Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) og McMaster University.

BEMÆRK: Alle trin, der anvender internationale jordprøver og / eller A. fumigatussporer og mycelia, kræver arbejde inden for et biosikkerhedsskab til niveau 2-organismer (BSCII).
1. Isolering af gær fra jord
<ol><li>Fremstilling af antibakterielle og antifungale opløsninger<ol>
<li>Chloramphenicolpulver suspenderes i 70 % ethanol for at fremstille en 50 g/l stamopløsning. Sterilisation ved sprøjtefiltrering og opbevares ved 4 °C. BEMÆRK: Dette antibiotik...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivariate+analysis+of+soil+yeasts+isolated+from+a+latitudinal+gradient.">A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient.</a> Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).</li><li>Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).</li><li>Samarasinghe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+culturable+soil+yeast+diversity.">Global patterns in culturable soil yeast diversity.</a> iScience. 24 (10), 103098 (2021).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+DNA+barcoding.">Fungal DNA barcoding.</a> Genome. 59 (11), 913-932 (2016).</li><li>Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+yeasts+and+where+to+find+them:+the+discovery+of+a+predominantly+clonal+Cryptococcus+deneoformans+population+in+Saudi+Arabian+soils.">Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).</li><li>Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relationships+among+strains+of+culturable+yeasts+in+agricultural+soils+in+Cameroon.">Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity.">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+species+concepts+in+the+genomics+era.">Fungal species concepts in the genomics era.</a> Genome. 63 (9), 459-468 (2020).</li><li>Brakhage, A. A., Langfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menacing+mold:+The+molecular+biology+of+Aspergillus+fumigatus.">Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus.</a> Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).</li><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+multi-national+prevalence+of+fungal+diseases-Estimate+precision.">Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision.</a> Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).</li><li>Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Protokollen udviklet til isolering af gær og A. fumigatus fra jord er en hurtig og effektiv metode til jordbehandling med høj kapacitet og svampeisolering. Protokollen kræver kun en lille mængde jord (0,1-0,2 g) pr. prøve, hvilket gør det muligt at udtage prøver af flere steder med lignende indsats. Den hurtige behandlingstid sikrer, at resultaterne kan opnås inden for en kort tidsramme og giver tid til fejlfinding og gentagelse af eksperimenter, hvis det er nødvendigt. Denne protokol kan let replikeres...

Svampe i jordens økosystemer spiller væsentlige roller i nedbrydning af organisk materiale, næringsstofkredsløb og jordgødning1. Både kulturuafhængige (dvs. high-throughput sekventering) og kulturafhængige tilgange anvendes i vid udstrækning i studiet af jordsvampe 2,3. Mens den store mængde data, der genereres af metabarkodesekventering med høj kapacitet, er nyttig til at belyse brede mønstre i samfundsstruktur og mangfoldighed, kan den kulturafhængige tilgang give meget komplementær information om svampesamfundenes taksonomiske og funktionelle strukturer samt mere specifikke profiler af individuelle organismer gennem nedstrøms mangfoldighed og funktionelle analyser på grund af tilgængeligheden af rene svampekulturer.
På trods af at gær, der sjældent overstiger tusindvis af celler pr. Gram jord, er gær, bredt defineret som encellede svampe, essentielle nedbrydere og fødekilder for andre jordboere 4,5. Faktisk kan gær være de dominerende jordsvampe i kolde biosfærer som kontinental Antarktis 6,7. Jord er også et primært reservoir af medicinsk relevante gær, der forårsager alvorlige opportunistiske infektioner hos mennesker og andre pattedyr8. På trods af morfologiske ligheder er gærarter fylogenetisk forskellige og forekommer blandt filamentøse svampe i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, inden for svamperiget9. Gær mangler en definerende DNA-signatur ved svampebarkodningsgenet, den interne transskriberede afstandsstykke (ITS) region i den nukleare ribosomale RNA-genklynge10, hvilket gør dem umulige at skelne fra andre svampe i metagenomics-undersøgelser og dermed nødvendiggør brug af kulturafhængige metoder til at isolere gærarter.
Protokollen nedenfor blev implementeret for at karakterisere jordgærsamfund i ni lande og identificere globale tendenser og mønstre i jordgærdiversitet 9,11,12. Metagenomics-tilgange er af begrænset anvendelse ved undersøgelse af målgrupper af organismer såsom gær 2,3. På grund af deres fylogenetiske mangfoldighed kan gær ikke skelnes fra andre svampe baseret på DNA-sekvens alene. Undersøgelse af gærpopulationer kræver således fortsat brug af kulturafhængig isolation. Dyrkning er dog ofte betydeligt mere tidskrævende og kræver mere personale til at udføre forsøgene. Derfor er protokollen optimeret og strømlinet til hurtigere behandling med begrænset personale. Den største fordel ved dyrkning er, at de identificerede gærarter er levende gær og ikke døde, og dermed er mere tilbøjelige til at være ægte jordboere snarere end forbigående celler, der er til stede i jorden. Det er blevet anslået, at ca. 40% af svampe-DNA i jord enten er forurenende stoffer fra andre miljøer, ekstracellulære eller kommer fra celler, der ikke længere er intakte, hvilket forårsager sekventeringsmetoder med høj kapacitet til at overvurdere svamperigdom med så meget som 55% 13. Kulturafhængig isolering kan let bekræfte gærarters identitet med den ekstra fordel at sikre ren kultur, der skal bruges i downstream-analyser. Faktisk blev rene kulturer af 44 formodede nye gærarter identificeret ved hjælp af denne jordisoleringsprotokol, der tillod brugen af en række metoder til at studere deres taksonomiske og funktionelle egenskaber i detaljer14.
Protokollen nedenfor kan også bruges til at isolere skimmelsvampe, der findes i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk skimmelsvamp med en bred, global fordeling i jord15. Det er blevet isoleret fra adskillige kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøveudtagning omfatter almindeligvis luft, organisk affald (kompost, savstøv, tulipanløgaffald) og jord (landbrugs-, have- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen, der forårsager en række infektioner, der samlet betegnes aspergillose, der påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden16,20. Cirka 300.000 mennesker over hele kloden lider af invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige form for aspergillose16. Afhængigt af faktorer som patientpopulationen, infektionsstedet og effekten af svampedræbende terapi kan dødeligheden være så høj som 90%. I løbet af de sidste årtier er resistens over for svampedræbende terapier steget, hvilket kræver global overvågningsindsats i både kliniske og miljømæssige populationer for at spore disse resistensgenotyper 21,22,23. På grund af sin evne til at vokse ved temperaturer op til 50 ° C kan denne temperatur udnyttes til at vælge A. fumigatus-isolater fra jord ved hjælp af kulturafhængige metoder. Aspergillus fumigatus-isolater genotypes almindeligvis ved ni stærkt polymorfe korte tandem-gentagelseslokaliteter (STR), der har vist sig at have høj diskriminerende effekt mellem stammer24. Disse STR-genotyper kan sammenlignes med andre tidligere undersøgte populationer for at spore spredningen af A. fumigatus-genotyper, herunder lægemiddelresistensgener, rundt om i verden.
Nedenfor beskriver vi en protokol for hurtig isolering af gær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturafhængig måde. Afhængigt af mængden af jord, der opnås pr. prøve, kan jordprøverne deles mellem de to protokoller. I sammenligning med lignende metoder, der isolerer gær og A. fumigatus fra jord, bruger denne protokol 10 gange mindre jord pr. Opnået isolat. Undersøgelser, der forsøger at isolere A. fumigatus fra jord, kræver mellem 1 og 2 g jord pr. isolat, mens denne protokol kun kræver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokol bruger mindre plast og beholdere, der letter dens design med høj kapacitet. Derfor kan et større antal prøver behandles ved hjælp af mindre plads til udstyr såsom inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fuldt ud for at opnå isolater på så lidt som 7 dage. Denne protokol er optimeret til at tillade behandling af op til 150-200 prøver pr. Dag pr. Person.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Jord er vært for en utrolig mængde mikrobielt liv, hvor hvert gram indeholder op til milliarder af bakterie-, arkæale og svampeceller. Flercellede svampe såsom skimmelsvampe og encellede svampe, bredt defineret som gær, opfylder væsentlige roller i jordøkosystemer som nedbrydere af organisk materiale og som fødekilder for andre jordboere. Svampeartsdiversitet i jorden er afhængig af en lang række klimatiske faktorer såsom nedbør og temperatur samt jordegenskaber, herunder organisk materiale, pH og fugt. Mangel på tilstrækkelig miljøprøvetagning, især i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika og Mellemamerika, hindrer karakteriseringen af jordsvampesamfund og opdagelsen af nye arter. 
Vi karakteriserede jordsvampesamfund i ni lande på tværs af seks kontinenter ved hjælp af ~ 4.000 jordprøver og en protokol udviklet i laboratoriet til isolering af gær og skimmelsvampe. Denne protokol begynder med separat selektiv berigelse for gær og den medicinsk relevante skimmel Aspergillus fumigatus, i flydende medier, samtidig med at bakterievækst hæmmes. Resulterende kolonier overføres derefter til faste medier og behandles yderligere for at opnå rene kulturer efterfulgt af nedstrøms genetisk karakterisering. Gærartsidentitet etableres via sekventering af deres interne transskriberede spacer (ITS) region af den nukleare ribosomale RNA-genklynge, mens den globale populationsstruktur af A. fumigatus udforskes via mikrosatellitmarkøranalyse. 
Protokollen blev med succes anvendt til at isolere og karakterisere jordgær og A. fumigatus populationer i Cameroun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabien. Disse resultater afslørede tiltrængt indsigt i globale mønstre i jordgærdiversitet samt global befolkningsstruktur og svampedræbende resistensprofiler af A. fumigatus. Dette papir præsenterer metoden til isolering af både gær og A. fumigatus fra internationale jordprøver.

Gærisolering fra jord Ovennævnte gærisoleringsprotokol blev implementeret til dyrkning af gær fra jordprøver, der stammer fra 53 steder i ni lande 9,12. I alt blev 1.473 gærstammer isoleret fra 3.826 jordprøver. I betragtning af de forskellige klimatiske forhold i de ni oprindelseslande blev den bedste inkubationstemperatur for hvert land bestemt på grundlag af dets årlige gennemsnitstemperatur (tabel 1). På grund af...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Denne protokol er en effektiv, hurtig metode til dyrkning af gær og formen Aspergillus fumigatus fra store sæt jordprøver på så lidt som 7 dage. Metoderne kan let ændres for at imødekomme en række inkubationsmedier og temperaturer efter behov for eksperimenter.

Isolering af dyrkbare gær og skimmelsvampe fra jord for at undersøge svampepopulationsstruktur

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Vores protokol undersøger gær- og skimmeldiversitet i jord ved hjælp af jordprøver fra forskellige klimatiske regioner. Dette giver indsigt i miljøgærdiversitet og hjælper med at spore patogene arter. Protokollen tilbyder en omkostningseffektiv og hurtig metode til høst af gær og skimmel fra jorden.Jordprøver kan behandles fuldt ud for at opnå isolater på så lidt som syv dage. Velorganiseret eksperimentel opsætning, såsom mærkning af kulturrør og forberedelse af medier en dag i forvejen, er nøglen til at undgå at føle sig overvældet under eksperimentet. Start med at forberede et sæt sterile 13 ml kulturrør.Ved at mærke dem med jordprøve-ID, skal du bruge en serologisk pipette til at tilføje fem milliliter gærekstrakt-Peptone-Dextrose bouillon suppleret med chloramphenicol og benomyl i hvert rør. Inde i et biosikkerhedsskab til niveau to organismer overføres ca. 0,1 gram jord til det passende kulturrør ved hjælp af en steril træplanspidsapplikator. Dæk røret sikkert til det første stop, hvilket forhindrer spild, samtidig med at luften udveksles under inkubation.Derefter inkuberes kulturrørene i en rulletromle i 24 timer ved en temperatur, der anses for optimal til maksimering af gærvækst. Mærk derefter chloramphenicol og benomyl suppleret gærekstrakt peptone-dextrose agarplader med jordprøve-ID' et, inden supernatanten overføres til det faste medium. Fjern kulturrørene fra rulletromlen.Derefter inde i et biosikkerhedsskab til niveau to organismer, hvirvel kortvarigt røret for at trække jordpartikler og celler, der kan have slået sig ned i bunden tilbage i suspension. Overfør derefter 100 mikroliter af supernatanten til en plade ved hjælp af en mikropipette. Brug en steril genanvendelig cellespreder til at sprede væsken grundigt og jævnt over agaroverfladen.Efter tilstrækkelig inkubationstid på to til tre dage skal pladerne inspiceres for enhver gærvækst inde i et biosikkerhedsskab for niveau to organismer. Kig efter cremede, runde, matlignende gær, der let kan skelnes fra bakterie- og skimmelkolonier. Vælg en gærlignende koloni fra hver plade ved hjælp af sterile applikatorpinde af træ med almindelig spids.Overfør hver udvalgt koloni til et frisk gærekstrakt peptone-dextro agarplader suppleret med chloramphenicol og benomyl og stribe til enkeltkolonier. Udfør tre separate striber, og brug en ny applikatorpind til hver stribe. Brug derefter friske celler udviklet på en plade til at udføre en kolonipolymerasekædereaktion.Brug interne transskriberede afstandsstykker ITS1- og ITS4-primere til at forstærke det svampebjælkekodende gen. Sammenlign den opnåede interne transskriberede afstandssekvens af gærstammerne, to sekvenser deponeret i offentlige databaser, såsom National Center for Biotechnology Information GenBank og UNITE for at etablere artsidentitet. Tilsæt jord til 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende en milliliter Sabouraud dextrose bouillon og inkuberes ved 50 grader Celsius i to til fire dage.For at overføre mycelia fra jorden podet bouillon til maltekstrakt agarplader, skal du først identificere jordens inokulumer, der har synlig mycelvækst, tilsæt Sabouraud dextrose bouillon til luftgrænse. Brug derefter steriliserede applikatorpinde af træ til at overføre mycelia til midten af en maltekstraktagarplade og inkubere disse maltekstrakt agarpladesæt 37 grader Celsius i tre dage. Til udvælgelse af mycelia, med Aspergillus fumigatus morfologiske egenskaber, identificere de skimmelkolonier, der har karakteristisk grøn svajende-lignende vækst.Inde i et biosikkerhedsskab til niveau to organismer, høst conidia eller mycelia ved at skrabe overfladen en gang ved hjælp af steriliserede træplanspidsapplikatorpinde eller en podningssløjfe og overfør den til midten af en maltekstrakt agarplade ved at stryge på agaren til enkeltkolonier. Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i to dage. Ved hjælp af en steril applikationspind eller podningssløjfe subkulturerer en enkelt koloni genereret på maltekstraktagar ved at stribe kolonien en gang.Spred de høstede sporer i midten af pladen. Forbered en steril 30% glycerolopløsning for at høste Aspergillus fumigatussporer eller mycelia til kulturopbevaring. Efter de to dages inkubation af agarpladerne ved 37 grader Celsius aspireres en milliliter af 30% glycerolopløsningen ved hjælp af en pipette og dispergeres på Aspergillus fumigatuskolonien.Til fænotypisk identifikation af Aspergillus fumigatus stammer, aspirere 10 mikroliter af mycel- og sporestammerne for at tilføje 990 mikroliter vand. Vortex denne fortyndede spore suspension og dispensere 10 mikroliter af suspensionen på et standard mikroskop dias. Brug derefter et sammensat mikroskop ved 400X forstørrelse til at se suspensionen og lokalisere conidiophorer.Sammenlign den observerede conidiophore morfologi med Aspergillus fumigatus conidiophore morfologi. For at bestemme den korrekte fragmentstørrelse for hver af de ni mikrosatellitlokaliteter skal du bruge software, der er i stand til fragmentanalyse. Hent de rå data opnået fra kapillær elektroforese og score fragmentstørrelserne baseret på den største top ved hjælp af den fragmenterede analysesoftware.Konverter derefter fragmentstørrelserne til gentagelsestal for hver af de ni lave brug fragmentstørrelserne af gentagelsesnumrene for referencestammen Af293. Fra 3.826 jordprøver indsamlet fra 53 steder i ni lande blev 1.473 gærstammer isoleret. Den bedste inkubationstemperatur for hvert land blev bestemt ud fra dens gennemsnitlige årlige temperatur.I sjældnefactionanalyser for hvert land blev Shannon-mangfoldighedsindekset brugt som et mål for jordgærdiversitet. De resulterende rarefaction-kurver nærmede sig mætningsasymptoten, hvilket indikerer, at yderligere prøveudtagning sandsynligvis ikke har givet mere gærdiversitet. Mycelvækst på plader dannede den grønne svajede morfologi, der er typisk for Aspergillus fumigatus.Andre termotolerante svampearter kunne være til stede i samme jordprøve og dyrke Aspergillus fumigatus på samme plade eller af sig selv. Aspergillus fumigatus conidiophore struktur set og identificeret ved hjælp af lysmikroskopi afslørede, at conidiophores har en kugle på pindmorfologien, og conidiophores er uniseriate, hvor phialiderne fastgjort til conidiiakæderne er fastgjort direkte til den sfæriske vesikel. Et kromatogram genereret biseriat afslørede de tre kanaler, der visualiserede fragmentlængderne af Aspergillus fumigatus dinucleotid, trinukleotid og tetranukleotid korte tandem gentagelser loci.Et minimum spanning-netværk af høj kvalitet kan genereres ved hjælp af R-scriptet plot_poppr_msn eller imsn. En diskriminerende analyse af hovedkomponenter er en anden metode til at visualisere de genetiske forhold mellem stammer. Tilsætning af benomyl og chloramphenicol til vækstmedier forhindrer henholdsvis skimmel og bakterievækst og favoriserer gærvalg.Chloramphenicol reducerer også gæring i medier og sænker gasopbygningen i inkubationsrør. Udførelse af metagenomics på jordprøver vil give yderligere information om kulturel mangfoldighed. Modtagelig test af A.fumigatus stammer vil identificere tilstedeværelsen af resistensgenotyper.Denne protokol kan anvendes på andre gær- og skimmelsystemer med lidt ændring. Det lettede undersøgelsen af kulturel jordgærdiversitet og dens forudsigere på globalt plan.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og oprensning af kinesin fra Drosophila Embryoner

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering af Small noncoding RNA&#39;er fra human serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering af myofibroblaster fra mus og human Spiserøret

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse af Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedligeholdelse af en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Fjernelse af Eksogene Materialer fra den ydre del af frosne kerner at undersøge den gamle biologiske samfund nærede Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolering og karakterisering af mikrovesikler fra perifert blod

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker til at fremkalde og kvantificere cellesenescens

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...