Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) en McMaster University.

OPMERKING: Alle stappen die gebruik maken van internationale bodemmonsters en / of A. fumigatus-sporen en mycelia vereisen werken in een bioveiligheidskast voor niveau 2-organismen (BSCII).
1. Isolatie van gist uit de bodem
<ol><li>Bereiding van antibacteriële en schimmelwerende oplossingen<ol>
<li>Suspensie chlooramfenicolpoeder in 70% ethanol om een 50 g / L stockoplossing te bereiden. Steriliseren door spuitfiltratie en bewaren bij 4 °C. OPMERKING: Dit antib...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivariate+analysis+of+soil+yeasts+isolated+from+a+latitudinal+gradient.">A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient.</a> Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).</li><li>Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).</li><li>Samarasinghe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+culturable+soil+yeast+diversity.">Global patterns in culturable soil yeast diversity.</a> iScience. 24 (10), 103098 (2021).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+DNA+barcoding.">Fungal DNA barcoding.</a> Genome. 59 (11), 913-932 (2016).</li><li>Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+yeasts+and+where+to+find+them:+the+discovery+of+a+predominantly+clonal+Cryptococcus+deneoformans+population+in+Saudi+Arabian+soils.">Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).</li><li>Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relationships+among+strains+of+culturable+yeasts+in+agricultural+soils+in+Cameroon.">Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity.">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+species+concepts+in+the+genomics+era.">Fungal species concepts in the genomics era.</a> Genome. 63 (9), 459-468 (2020).</li><li>Brakhage, A. A., Langfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menacing+mold:+The+molecular+biology+of+Aspergillus+fumigatus.">Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus.</a> Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).</li><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+multi-national+prevalence+of+fungal+diseases-Estimate+precision.">Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision.</a> Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).</li><li>Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Het protocol dat is ontwikkeld voor het isoleren van gisten en A. fumigatus uit de bodem is een snelle en efficiënte methode voor bodemverwerking met hoge doorvoer en schimmelisolatie. Het protocol vereist slechts een kleine hoeveelheid grond (0,1-0,2 g) per monster, waardoor meer locaties met vergelijkbare inspanning kunnen worden bemonsterd. De snelle doorlooptijd zorgt ervoor dat resultaten binnen een kort tijdsbestek kunnen worden verkregen en biedt tijd voor het oplossen van problemen en het indien nodig h...

Schimmels in bodemecosystemen spelen een essentiële rol bij de afbraak van organisch materiaal, nutriëntenkringloop en bodembemesting1. Zowel cultuuronafhankelijke (d.w.z. high-throughput sequencing) als cultuurafhankelijke benaderingen worden veel gebruikt bij de studie van bodemschimmels 2,3. Hoewel de grote hoeveelheid gegevens die wordt gegenereerd door metabarcode-sequencing met hoge doorvoer nuttig is voor het ophelderen van grootschalige patronen in gemeenschapsstructuur en diversiteit, kan de cultuurafhankelijke benadering zeer complementaire informatie bieden over de taxonomische en functionele structuren van schimmelgemeenschappen, evenals meer specifieke profielen van individuele organismen door middel van downstream diversiteit en functionele analyses vanwege de beschikbaarheid van pure schimmelculturen.
Ondanks het feit dat ze zelden duizenden cellen per gram grond overschrijden, zijn gisten, breed gedefinieerd als eencellige schimmels, essentiële afbrekers en voedselbronnen voor andere bodembewoners 4,5. In feite kunnen gisten de overheersende bodemschimmels zijn in koude biosferen zoals continentaal Antarctica 6,7. Bodem is ook een primair reservoir van medisch relevante gisten die ernstige opportunistische infecties veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren8. Ondanks morfologische overeenkomsten zijn gistsoorten fylogenetisch divers en komen ze voor bij filamenteuze schimmels in twee belangrijke phyla, Ascomycota en Basidiomycota, binnen het schimmelrijk9. Gisten missen een bepalende DNA-signatuur bij het schimmelbarcoding-gen, het interne getranscribeerde spacer (ITS) -gebied van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster10, waardoor ze niet te onderscheiden zijn van andere schimmels in metagenomics-onderzoeken en dus het gebruik van cultuurafhankelijke methoden vereisen om gistsoorten te isoleren.
Het onderstaande protocol werd geïmplementeerd om bodemgistgemeenschappen van negen landen te karakteriseren en wereldwijde trends en patronen in bodemgistdiversiteit te identificeren 9,11,12. Metagenomics-benaderingen zijn van beperkt nut bij het bestuderen van gerichte groepen organismen zoals gisten 2,3. Vanwege hun fylogenetische diversiteit kunnen gisten niet worden onderscheiden van andere schimmels op basis van dna-sequentie alleen. Het bestuderen van gistpopulaties vereist dus het voortdurende gebruik van cultuurafhankelijke isolatie. Het kweken is echter vaak aanzienlijk tijdrovender en vereist meer personeel om de experimenten uit te voeren. Daarom is het protocol geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor een snellere verwerking met beperkt personeel. Het belangrijkste voordeel van kweken is dat de geïdentificeerde gistsoorten levende gisten zijn en geen dode, en dus eerder echte bodembewoners zijn dan voorbijgaande cellen die in de bodem aanwezig zijn. Er is geschat dat ongeveer 40% van het schimmel-DNA in de bodem ofwel verontreinigingen zijn uit andere omgevingen, extracellulair, of afkomstig zijn van cellen die niet langer intact zijn, waardoor high-throughput sequencing-benaderingen worden veroorzaakt om schimmelrijkdom met maar liefst 55% te overschatten 13. Cultuurafhankelijke isolatie kan de identiteit van gistsoorten gemakkelijk bevestigen met als bijkomend voordeel dat zuivere cultuur wordt veiliggesteld voor gebruik in downstream-analyses. Inderdaad, zuivere culturen van 44 vermeende nieuwe gistsoorten werden geïdentificeerd met behulp van dit bodemisolatieprotocol dat het gebruik van een reeks methoden mogelijk maakte om hun taxonomische en functionele eigenschappen in detail te bestuderen14.
Het onderstaande protocol kan ook worden gebruikt om schimmels in de bodem te isoleren, zoals A. fumigatus. Aspergillus fumigatus is een thermofiele en saprofytische schimmel met een brede, wereldwijde verspreiding in de bodem15. Het is geïsoleerd uit tal van klinische en niet-klinische omgevingen. Niet-klinische bemonstering omvat gewoonlijk lucht, organisch puin (compost, zaagsel, tulpenbollenafval) en grond (landbouw-, tuin- en natuurlijke bodems)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus is een menselijke opportunistische ziekteverwekker die een reeks infecties veroorzaakt die gezamenlijk aspergillose worden genoemd en die wereldwijd meer dan 8 miljoen mensen16,20 treffen. Ongeveer 300.000 mensen over de hele wereld lijden aan invasieve aspergillose, de meest ernstige vorm van aspergillose16. Afhankelijk van factoren zoals de patiëntenpopulatie, de plaats van infectie en de werkzaamheid van antischimmeltherapie, kan het sterftecijfer oplopen tot 90%. In de afgelopen decennia is de resistentie tegen antischimmeltherapieën toegenomen, waardoor wereldwijde surveillance-inspanningen in zowel klinische als omgevingspopulaties nodig zijn om deze resistentiegenotypes te volgen 21,22,23. Gezien het vermogen om te groeien bij temperaturen boven 50 °C, kan deze temperatuur worden gebruikt om te selecteren op A. fumigatus isolaten uit de bodem met behulp van cultuurafhankelijke methoden. Aspergillus fumigatusisolaten worden gewoonlijk gegenotypeerd bij negen zeer polymorfe korte tandem repeat (STR) loci, waarvan is aangetoond dat ze een hoog discriminerend vermogen hebben tussen stammen24. Deze STR-genotypen kunnen worden vergeleken met andere eerder onderzochte populaties om de verspreiding van A. fumigatus-genotypen, inclusief medicijnresistentiegenen, over de hele wereld te volgen.
Hieronder beschrijven we een protocol voor de snelle isolatie van gisten en A. fumigatus uit bodemmonsters op een cultuurafhankelijke manier. Afhankelijk van de hoeveelheid grond die per monster wordt verkregen, kunnen de bodemmonsters worden verdeeld tussen de twee protocollen. In vergelijking met vergelijkbare methoden die gist en A. fumigatus uit de bodem isoleren, gebruikt dit protocol 10x minder grond per verkregen isolaat. Studies die proberen A. fumigatus uit de bodem te isoleren, vereisen tussen 1 en 2 g grond per isolaat, terwijl dit protocol slechts 0,1-0,2 g grond 18,19,25 vereist. Dit protocol maakt gebruik van kleinere kunststoffen en containers die het ontwerp met hoge doorvoer vergemakkelijken. Daarom kan een groter aantal monsters worden verwerkt met minder ruimte voor apparatuur zoals incubators en roltrommels. Bodemmonsters kunnen volledig worden verwerkt om isolaten te verkrijgen in slechts 7 dagen. Dit protocol is geoptimaliseerd om verwerking van maximaal 150-200 monsters per dag per persoon mogelijk te maken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

De bodem is gastheer voor een ongelooflijke hoeveelheid microbieel leven, waarbij elke gram tot miljarden bacteriële, archaeale en schimmelcellen bevat. Meercellige schimmels zoals schimmels en eencellige schimmels, breed gedefinieerd als gisten, vervullen essentiële rollen in bodemecosystemen als afbrekers van organisch materiaal en als voedselbronnen voor andere bodembewoners. De diversiteit van schimmelsoorten in de bodem is afhankelijk van een groot aantal klimatologische factoren zoals regenval en temperatuur, evenals bodemeigenschappen zoals organisch materiaal, pH en vocht. Gebrek aan adequate milieubemonstering, vooral in regio's van Azië, Afrika, Zuid-Amerika en Midden-Amerika, belemmert de karakterisering van bodemschimmelgemeenschappen en de ontdekking van nieuwe soorten. 
We hebben bodemschimmelgemeenschappen in negen landen op zes continenten gekarakteriseerd met behulp van ~ 4.000 bodemmonsters en een protocol dat in het laboratorium is ontwikkeld voor de isolatie van gisten en schimmels. Dit protocol begint met afzonderlijke selectieve verrijking voor gisten en de medisch relevante schimmel Aspergillus fumigatus, in vloeibare media terwijl de bacteriegroei wordt geremd. Resulterende kolonies worden vervolgens overgebracht naar vaste media en verder verwerkt om zuivere culturen te verkrijgen, gevolgd door downstream genetische karakterisering. De identiteit van gistsoorten wordt vastgesteld via sequencing van hun interne getranscribeerde spacer (ITS) -regio van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster, terwijl de wereldwijde populatiestructuur van A. fumigatus wordt onderzocht via microsatellietmarkeranalyse. 
Het protocol werd met succes toegepast om bodemgist- en A. fumigatuspopulaties in Kameroen, Canada, China, Costa Rica, IJsland, Peru, Nieuw-Zeeland en Saoedi-Arabië te isoleren en te karakteriseren. Deze bevindingen onthulden de broodnodige inzichten in wereldwijde patronen in bodemgistdiversiteit, evenals de wereldwijde bevolkingsstructuur en antischimmelresistentieprofielen van A. fumigatus. Dit artikel presenteert de methode om zowel gisten als A. fumigatus te isoleren uit internationale bodemmonsters.

Gistisolatie uit de bodem Het bovenstaande gistisolatieprotocol werd geïmplementeerd om gisten te kweken uit bodemmonsters afkomstig van 53 locaties in negen landen 9,12. In totaal werden 1.473 giststammen geïsoleerd uit 3.826 bodemmonsters. Gezien de verschillende klimatologische omstandigheden van de negen landen van oorsprong werd de beste incubatietemperatuur voor elk land bepaald op basis van de gemiddelde jaartemperatuur (tabel...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Ons protocol onderzoekt gist- en schimmeldiversiteit in de bodem met behulp van bodemmonsters verkregen uit verschillende klimatologische regio's. Dit geeft inzicht in de diversiteit van milieugisten en helpt bij het volgen van pathogene soorten. Het protocol biedt een kosteneffectieve en snelle methode om gisten en schimmels uit de bodem te oogsten.Bodemmonsters kunnen volledig worden verwerkt om isolaten te verkrijgen in slechts zeven dagen. Goed georganiseerde experimentele opstelling, zoals het labelen van kweekbuizen en het voorbereiden van media een dag van tevoren, is de sleutel om te voorkomen dat je je overweldigd voelt tijdens het experiment. Begin met het bereiden van een set steriele kweekbuizen van 13 milliliter.Door ze te labelen met bodemmonster-ID, gebruik dan een serologische pipet om vijf milliliter gistextract-pepton-dextrose-bouillon aangevuld met chlooramfenicol en benomyl in elke buis toe te voegen. Breng in een bioveiligheidskast voor organismen van niveau twee ongeveer 0,1 gram grond over in de juiste kweekbuis met behulp van een steriele houten vliegtuigpuntapplicator. Sluit de buis stevig af tot de eerste stop, voorkom morsen terwijl de luchtuitwisseling tijdens de incubatie mogelijk is.Incubeer vervolgens de kweekbuizen in een roltrommel gedurende 24 uur bij een temperatuur die optimaal wordt geacht voor het maximaliseren van de gistgroei. Label vervolgens de chlooramfenicol en benomyl aangevulde gist extract peptone-dextrose agar platen met de bodemmonster ID voordat het supernatant naar het vaste medium. Verwijder de kweekbuizen uit de roltrommel.Vervolgens in een bioveiligheidskast voor organismen van niveau twee, vortex de buis kort om bodemdeeltjes en cellen die zich mogelijk aan de onderkant hebben genesteld, terug in suspensie te trekken. Breng vervolgens 100 microliter van het supernatant over op een plaat met behulp van een micropipette. Gebruik een steriele herbruikbare celverspreider om de vloeistof grondig en gelijkmatig over het agaroppervlak te verspreiden.Nadat u voldoende incubatietijd van twee tot drie dagen hebt in acht genomen, inspecteert u de platen op eventuele gistgroei in een bioveiligheidskast op organismen van niveau twee. Zoek naar romige, ronde, matte gisten die gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van bacterie- en schimmelkolonies. Selecteer een gistachtige kolonie uit elke plaat met behulp van steriele houten applicatorsticks met platte punt.Breng elke geselecteerde kolonie over op een vers gistextract peptone-dextro agar platen aangevuld met chlooramfenicol en benomyl en streak voor enkele kolonies. Voer drie afzonderlijke strepen uit en gebruik een nieuwe applicatorstick voor elke streep. Gebruik vervolgens verse cellen die op een plaat zijn ontwikkeld om een koloniepolymerasekettingreactie uit te voeren.Gebruik interne getranscribeerde spacers ITS1 en ITS4 primers om het schimmelstaafcoderende gen te versterken. Vergelijk de verkregen interne getranscribeerde spacersequentie van de giststammen, twee sequenties die zijn gedeponeerd in openbare databases, zoals het National Center for Biotechnology Information GenBank en UNITE om de soortidentiteit vast te stellen. Voeg aarde toe aan 1,5 milliliter microcentrifugebuizen met één milliliter Sabouraud dextrose-bouillon en incubeer bij 50 graden Celsius gedurende twee tot vier dagen.Om de mycelia van de in de grond geënte bouillon over te brengen op moutextract agarplaten, identificeert u eerst de bodem-entmateriaal met zichtbare myceliale groei en voegt u de Sabouraud dextrose-bouillon toe aan de luchtgrens. Gebruik vervolgens gesteriliseerde houten applicatorsticks met platte punt om de mycelia over te brengen naar het midden van een moutextract agarplaat en incubeer deze moutextract agarplaat set 37 graden Celsius gedurende drie dagen. Voor de selectie van mycelia, met Aspergillus fumigatus morfologische eigenschappen, identificeer de schimmelkolonies die karakteristieke groen geslingerde groei hebben.In een bioveiligheidskast voor organismen van niveau twee, oogst conidia of mycelia door het oppervlak eenmaal te schrapen met behulp van gesteriliseerde houten vliegtuigpuntapplicatorsticks of een inentingslus en breng deze over naar het midden van een moutextract-agarplaat door op de agar te strijken voor enkele kolonies. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende twee dagen. Met behulp van een steriele applicatiestick of inentingslus, subcultuur een enkele kolonie gegenereerd op moutextract agar door de kolonie eenmaal te strepen.Verspreid de geoogste sporen in het midden van de plaat. Bereid een steriele 30% glyceroloplossing om de Aspergillus fumigatus-sporen of mycelia te oogsten voor kweekopslag. Na de twee dagen van incubatie van de agarplaten bij 37 graden Celsius, aspirateer een milliliter van de 30% glyceroloplossing met behulp van een pipet en verspreid deze op de Aspergillus fumigatus-kolonie.Voor fenotypische identificatie van Aspergillus fumigatus-stammen, aspirateer 10 microliter van de myceliale en sporenvoorraden om 990 microliter water toe te voegen. Vortex deze verdunde sporensuspensie en dispense 10 microliter van de suspensie op een standaard microscoopglaasje. Bekijk vervolgens met behulp van een samengestelde microscoop bij 400X-vergroting de suspensie en lokaliseer conidioforen.Vergelijk de waargenomen conidiofore morfologie met Aspergillus fumigatus conidiofore morfologie. Om de juiste fragmentgrootte voor elk van de negen microsatellietloci te bepalen, gebruikt u software die in staat is tot fragmentanalyse. Haal de ruwe gegevens op die zijn verkregen uit capillaire elektroforese en scoor de fragmentgroottes op basis van de grootste piek met behulp van de gefragmenteerde analysesoftware.Converteer vervolgens de fragmentgroottes naar herhalingsgetallen voor elk van de negen lage gebruiksgroottes van de herhalingsgetallen van de referentiestam Af293. Van de 3.826 bodemmonsters verzameld op 53 locaties in negen landen werden 1.473 giststammen geïsoleerd. De beste incubatietemperatuur voor elk land werd bepaald op basis van de gemiddelde jaarlijkse temperatuur.In de zeldzaamheidsanalyse voor elk land werd de Shannon-diversiteitsindex gebruikt als een maat voor de diversiteit van bodemgisten. De resulterende zeldzaamheidscurven benaderden de verzadigingsasymptoot, wat aangeeft dat extra bemonstering waarschijnlijk niet meer gistdiversiteit had opgeleverd. Myceliale groei op platen vormde de groen geslingerde morfologie die typerend is voor Aspergillus fumigatus.Andere thermotolerante schimmelsoorten kunnen aanwezig zijn in hetzelfde bodemmonster en de Aspergillus fumigatus op dezelfde plaat of alleen laten groeien. Aspergillus fumigatus conidiofore structuur bekeken en geïdentificeerd met behulp van lichtmicroscopie onthulde dat conidioforen een bal op de stok morfologie en conidioforen uniseriate zijn, waarbij de phialides bevestigd aan de conidia ketens direct aan de bolvormige blaasjes zijn bevestigd. Een chromatogram gegenereerd biseriaat onthulde de drie kanalen die de fragmentlengtes van Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinucleotide en tetranucleotide korte tandem herhalingen loci visualiseren.Een netwerk van hoge kwaliteit met minimale spanning kan worden gegenereerd met behulp van het R-script plot_poppr_msn of imsn. Een discriminerende analyse van principiële componenten is een andere methode om de genetische relaties tussen stammen te visualiseren. Het toevoegen van benomyl en chlooramfenicol aan groeimedia voorkomt respectievelijk schimmel- en bacteriegroei en bevordert gistselectie.Chlooramfenicol vermindert ook de fermentatie in media, waardoor de gasopbouw in broedbuizen wordt verlaagd. Het uitvoeren van metagenomics op bodemmonsters zal aanvullende informatie opleveren over culturele diversiteit. Gevoelige tests van A.fumigatus-stammen zullen de aanwezigheid van resistentiegenotypes identificeren.Dit protocol kan worden toegepast op andere gist- en schimmelsystemen met weinig modificatie. Het vergemakkelijkte het onderzoek naar culturele bodemgistdiversiteit en zijn voorspellers op wereldwijde schaal.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolatie van Genomic DNA van muis Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolatie van Kleine Noncoding RNA&#39;s uit humaan serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Handhaving van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevolking Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolatie en karakterisering van microvesicles uit perifeer bloed

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...