning (total volym på 20 ml, tabell 1) i ett koniskt rör på 50 ml i en steril miljö bort från syntetiska SARS-CoV-2 RNA- eller patientprover.</li>
	<li>Alikvot 1,6 ml av blandningen med hjälp av en serologisk pipett i sterila 2,0 ml centrifugrör och etikett på lämpligt sätt.</li>
	<li>Förvara alikvoter i en frys på -20 °C tills de är klara att användas.</li>
</ol>3. Beredning av positiv kontrollblandning
OBS: Positiv kontrollblandning bör inte göras i samma sterila miljö som sond/primerblandning eller andra huvudblandningskomponenter. En separat behållare med nukleasfritt vatten bör användas.
<ol><li>Späd sars-cov-2 syntetiskt RNA (N1) från 1 000 000 genkopior/μL (cpμ) till 10 000 cpμ genom att tillsätta 10 μL lagerlösning till 990 μL nukleasfritt vatten. Alikvot 25 μL på 10 000 cpμ i sterila 0,2 ml rör och etikett på lämpligt sätt. Förvara oanvända alikvoter vid -80°C. OBS: Syntetiskt RNA måste förvaras vid -80°C för att förhindra nedbrytning.</li>
	<li>Späd Hs_RPP30 syntetiskt DNA (P1) från 200 000 cpμ till 10 000 cpμ genom att tillsätta 50 μL lagerlösning till 950 μL nukleasfritt vatten. Alikvot 25 μL på 10 000 cpμ i sterila 0,2 ml rör och etikett på lämpligt sätt. Förvara oanvända alikvoter vid -80°C.</li>
	<li>Späd varje komponent till en slutlig koncentration på 200 cpμ genom att tillsätta 20 μL av både SARS-CoV-2 och Hs_RPP30 10 000 cpμ-lagren till 960 μL nukleasfritt vatten, totalt 1000 μL. Aliquot 20 μL blandad 200 cpμ positiv kontroll i 0,2 ml rör och etikett på lämpligt sätt. Förvara alikvoterna vid -80°C tills de är klara för användning.</li>
</ol>4. Beredning av huvudblandningsplattor
OBS: Gör huvudblandningen i en steril miljö bort från syntetisk SARS-CoV-2 RNA eller patientprover. Alla komponenter måste tinas helt innan de tillsätts till blandningen; utan korrekt upptining kan koncentrationerna vara felaktiga. Otillräcklig upptining indikeras av närvaron av is eller ojämn färg på reagenser. Förvara på ett frysblock medan du förbereder blandningen.
<ol><li>Förbered ett parti multiplex huvudblandning (total volym på 48 ml, tabell 2) i ett koniskt rör på 50 ml.</li>
	<li>Homogenisera blandningen genom att vrida röret över 3x. Blanda inte genom pipettering upp och ner eller virvla eftersom detta kommer att skada enzymet.</li>
	<li>Fyll kolonnerna 1-4 av en steril 96-brunns djup brunnsbehållare genom att överföra 1,48 ml masterblandning till varje brunn. En 50 ml konisk fyllning fyller fyra kolumner, tillräckligt för 12 plattor.</li>
	<li>Täck den djupa brunnsbehållaren med en folietätning och placera den i den dedikerade huvudblandningsroboten för vätskehantering. Placera den fyllda djupbrunnbehållaren på däck 10, placera sex tomma 384-brunnsplattor på däck 1-6 och P20-spetslådan på däck 11. Upptäck den djupa brunnsplattan och spetslådorna och stäng roboten.</li>
	<li>Initiera det anpassade Python-driftsprotokollet genom att klicka på Starta körning i robotskrivbordsprogrammet.</li>
	<li>Efter 40 min pausas körningen. Täck de fyllda 384 brunnsplattorna med folietätningar medan de sitter kvar i roboten och tryck ner med rullen för att säkerställa vidhäftning. Märk kanten på varje platta med en batchidentifierare.</li>
	<li>Placera sex nya tomma 384-brunnsplattor på däck 1-6 och återuppta driftprotokollet genom att klicka på Fortsätt köra. När körningen är klar, täck den sista uppsättningen av 384 brunnsplattor med folietätningar.</li>
	<li>Pipetter 2 μL av den återstående huvudblandningen i kolumnerna 1-3 och 22-24 av en tom 384-brunnsplatta för batchkvalitetskontroll. Försegla med en optiskt klar tätning och kör på termocykeln (avsnitt 10.1-10.2). Om några brunnar har N1-tröskelvärden (Ct) eller om fler än 10 brunnar har P1 Ct-värden är partiet kontaminerat och kan inte användas.</li>
	<li>Förvara de beredda huvudblandningsplattorna vid 4 °C och använd dem inom 7 dagar efter beredningen.</li>
</ol>5. Provtagning, intag och värmebehandling
<ol><li>Instruera deltagarna att undvika att äta, dricka, röka eller utföra tandhygien 30 minuter före salivsamlingen. Instruera deltagarna att samla minst 1 ml saliv som naturligt poolar i munnen och deponerar det i ett sterilt 50 ml koniskt rör utan konserveringsmedel och sedan täcka röret (Kompletterande fil 3).</li>
	<li>Dekontaminera utsidan av salivuppsamlingsrör med 70% etanol eller desinfektionsservetter och överför dem till laboratoriet för testning.</li>
	<li>Spela in exempel ankomst genom att skanna varje exempel streckkod i det dagliga intaget kalkylblad (Kompletterande fil 4).</li>
	<li>Värmebehandla de skannade proverna i 30 minuter i en ugn på 95 °C. Ta bort prover med värmebeständiga handskar. OBS: Obehandlade prover är stabila vid rumstemperatur (23 °C) i upp till 72 timmar. När proverna har värmebehandlats skall de förvaras vid 4 °C om de inte behandlas omedelbart.</li>
</ol>6. Provtilldelning
<ol><li>Öppna de dagliga provladdningskalkylbladen för varje provladdningsrobot (Kompletterande fil 5) på datorn vid exempeltilldelningsstationen.</li>
	<li>Tilldela 188 prover till varje 384-brunnsplatta enligt följande: Proverna 1-48 betraktas som kvartal 1, proverna 49-96 betraktas som kvartal 2, proverna 97-144 betraktas som kvartal 3 och proverna 145-188 betraktas som kvartal 4. Provet analyseras i duplikat.</li>
	<li>Etikettbrickor med plåtnamn, datum och kvartalsnummer. Skanna proverna i ordning i exempelinläsningskalkylbladet. OBS: Prover från tidigare plattor kan behöva köras manuellt enligt definitionen i figur 3. Se avsnitten 8.1-8.3 för manuell provtilldelning och lastningsinstruktioner.</li>
</ol>7. Drift av provladdningsrobotar
<ol><li>På provladdningsstationen ställer du upp två hela uppsättningar av åtta 3D-utskrivna rack som motsvarar däckplaceringen i roboten.</li>
	<li>Lossa kvart 1 rör och placera i 3D-printade rack, med början med position A1 i rack 1. Fyll varje rack från vänster till höger och uppifrån och ned. Fortsätt detta lastmönster i rack 2 och fortsätt sedan till rack 4 och 5 (se figur 2C). Obs: Rack numreras inte i följd på grund av robotprogramparametrarna.</li>
	<li>Placera laddade kvarts 1 provställ på däck 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11. Placera P20-tips på däck 3 och 9. För att förenkla uppställningsprocessen, ladda material från rygg till framtill in i roboten.</li>
	<li>Ta en färdig blandningsplatta från 4 °C, märk den med plåtnamn och använd ett vasst blad för att skära en linje i folien runt kontrollbrunnarna (N23/24, O23/24 och P23/24).</li>
	<li>Placera huvudblandningsplattan på däck 6 och skala bort foliekåpan och lämna kvar den lilla rektangeln som täcker kontrollbrunnarna. Upptäck tipslådorna och stäng roboten.</li>
	<li>Initiera det anpassade Python-driftsprotokollet genom att klicka på Starta kör genom robot skrivbordsprogrammet. Varje kvartal tar 24,5 min att ladda på plattan; ställa in en timer som en påminnelse.</li>
	<li>Medan roboten är igång, lossa och ladda kvarts 2 provrör i den andra uppsättningen 3D-utskrivna rack enligt beskrivningen i avsnitt 7.2.</li>
	<li>När roboten pausar tar du bort kvart 1 rack och ersätter dem med kvarts 2 rack. Klicka på Fortsätt köra i skrivbordsprogrammet.</li>
	<li>Recap kvartal 1 provrör och förvara dem i ett 4 °C kylskåp i väntan på resultat. Upprepa denna laddningsprocess för kvartal 3 och 4.</li>
	<li>Överför den laddade plattan till ett biosäkerhetsskåp. För att minimera kontaminering, håll plattan täckt under överföringen.</li>
</ol>8. Manuell provinläsning
OBS: Utför en enda manuell körning på upprepade prover (N1 Repris eller Rerun, se figur 3) vid otillräcklig robotbelastning.
<ol><li>Samla in eventuella upprepade prover och tilldela dem som de sista proverna i kvartal 4 (se avsnitt 6.2). Numrera exempel, skanna streckkoderna och ange den ursprungliga exempelplatsen och resultera i exempelinläsningskalkylbladet.</li>
	<li>Överför upprepade prover till biosäkerhetsskåpet. Ladda inte upprepade provrör i robotens lastställ.</li>
	<li>Pipett 2 μL av varje upprepat prov till rätt brunnar enligt plattans layoutdiagram (Kompletterande fil 6). Använd en särskild pipett för att lägga till patientprover. Håll kontrollbrunnarna täckta med folie samtidigt som du lägger till prover för att minimera föroreningen.</li>
</ol>9. Tillsats av kontroller till provningsplattor
<ol><li>Skala bort folieskyddet över kontrollbrunnarna med tång.</li>
	<li>Pipett 2 μL nukleasfritt vatten (ingen mallkontroll) till brunnarna N23-N24 och 2 μL av 200 cpμ blandad positiv kontroll (se avsnitt 3) till brunnarna O23-O24. Pipett 2 μL av en bekräftad positiv patientprovkontroll i brunnarna M23-M24 som en extra kontroll. Lämna brunnarna P23-P24 tomma för att övervaka huvudblandningens batchkvalitet.</li>
	<li>Täck plattan med en optiskt klar tätning och använd applikatorrullen för att fästa tätning vid alla brunnar. Virvla plattan vid 2500 varv/min i 30 sekunder för att blanda ordentligt. Centrifugera plattan vid 500 x g i 1 min.</li>
</ol>10. Utföra RT-qPCR
<ol><li>Skapa ett protokollprogram i termocykelns programvara enligt de beskrivna villkoren (tabell 3). Spara protokollet för framtida plåtar. Placera den förseglade plattan i termocykeln och kör protokollet.</li>
	<li>Exportera Ct-värden som en XSLx-fil och kopiera värdena till exempelinläsningskalkylbladet (Kompletterande fil 5). OBS: Dessa ark har specialdesignats för Ct-utdatafiler från tillverkarens programvara och kan behöva ändras för att acceptera andra format.</li>
</ol>11. Fastställande av plåtens giltighet
<ol><li>Validera både de positiva kontroll- och/eller kända positiva proverna och den negativa kontrollen för att betrakta plattans resultat som giltiga. Utvärdera kontrollbrunnarna med följande kriterier.<ol>
<li>För positiv kontroll, kontrollera om minst en positiv kontrollbrunn (O23/O24) ger Ct-värden på mellan 22-28 för både P1- och N1-sonder. Alternativt producerar de kända positiva provbrunnarna (M23/M24) P1- och N1 Ct-värden <33 på P1- och N1-sonder.</li>
		<li>För negativ kontroll kontrollerar du att det inte finns några N1- eller P1 Ct-värden i någon av de två negativa kontrollbrunnarna (N23/N24). Kontrollera att Ct-värden har giltiga förstärkningskurvor innan plattan ogiltigförklaras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>12. Tolkning av provresultat
<ol><li>Bestäm patientresultatet efter diagrammet (figur 3) och rapportera lösta prover.<ol>
<li>Utvärdera P1-resultatet som GILTIGT eller OGILTIGT. Om P1 ger ett resultat av Ct <33, betrakta brunnen GILTIGT och fortsätt att resultera från N1. Om P1 ger ett resultat av Ct >=33 eller inget Ct-värde, betrakta brunnen OGILTIG.<ol>
<li>Utvärdera N1-resultatet som JA, NEJ eller NEJ*. Om N1 ger ett resultat av Ct <33 är brunnen JA. Om N1 inte producerar ett Ct-värde är brunnen NEJ. Om N1 producerar en Ct >=33 är brunnen NO*. Bekräfta att alla N1 Ct-värden är associerade med en verklig förstärkningskurva. Om ett Ct-värde för N1 inte har någon förstärkningskurva är brunnen NEJ.</li>
			<li>Identifiera upprepade exempel (N1 Kör om eller kör igen), märk dem med ett internt exempelnummer och exempeltyp och returnera dem till inläsningsarbetsflödet (avsnitt 8.1-8.3).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Laboratorierensning
<ol><li>Robotar för vätskehantering<ol>
<li>Rengör alla sidor med desinfektionsmedel på mellannivå. Använd inte etanol eftersom det kommer att bryta ner plasten.</li>
		<li>Torka försiktigt pipettens spetsände och papperskorgen med en alkoholservett (70% etanol eller 100% isopropanol) torka. Torka av tangentbordet och musen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Biosäkerhetsskåp<ol>
<li>Rengör alla ytor med desinfektionsmedel på mellannivå. Slå på UV-ljuset i 15 minuter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+coronavirus+from+patients+with+pneumonia+in+China,+2019.">A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019.</a> New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).</li><li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+and+transmissibility+of+2019-nCoV-A+quick+overview+and+comparison+with+other+emerging+viruses.">Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses.</a> Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).</li><li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics.">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li><li>Honein, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Summary+of+Guidance+for+Public+Health+Strategies+to+Address+High+Levels+of+Community+Transmission+of+SARS-CoV-2+and+Related+Deaths,+December+2020.">Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020.</a> MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).</li><li>Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051">https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051</a> (2020)</li><li>Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance</a> (2020)</li><li>Larremore, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+sensitivity+is+secondary+to+frequency+and+turnaround+time+for+COVID-19+screening.">Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening.</a> Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).</li><li>Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+Diagnostic+Tests+for+SARS-CoV-2.">Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2.</a> JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).</li><li>Chu, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+simple+nucleic+acid+extraction+methods+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+in+nasopharyngeal+and+saliva+specimens+during+global+shortage+of+extraction+kits.">Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits.</a> Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).</li><li>Guan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+supply-chain+effects+of+COVID-19+control+measures.">Global supply-chain effects of COVID-19 control measures.</a> Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).</li><li>Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sensitivity+and+Costs+of+Testing+for+SARS-CoV-2+Infection+With+Saliva+Versus+Nasopharyngeal+Swabs:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).</li><li>Pasomsub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+sample+as+a+non-invasive+specimen+for+the+diagnosis+of+coronavirus+disease+2019:+a+cross-sectional+study.">Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).</li><li>To, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+Detection+of+2019+Novel+Coronavirus+in+Saliva.">Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).</li><li>Vogels, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaDirect:+A+simplified+and+flexible+platform+to+enhance+SARS-CoV-2+testing+capacity.">SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity.</a> Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).</li><li>Griesemer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Specimen+Types+and+Saliva+Stabilization+Solutions+for+SARS-CoV-2+Testing.">Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).</li><li>Wehrhahn, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-collection:+An+appropriate+alternative+during+the+SARS-CoV-2+pandemic.">Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).</li><li>Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+simplified+sample+processing+step+without+RNA+extraction+for+direct+SARS-CoV-2+RT-PCR+detection.">Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).</li><li>Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+SARS-CoV-2+Screening+Strategies+to+Permit+the+Safe+Reopening+of+College+Campuses+in+the+United+States.">Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States.</a> JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).</li><li>2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html">https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html</a> (2020)</li><li>Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Robots+Improve+Testing+Capacity+for+SARS-CoV-2.">Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2.</a> Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).</li><li>Villanueva-Ca&#241;as, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+an+open-source+robotic+platform+for+SARS-CoV-2+testing+by+real-time+RT-PCR.">Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR.</a> PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).</li><li>Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy Available from: <a target="_blank" href="https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php">https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php</a> (2020)</li><li>Matic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+challenges+to+the+clinical+implementation+of+saliva+for+SARS-CoV-2+detection.">Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).</li><li>Sahajpal, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SalivaSTAT:+Direct-PCR+and+Pooling+of+Saliva+Samples+Collected+in+Healthcare+and+Community+Setting+for+SARS-CoV-2+Mass+Surveillance.">SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance.</a> Diagnostics. 11 (5), 904 (2021).</li><li>Genzen, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+Opportunities+in+Implementing+Total+Laboratory+Automation.">Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation.</a> Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).</li><li>Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Laboratory+Automation:+A+Case+Study.">Clinical Laboratory Automation: A Case Study.</a> Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).</li><li>Hecker, K. H., Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+and+low+annealing+temperatures+increase+both+specificity+and+yield+in+touchdown+and+stepdown+PCR.">High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR.</a> BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).</li><li>Bhat, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+beads-on-a-string+structures+during+break-up+of+viscoelastic+filaments.">Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments.</a> Nature Physics. 6, 625-631 (2010).</li><li>Miller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+developments+in+salivary+diagnostics.">Current developments in salivary diagnostics.</a> Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).</li><li>Moreno-Contreras, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saliva+Sampling+and+Its+Direct+Lysis,+an+Excellent+Option+To+Increase+the+Number+of+SARS-CoV-2+Diagnostic+Tests+in+Settings+with+Supply+Shortages.">Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages.</a> Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+in+Different+Types+of+Clinical+Specimens.">Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens.</a> JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).</li><li>Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+use+of+saliva+for+detection+of+SARS+CoV-2+RNA+in+symptomatic+outpatients.">Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients.</a> Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).</li><li>Lista, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resilient+SARS-CoV-2+diagnostics+workflows+including+viral+heat+inactivation.">Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation.</a> PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).</li><li>Brotons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+and+implementation+of+a+direct+RT-qPCR+method+for+rapid+screening+of+SARS-CoV-2+infection+by+using+non-invasive+saliva+samples.">Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples.</a> International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).</li><li>Bat&#233;jat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+inactivation+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+2.">Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2.</a> Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja. Analysen som beskrivs i protokollet faller under SalivaDirect EUA som lämnats in av Yale School of Public Health.

Analysen som beskrivs i protokollet bedömdes av en oberoende valideringsstudie. Det konstaterades att analysen hade 98,9% specificitet (1,1% falskt positiv) och 90,0% känslighet (10,0% falskt negativt) när den utvärderades mot parade nasopharyngeal swabs tas samtidigt (n =837; 817 negativa, 20 positiva). Viktigt, tre deltagare som testade positivt med TigerSaliva och negativa med en nasopharyngeal swab testades igen med svabbprover 48 h senare och återvände positiva resultat, vilket indikerar att TigerSaliva kan upptäcka SARS-CoV-2 infektioner tidigare under sjukdom.
Vi simulerade positiva saliv prover genom spikning virus-fri saliv (både värmebehandlade och icke-värmebehandlade) med kända koncentrationer av SARS-CoV-2 syntetiskt RNA och utförde en 10-faldig utspädning för att bestämma Ct gränsen i saliv. N1-genen kunde inte påvisas under 10 000 genkopior (cirka Ct = 28) i simulerade positiva prover. Vi misstänker att detta beror på RNase nedbrytning eller andra förvirrande faktorer. Interaktionen mellan saliv RNases med naken syntetiskt RNA skiljer sig dock sannolikt från interaktionen med viruspartiklar, även efter att de har denaturerats av värme. Positiva salivprover har identifierats med Ct >30 och externa laboratorier erhöll SARS-CoV-2 genetiska sekvensdata från dessa prover. Vi spekulerar att virala proteiner ger skydd mot RNA nedbrytning i patientens saliv prover.
Det mest kritiska steget i protokollet är implementeringen av automatisering för masterblandningsberedning och salivprovbehandling (avsnitten 4 respektive 7). Detta möjliggör överlappande uppgiftsprocesser, vilket drastiskt minskar leveranstiden. Ett annat kritiskt steg är klinisk resultattolkning (avsnitten 11 och 12). Fastställandet av mellanliggande resultatkategorier (Rerun och N1 Rerun) minimerade också förekomsten av ofullständiga testresultat.
Vi visade att variationen mellan manuella och automatiserade metoder för salivprovbelastning är försumbar (figur 5A) och att automatisering kan förbättra reproducerbarheten för SARS-CoV-2-detektion (figur 5B). Automatisering bör gynnas för att underlätta testning vid design och expansion av kliniska laboratorier25. Laboratoriearbetsflödet förbättras med implementeringen av robotautomatiserade uppgifter26. Vätskehanteringsrobotarnas funktioner med öppen källkod möjliggör implementering av anpassad skriptning för protokolldesign. Detta gör vätskehanteringsrobotar till ett billigt och mycket modifierbart system jämfört med traditionella kliniska automatiseringsmetoder. Det är också en idealisk strategi för att utföra mycket repetitiva laboratorieuppgifter. Systemets höga anpassningsförmåga innebär frihet att ändra labware (t.ex. uppsamlingsrör, pipettspetsar eller 384-brunnsplattor) vid brist. Därför är automatisering med hjälp av vätskehanteringsrobotar livskraftigt för både storskalig och småskalig övervakning och forskning.
En stor fördel med denna teststrategi är en mycket kortare leveranstid i förhållande till andra kliniska laboratorier. Användningen av automatiserade vätskehanteringsrobotar spelar en nyckelroll för att minska leveranstiden, men samtidig användning av robotar och termohjulingar bidrar också till att maximera testeffektiviteten. En robot och termocykel bör användas som ett par, där båda maskinerna används tillsammans för oavbruten provbelastning och provresultatanalys. När ett jämnt flöde av tilldelade prover har fastställts kan alla maskinpar användas samtidigt. Konstant samtidig användning av robotar och termocyclers ökar drastiskt testkapaciteten och effektiviteten, vilket är avgörande för att rymma den höga testvolymen.
I motsats till andra etablerade SARS-CoV-2 RT-qPCR protokoll, inkluderade vi en touchdown steg i thermocycler protokollet för att förbättra glödgning av sonden och primer uppsättningar till mål generna27, minska risken för misslyckad förstärkning. Resultaten visade att touchdown förbättrade upptäckten av positiva prover utan att riskera förlusten av specifik primerbindning (tabell 4). Vi bestämde att ett brett spektrum av både SARS-CoV-2 RNA kopior (figur 4A) och Hs_RPP30 DNA kopior (figur 4B) kan detekteras samtidigt av RT-qPCR analysen.
En begränsning av vätskehanteringsrobotar är risken för korskontaminering från positiva prover vid salivöverföring. Saliv är en viskoelastisk vätska28 och kan snöra över intilliggande brunnar efter att ha dispenserats från pipettspetsen. Dessutom kan heterogeniteten hos saliv29 orsaka ojämn fördelning av viruspartiklar i hela provet. Detta ökar risken för både falska positiva och negativa, vilket kräver att N1 Rerun- och Rerun-prover utses. 14,1 % av de prover som ursprungligen betecknades som N1 Rerun löstes dock som positiva för SARS-CoV-2 och var mer än 30 gånger mer benägna än reprisprover att lösa som positiva efter omtestning. Följaktligen gjorde differentiering repris från N1 Rerun (figur 3) möjlig för mer exakt separation av potentiellt positiva prover, vilket ökar känsligheten och specificiteten hos vår diagnostiska analys. Andra resulterande parametrar för diagnostisk saliv testning gjorde inte denna skillnad12,14,24,30,31.
Salivprover kan vara svåra att pipettera på grund av heterogenitet och viskositet32. Värmebehandling denaturerar proteiner i salivbiomatrixen på ett adekvat sätt, vilket minskar viskositeten och eliminerar behovet av RNA-extraktionsreagens9, som var knappa under de tidiga stadierna av pandemin10. Utökad värmebehandling inaktiverar också nuvarande virus33 vilket möjliggör laboratoriebearbetning vid lägre biosäkerhetsnivåer. Följaktligen genomfördes en värmebaserad RNA-extraktion (beskrivs i avsnitt 5.4) för att minska viskositeten genom protein denaturering (figur 6). Baserat på resultaten antar vi att värmebehandling också kan homogenisera salivprover förutom att denaturera proteinet biomatrix. Andra grupper kombinerade värmebehandling och proteinas K-behandling för att öka homogeniteten9,14,34. Vi valde att inte genomföra detta steg eftersom det kan denature virion proteiner i en takt som lämnar viralt RNA utsätts för värmenedbrytning35. Dessutom kan provutspädning med proteinas K maskera positiva prover som innehåller färre viruspartiklar, vilket minskar känsligheten. Dessutom jämfördes analysresultaten med en kommersiellt tillgänglig salivbaserad SARS-CoV-2-analys (Logix Smart COVID-19) som använder magnetisk pärla RNA-extraktion (tabell 5). Det konstaterades att den nuvarande analysen var bättre lämpad för att upptäcka svaga positiva prover jämfört med den kommersiellt tillgängliga analysen.
Det är svårt att kvantifiera viruskopia nummer i saliv med endast RT-qPCR, eftersom qPCR är semi-kvantitativ. Det finns en inneboende variation mellan Ct-värden som härrör från tekniska begränsningar. Genkopieringsnummer kan bestämmas från Ct-värden (figur 4) och motsvarar ungefär viralt kopieringsnummer. En möjlig lösning för att bestämma viruskopian i salivprover är ddPCR, som ger hård kvantifiering av genkopior i reaktionen. Vi anser dock att det är tillräckligt att ge kvalitativa resultat till kliniker och relativt virusinnehåll kan jämföras mellan prover som behandlas med våra metoder.
Trots vissa begränsningar som uppstår vid användning av saliv, sars-cov-2-analysen av salivbaserad RT-qPCR visar sig vara en effektiv metod för snabb och tillförlitlig viral RNA-upptäckt i alla testskalar. Detta gäller särskilt i kombination med användningen av vätskehanteringssystem med öppen källkod. Den här testmetoden kan ändras för att upptäcka andra nukleinsyrasekvenser som är relevanta för diagnostik, till exempel smittämnen, sjukdomsmarkörer eller andra virus. Detta gör analysen tillämplig för både kliniska och forskningsdiagnostiska insatser.

Allvarligt akut respiratoriskt syndrom-associerat coronavirus-2 (SARS-CoV-2), ett nytt coronavirus, uppstod i slutet av 2019 och spred sig snabbt över hela den globala populationen1. SARS-CoV-2-infektionen orsakar coronavirussjukdom 2019 (COVID-19), en mycket smittsam sjukdom med potentiellt allvarliga luftvägs- och inflammatoriska symtom. Hög överförbarhet i kombination med låg dödlighet indikerade att viruset skulle spridas snabbt genom populationer och skulle kräva ökad diagnostisk testning2,3. Folkhälsorekommendationer uppmuntrade omfattande befolkningsscreening för att isolera fall och därefter minska överföringshastigheten4,5,6. Dessutom visade modeller för befolkningsövervakning att ökad testfrekvens och minskad rapporteringstid hade större effekt på att minska överföringen än att öka testkänsligheten7. Detta beror sannolikt på att smittade individer kan sättas i karantän tidigare och därmed bryta infektionskedjor.
Den ursprungliga nukleinsyra amplifiering testning (NAAT) standard var nasopharyngeal (NP) svabbprover bearbetade av RT-qPCR8. Komplikationer uppstår dock med denna form av testning för mycket stora populationer, såsom ökad relativ kostnad och förvärrat trycket i leveranskedjan9,10. Dessutom är både provuppsamling och bearbetning av vanliga NAAT-metoder (inklusive NP-svabbprover, svalgprover, mid-turbinate swabs och nasala svabbprover) beroende av specialiserad utrustning, reagenser och medicinsk personal9,10.
Ett lämpligt substitut för NP-swab RT-qPCR-testning är salivbaserad testning, som är ett korrekt diagnostiskt verktyg för SARS-CoV-2-detektion11,12,13,14. Direkt utförande RT-qPCR på salivprover ger liknande känslighet och specificitet som NP-svabbprover15. En stor fördel salivtestning har jämfört med NP-svabbtestning är att det möjliggör självinsamling av prover16. Detta minimerar behovet av medicinsk personal och maximerar enkel provtagning för patienter genom att vara mindre invasiv än NP-svabbprover. Eftersom salivprover inte kräver buffertar för att avlägsna provet från en bomullspinne (som i fallet med NP-prover), kan salivbaserade tester dessutom använda värmebaserad ribonukleinsyra (RNA) extraktion direkt, vilket minskar testkostnaderna genom att ta bort behovet av ytterligare buffertar, transportmedier och/eller RNA-extraktionsreagenser14,17.
Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab inrättades för att tillgodose universitetets behov av covid-19-testning och övervakning. I slutna populationer, inklusive universitet, gav frekventa övervakningstester i kombination med social distansering de mest gynnsamma resultaten i epidemiologiska modeller av sjukdomsprevalens18. De konsoliderade CDC 2019-nCOV RT-qPCR19- och SalivaDirect14-protokollen anpassades och automatisering användes i det kliniska arbetsflödet för att minska kostnaderna och förbättra leveranstiden. Tidigare grupper hade använt vätskehanteringsrobotar med öppen källkod för SARS-CoV-2 RNA-extraktionssteg20,21, men vi maximerade användningen av robotarna för att förbereda testplattor och ladda prover22. Här visar vi att det anpassade protokollet och användningen av vätskehanteringssystem med öppen källkod (figur 1) möjliggör snabb och exakt salivbaserad RT-qPCR och är en effektiv strategi för storskalig folkhälsoövervakning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% EtOH</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-032-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 uL Filtered Pipette Tips</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>20uL tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-666-313</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB3384</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-828-743</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0558</td>
			<td>Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPEC Treated Water</td>
			<td>Ambion (Thermo Scientific)</td>
			<td>AM9916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flip Cap 50 mL Conical Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-210</td>
			<td>For sample collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foil PCR Sealing Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0626</td>
			<td>For storage of mastermix plates, Alternate product may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS_RPP30 Synthetic DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>299788131</td>
			<td>P1 positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Buffer Probe One-Step Reaction</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3006B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna WarmStart RT Enzyme Mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M3002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006832</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron HEPA Filter Module</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Not required, but useful to reduce contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Multichannel Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-00005</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron OT-2 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>OT-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opentron Pipette Attachment, P20</td>
			<td>Opentrons</td>
			<td>999-0000215</td>
			<td>For sample loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF450 PLUS 208V-3PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tubes (rnase, dnase free)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>For aliquots of positive and neg controls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10808-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10007062</td>
			<td>Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Forward Primer, 100nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse P Reverse Primer, 100 nmol</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>10006837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2</td>
			<td>Twist Biosciences</td>
			<td>102024 / 103907 / 103909</td>
			<td>N1 Positive Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanners</td>
			<td>Code</td>
			<td>CR1500</td>
			<td>Only required when scaling up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small HEPA Filtered Hood</td>
			<td>Erlab</td>
			<td>Captair Bio 321</td>
			<td>For mastermix preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler CFX384 Touch</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>CFX384 Touch</td>
			<td>Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-acto Knife Set</td>
			<td>Staples</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To cut foil for keeping control wells covered</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient sars-cov-2 quantitative reverse transcriptase pcr saliva diagnostic strategy utilizing open-source pipetting robots

Framväxten av den senaste globala hälsokrisen sars-cov-2 medförde viktiga utmaningar för epidemiologisk forskning och klinisk testning. Covid-19-pandemin kännetecknades av en hög överföringstakt och låg dödlighet och krävde noggrann och effektiv diagnostisk testning, särskilt i slutna befolkningar som bostadsuniversitet. Den initiala tillgången på nukleinsyratestning, som nasofaryngealprover, var begränsad på grund av trycket i leveranskedjan, vilket också försenade rapporteringen av testresultaten. Salivbaserad omvänd transkriptas kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) har visat sig vara jämförbar i känslighet och specificitet med andra testmetoder, och salivsamlingen är mindre fysiskt invasiv för deltagarna. Följaktligen utvecklade vi en multiplex RT-qPCR diagnostisk analys för befolkningsövervakning av Clemson University och det omgivande samhället. Analysen använde vätskehanteringsrobotar och termocyclers med öppen källkod istället för komplexa kliniska automationssystem för att optimera arbetsflödet och systemflexibilitet. Automatisering av salivbaserad RT-qPCR möjliggör snabb och exakt detektion av ett brett spektrum av virala RNA-koncentrationer för både storskaliga och småskaliga testkrav. Den genomsnittliga vändningen för det automatiserade systemet var < 9 h för 95% av proverna och < 24 timmar för 99% av proverna. Kostnaden för ett enda test var $ 2.80 när alla reagenser köptes i bulkkvantiteter.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots at JoVE.com

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

Protokollet beskriver en SARS-CoV-2 diagnostisk metod som använder öppen källkod automatisering för att utföra RT-qPCR molekylär testning av salivprover. Detta skalbara tillvägagångssätt kan tillämpas på klinisk folkhälsoövervakning samt för att öka kapaciteten hos mindre universitetslaboratorier.

Effektiv SARS-CoV-2 Kvantitativ omvänd transkriptas PCR Saliva Diagnostisk strategi med hjälp av öppen källkod pipettering robotar

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

Vi har utvecklat ett billigt, salivbaserat COVID 19-diagnostiktest och arbetsflöde som är enkelt att implementera och skala upp för storskaliga community screening-applikationer. Här använder vi vätskehanteringsrobotar med öppen källkod, standard termocyklar och programvara för att utföra direkt testning av saliv utan extraktions- eller stabiliseringsbuffertar samtidigt som vi ger exakta diagnostiska resultat. På grund av de enkla automatiserade parallella arbetsflödena kan systemet skalas upp för att utföra tusentals tester dagligen med minimal utrustning, utrymme och personalbehov.Förutom Kylie King kommer Rachel Ham, vår kliniska labbhandledare och Austin Smothers vår utbildningskoordinator, att hjälpa till att demonstrera proceduren Börja genom att dekontaminera utsidan av salivuppsamlingsrören med 70% etanol och överföra dem till laboratoriet för testning. Registrera exempel ankomsten genom att skanna varje exempel streckkod i kalkylbladet för dagligt intag. Värme behandla skanningsproverna i 30 minuter i en 95 grader Celsius ugn och ta sedan bort proverna med värmebeständiga handskar.Öppna de dagliga exempelinläsningskalkylbladen för varje provladdningsrobot på exempeltilldelningsstationen. Tilldela sedan 188 prover till varje 384 brunnsplatta. Etikettbrickor med plåtnamn, datum och kvartalsnummer.Skanna proverna i ordning i exempelinläsningskalkylbladet. På provladdningsstationen ställer du upp två hela uppsättningar av åtta 3D-utskrivna rack, vilket motsvarar däckplaceringen i roboten. Lossa kvart ett rör och placera dem i 3D-utskrivna rack, med början med position A1 i rack ett.Fyll varje rack från vänster till höger och uppifrån och ned. Fortsätt detta lastmönster i rack två och fortsätt sedan till rack fyra och fem. Placera laddade kvarts ett provställ på däck ett, två, fyra, fem, sju, åtta, 10, 11.Placera P20-tips på däck tre och nio. För att förenkla installationsprocessen, ladda material från baksidan till framsidan in i roboten. Master mixplattorna tillverkas på en dedikerad robot och lagras vid fyra grader Celsius.En platta används i taget och är märkt med plåtnamn, och ett vasst blad används för att skära en linje i folien runt kontrollbrunnarna. Placera huvudblandningsplattan på däck sex och skala bort foliekåpan och lämna kvar den lilla rektangeln som täcker kontrollbrunnarna. Upptäck tipslådorna och stäng roboten.Initiera det anpassade Python-driftsprotokollet genom att klicka på startkörning genom robot skrivbords programmet. Varje kvartal tar 24,5 minuter att ladda på plattan. Ställ in en timer som en påminnelse.Medan roboten är igång, lossa och ladda kvarts två provrör i den andra uppsättningen 3D-utskrivna rack. När roboten pausar tar du bort kvarten ett rack och ersätter dem med kvarts två rack och klickar sedan på fortsätt köra i skrivbordsprogrammet. Recap kvartal ett provrör och förvara dem i ett fyra grader Celsius kylskåp i väntan på resultat.Upprepa denna laddningsprocess för kvartal tre och fyra. Överför den laddade plattan till ett biosäkerhetsskåp. För att minimera kontaminering, håll plattan täckt under överföringen.Samla in eventuella upprepade exempel och tilldela dem som de sista exemplen i kvartal fyra. Numrera exemplen, skanna streckkoderna och ange den ursprungliga exempelplatsen och resultatet i exempelinläsningskalkylbladet. Överför de upprepade proverna till biosäkerhetsskåpet.Ladda inte de upprepade provrören i robotens lastställ. Pipettera två mikroliter av varje upprepat prov till rätt brunnar. Använd den utsedda pipetten för att lägga till patientprover.Håll kontrollbrunnarna täckta med folie samtidigt som du lägger till prover för att minimera föroreningen. Skala bort folieskyddet över kontrollbrunnarna med tång. Pipetten två mikroliter av bekräftade positiva patientprover i brunnarna M23 och M24.Pipettera två mikroliter av nukleasfritt vatten till brunnarna N23 till N24 och två mikroliter på 200 kopior per mikroliter blandad positiv kontroll till Wells O23 till O24. Lämna brunnarna P23 till P24 tomma för att övervaka huvudblandningens batchkvalitet. Täck plattan med en optiskt klar tätning och använd applikatorrullen för att fästa tätning vid alla brunnar.Virvla plattan vid 2 500 RPM i 30 sekunder för att blanda ordentligt och centrifugera sedan plattan vid 500 gånger G i en minut. Välj protokollprogrammet i termocykelprogramvaran och spara protokollet för framtida plattor. Placera den förseglade plattan i termocykeln och kör protokollet.Exportera CT-värden och kopiera värdena till exempelinläsningskalkylbladet. För positiv kontroll, kontrollera om minst en positiv kontrollbrunn producerar CT-värden mellan 22 och 28 för både P1- och N1-sonder. Alternativt producerar de kända positiva provbrunnarna P1- och N1 CT-värden mindre än 33 på P1- och N1-sonder.För negativ kontroll kontrollerar du att det inte finns några N1- eller P1 CT-värden i någon av de två negativa kontrollbrunnarna. Bekräfta att CT-värden har giltiga förstärkningskurvor innan plattan ogiltigförklaras. Om P1 ger ett resultat av CT mindre än 33, betrakta brunnen som giltig och fortsätt att resultera från N1. Om P1 ger ett resultat av CT som är större än eller är lika med 33 eller inget CT-värde, betrakta det som ogiltigt.Om N1 ger ett resultat av CT mindre än 33, utvärdera brunnen och ja. Om N1 inte producerar ett CT-värde, utvärdera brunnen som nej. Om N1 producerar ett CT-värde som är större än eller är lika med 33, bedöm brunnen som ingen stjärna.Bekräfta att alla N1 CT-värden är associerade med en verklig förstärkningskurva. Om ett CT-värde för N1 inte har någon förstärkningskurva är brunnen nej. Identifiera upprepningsproverna, märka dem med ett internt exempelnummer och exempeltyp och returnera dem till inläsningsarbetsflödet.De representativa bilderna visar RTQ PCR-detektering av N1 eller SARS CoV-2 syntetiskt RNA och P1 eller HSRPP30 syntetiskt DNA. Standardkurvor ritades med standardavvikelser för att bestämma området för exakt detektion med hjälp av denna sondprimerkombination. De genomsnittliga CT-värden som erhållits i respektive utspädning plottades mot den uppskattade mängden syntetiskt RNA och syntetiskt DNA.I båda fallen visade de linjära kurvorna bra korrelationskoefficienter över ett brett spektrum av genkopior koncentrationer. N1 CT-värden som erhållits från unika prover med hjälp av både roboten och manuell provbelastning överfördes för att bestämma interanalysvariationen mellan manuell och robotbelastning. Det linjära förhållandet mellan manuella och automatiserade metoder gav en hög korrelationskoefficient som indikerar att båda metoderna är funktionellt likvärdiga.Intraanalysvariationen fastställdes också med hjälp av transponerade replikativa N1 CT-värden som erhållits från både roboten och manuell provbelastning. Utvärdering av värmebehandlingsmetoder för viskositetsreduktion i saliven visas här. SARS CoV-2 negativt saliv samlades in från en enda källa och alikvoter värmebehandlades i antingen noll minuter, 30 minuter eller 60 minuter vid 95 grader Celsius.P1 CT värden från tekniska replikat av varje villkor ritades för att fastställa variabiliteten mellan behandlingsmetoderna. Både 30 minuter och 60 minuters värmebehandlingsmetoder producerade signifikant minskad provvariation jämfört med ingen behandlingskontroll. det fanns ingen signifikant skillnad mellan 30 minuter och 60 minuters behandlingar.Därför genomfördes 30 minuters värmebehandlingsmetod för att minska bearbetningstiden. Använd rätt aseptisk teknik för att minimera föroreningen av testplattorna, särskilt vid lastning av manuella prover och kontroller. Undvik att korsa plattan med händer eller ärmar.När kliniska resultat har producerats kan prover kasseras i biologiskt farligt avfall eller sparas för ytterligare analys, såsom helgenomsekvensering för att bestämma specifika stammar. Denna teknik möjliggör storskalig samhällstestning, vilket gör det möjligt för oss att undersöka effekterna av testtäckning och den icke-symptomatiska spridningen av Covid 19.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Snabb Screening av hiv omvänt transkriptas och Grashämmare

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Använda Antigen Capsid-inkorporering strategi för utveckling av adenovirus serotyp 5-vektor Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

Kvantitativ PCR av T7 Bacteriophage från Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

Påvisande av SARS-CoV-2 neutraliserande antikroppar med hjälp av fluorescerande avbildning med hög genomströmning av pseudovirusinfektion

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Quantifying Vaccine-Induced Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Variants

Application of Ha-CoV-2 Pseudovirus for Rapid Quantification of SARS-CoV-2 Variants and Neutralizing Antibodies

Author Spotlight: A Pseudotype Virus System for Assessing Omicron Subvariants and Neutralizing Antibodies in SARS-CoV-2 Research

The coronavirus disease 2019 pandemic (COVID-19) has highlighted the need for rapid assays to accurately measure the infectivity of emerging SARS-CoV-2 ...