Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Cette recherche a été financée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no. ALLRP 570780-2021) et l’Université McMaster.

REMARQUE: Toute étape utilisant des échantillons de sol internationaux et / ou des spores et des mycéliums d’A. fumigatus nécessite de travailler dans une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau 2 (BSCII).
1. Isolement de la levure du sol
<ol><li>Préparation de solutions antibactériennes et antifongiques<ol>
<li>Suspendre la poudre de chloramphénicol dans de l’éthanol à 70 % pour préparer une solution mère à 50 g/L. Stériliser par fil...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Le protocole développé pour isoler les levures et A. fumigatus du sol est une méthode rapide et efficace pour le traitement du sol à haut débit et l’isolement fongique. Le protocole ne nécessite qu’une petite quantité de sol (0,1-0,2 g) par échantillon, ce qui permet d’échantillonner plus de sites avec un effort similaire. Le délai d’exécution rapide garantit que les résultats peuvent être obtenus dans un court laps de temps et laisse le temps de dépanner et de répéter les expériences si...

Les champignons dans les écosystèmes du sol jouent un rôle essentiel dans la décomposition de la matière organique, le cycle des nutriments et la fertilisation du sol1. Les approches indépendantes de la culture (c.-à-d. séquençage à haut débit) et dépendantes de la culture sont largement utilisées dans l’étude des champignons du sol 2,3. Bien que la grande quantité de données générées par le séquençage de métacodes à barres à haut débit soit utile pour élucider les modèles à grande échelle de la structure et de la diversité des communautés, l’approche dépendante de la culture peut fournir des informations très complémentaires sur les structures taxonomiques et fonctionnelles des communautés fongiques, ainsi que des profils plus spécifiques d’organismes individuels grâce à la diversité en aval et aux analyses fonctionnelles en raison de la disponibilité de cultures fongiques pures.
Bien qu’elles dépassent rarement des milliers de cellules par gramme de sol, les levures, définies au sens large comme des champignons unicellulaires, sont des décomposeurs essentiels et des sources de nourriture pour les autres habitants du sol 4,5. En fait, les levures peuvent être les champignons du sol prédominants dans les biosphères froides telles que l’Antarctique continental 6,7. Le sol est également un réservoir primaire de levures médicalement pertinentes qui causent de graves infections opportunistes chez les humains et d’autres mammifères8. Malgré les similitudes morphologiques, les espèces de levures sont phylogénétiquement diverses et se trouvent parmi les champignons filamenteux dans deux phylums majeurs, Ascomycota et Basidiomycota, dans le règne fongique9. Les levures n’ont pas de signature ADN déterminante au niveau du gène de codage à barres fongique, la région interne de l’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire10, ce qui les rend impossibles à distinguer des autres champignons dans les études métagénomiques et nécessite donc l’utilisation de méthodes dépendantes de la culture pour isoler les espèces de levure.
Le protocole ci-dessous a été mis en œuvre pour caractériser les communautés de levures du sol de neuf pays et identifier les tendances et les modèles mondiaux de la diversité des levures du sol 9,11,12. Les approches métagénomiques sont d’une utilité limitée pour étudier des groupes ciblés d’organismes tels que les levures 2,3. En raison de leur diversité phylogénétique, les levures ne peuvent pas être distinguées des autres champignons sur la base de la seule séquence d’ADN. Ainsi, l’étude des populations de levures nécessite l’utilisation continue de l’isolement dépendant de la culture. Cependant, la culture prend souvent beaucoup plus de temps et nécessite plus de personnel pour effectuer les expériences. Par conséquent, le protocole a été optimisé et rationalisé pour un traitement plus rapide avec un personnel limité. Le principal avantage de la culture est que les espèces de levures identifiées sont des levures vivantes et non mortes, et sont donc plus susceptibles d’être de vrais habitants du sol plutôt que des cellules transitoires présentes dans les sols. On estime qu’environ 40 % de l’ADN fongique dans le sol est soit constitué de contaminants provenant d’autres environnements, soit extracellulaires, soit provenant de cellules qui ne sont plus intactes, ce qui entraîne des approches de séquençage à haut débit pour surestimer la richesse fongique jusqu’à 55 %13. L’isolement dépendant de la culture peut facilement confirmer l’identité des espèces de levures avec l’avantage supplémentaire de garantir une culture pure à utiliser dans les analyses en aval. En effet, des cultures pures de 44 nouvelles espèces de levures putatives ont été identifiées à l’aide de ce protocole d’isolement du sol qui a permis l’utilisation d’une gamme de méthodes pour étudier en détail leurs propriétés taxonomiques et fonctionnelles14.
Le protocole ci-dessous peut également être utilisé pour isoler les moisissures présentes dans le sol, telles que A. fumigatus. Aspergillus fumigatus est une moisissure thermophile et saprophyte avec une large distribution mondiale dans le sol15. Il a été isolé dans de nombreux environnements cliniques et non cliniques. L’échantillonnage non clinique comprend généralement l’air, les débris organiques (compost, sciure de bois, déchets de bulbes de tulipes) et le sol (sols agricoles, de jardin et naturels)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus est un agent pathogène opportuniste humain causant une gamme d’infections collectivement appelées aspergillose, affectant plus de 8 millions de personnes dans le monde16,20. Environ 300 000 personnes dans le monde souffrent d’aspergillose invasive, qui est la forme la plus grave d’aspergillose16. Selon des facteurs tels que la population de patients, le site de l’infection et l’efficacité du traitement antifongique, le taux de mortalité peut atteindre 90%. Au cours des dernières décennies, la résistance aux thérapies antifongiques a augmenté, nécessitant des efforts de surveillance mondiale dans les populations cliniques et environnementales pour suivre ces génotypes de résistance 21,22,23. Compte tenu de sa capacité à croître à des températures supérieures à 50 °C, cette température peut être exploitée pour sélectionner des isolats d’A. fumigatus dans le sol en utilisant des méthodes dépendantes de la culture. Les isolats d’Aspergillus fumigatus sont généralement génotypés à neuf loci à répétition courte en tandem (STR) hautement polymorphes, dont le pouvoir discriminatoire est élevé entre les souches24. Ces génotypes STR peuvent être comparés à d’autres populations précédemment étudiées pour suivre la propagation des génotypes d’A. fumigatus, y compris les gènes de résistance aux médicaments, dans le monde entier.
Nous décrivons ci-dessous un protocole pour l’isolement rapide des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol en fonction de la culture. Selon la quantité de sol obtenue par échantillon, les échantillons de sol peuvent être partagés entre les deux protocoles. Par rapport à des méthodes similaires qui isolent la levure et A. fumigatus du sol, ce protocole utilise 10 fois moins de sol par isolat obtenu. Les études visant à isoler A. fumigatus du sol nécessitent entre 1 et 2 g de sol par isolat, alors que ce protocole ne nécessite que 0,1 à 0,2 g de sol 18,19,25. Ce protocole utilise des plastiques et des conteneurs plus petits qui facilitent sa conception à haut débit. Par conséquent, un plus grand nombre d’échantillons peuvent être traités en utilisant moins d’espace pour les équipements tels que les incubateurs et les tambours à rouleaux. Les échantillons de sol peuvent être entièrement traités pour obtenir des isolats en aussi peu que 7 jours. Ce protocole a été optimisé pour permettre le traitement de jusqu’à 150 à 200 échantillons par jour et par personne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Le sol est l’hôte d’une quantité incroyable de vie microbienne, chaque gramme contenant jusqu’à des milliards de cellules bactériennes, archéales et fongiques. Les champignons multicellulaires tels que les moisissures et les champignons unicellulaires, définis au sens large comme des levures, jouent un rôle essentiel dans les écosystèmes du sol en tant que décomposeurs de matières organiques et en tant que sources de nourriture pour les autres habitants du sol. La diversité des espèces fongiques dans le sol dépend d’une multitude de facteurs climatiques tels que les précipitations et la température, ainsi que des propriétés du sol, y compris la matière organique, le pH et l’humidité. Le manque d’échantillonnage environnemental adéquat, en particulier dans les régions d’Asie, d’Afrique, d’Amérique du Sud et d’Amérique centrale, entrave la caractérisation des communautés fongiques du sol et la découverte de nouvelles espèces. 
Nous avons caractérisé les communautés fongiques du sol dans neuf pays sur six continents en utilisant environ 4 000 échantillons de sol et un protocole développé en laboratoire pour l’isolement des levures et des moisissures. Ce protocole commence par un enrichissement sélectif séparé pour les levures et la moisissure médicalement pertinente Aspergillus fumigatus, dans un milieu liquide tout en inhibant la croissance bactérienne. Les colonies résultantes sont ensuite transférées dans des milieux solides et traitées pour obtenir des cultures pures, suivies d’une caractérisation génétique en aval. L’identité des espèces de levures est établie par le séquençage de leur région interne d’espaceur transcrit (ITS) du groupe de gènes de l’ARN ribosomique nucléaire, tandis que la structure de la population mondiale d’A. fumigatus est explorée par l’analyse de marqueurs microsatellites. 
Le protocole a été appliqué avec succès pour isoler et caractériser les populations de levure du sol et d’A. fumigatus au Cameroun, au Canada, en Chine, au Costa Rica, en Islande, au Pérou, en Nouvelle-Zélande et en Arabie saoudite. Ces résultats ont révélé des informations indispensables sur les modèles mondiaux de diversité des levures du sol, ainsi que sur la structure de la population mondiale et les profils de résistance antifongique d’A. fumigatus. Cet article présente la méthode d’isolement des levures et d’A. fumigatus à partir d’échantillons de sol internationaux.

Isolement des levures du sol Le protocole d’isolement des levures ci-dessus a été mis en œuvre pour cultiver des levures à partir d’échantillons de sol provenant de 53 sites dans neuf pays 9,12. Au total, 1 473 souches de levure ont été isolées à partir de 3 826 échantillons de sol. Compte tenu des conditions climatiques différentes des neuf pays d’origine, la meilleure température d’incubation pour chaque pays a été dét...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Ce protocole est une méthode efficace et rapide de culture des levures et de la moisissure Aspergillus fumigatus à partir de grands ensembles d’échantillons de sol en aussi peu que 7 jours. Les méthodes peuvent être facilement modifiées pour s’adapter à une gamme de milieux d’incubation et de températures au besoin pour les expériences.

Isolement des levures et des moisissures cultivables des sols pour étudier la structure de la population fongique

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Notre protocole étudie la diversité des levures et des moisissures dans le sol à l’aide d’échantillons de sol provenant de différentes régions climatiques. Cela fournit des informations sur la diversité des levures environnementales et aide à suivre les espèces pathogènes. Le protocole offre une méthode rentable et rapide de récolte des levures et des moisissures du sol.Les échantillons de sol peuvent être entièrement traités pour obtenir des isolats en aussi peu que sept jours. Une configuration expérimentale bien organisée, telle que l’étiquetage des tubes de culture et la préparation des milieux un jour à l’avance, est la clé pour éviter de se sentir dépassé pendant l’expérience. Commencez par préparer un ensemble de tubes de culture stériles de 13 millilitres.En les étiquetant avec l’ID de l’échantillon de sol, utilisez ensuite une pipette sérologique pour ajouter cinq millilitres de bouillon d’extrait de levure-peptone-dextrose complété par du chloramphénicol et du bénomyl dans chaque tube. À l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, transférer environ 0,1 gramme de sol dans le tube de culture approprié à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de plan en bois. Boucher le tube solidement jusqu’au premier arrêt, empêchant les déversements tout en permettant l’échange d’air pendant l’incubation.Ensuite, incubez les tubes de culture dans un tambour à rouleaux pendant 24 heures à une température jugée optimale pour maximiser la croissance des levures. Ensuite, étiqueter les plaques de gélose à base de chloramphénicol et d’extrait de levure supplémenté de bénomyle peptone-dextrose avec l’ID de l’échantillon de sol avant de transférer le surnageant dans le milieu solide. Retirez les tubes de culture du tambour à rouleaux.Ensuite, à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, vortexz brièvement le tube pour aspirer les particules de sol et les cellules qui peuvent s’être déposées au fond en suspension. Ensuite, transférez 100 microlitres du surnageant sur une plaque à l’aide d’une micropipette. Utilisez un épandeur de cellules réutilisable stérile pour étaler le liquide complètement et uniformément sur la surface de la gélose.Après avoir prévu un temps d’incubation suffisant de deux à trois jours, inspectez les plaques pour détecter toute croissance de levure à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour détecter les organismes de niveau deux. Recherchez des levures crémeuses, rondes et mates qui peuvent être facilement distinguées des colonies bactériennes et de moisissures. Sélectionnez une colonie ressemblant à de la levure dans chaque assiette à l’aide de bâtonnets d’applicateur stériles en bois à pointe unie.Transférer chaque colonie sélectionnée sur un extrait de levure fraîche des plaques de gélose peptone-dextro complétées par du chloramphénicol et du bénomyl et des stries pour des colonies individuelles. Effectuez trois stries distinctes et utilisez un nouveau bâton applicateur pour chaque traînée. Ensuite, utilisez des cellules fraîches développées sur une plaque pour effectuer une réaction en chaîne de la polymérase de colonie.Utilisez des aéroteurs transcrits internes ITS1 et ITS4 pour amplifier le gène codant à barres fongiques. Comparez la séquence d’espacement interne transcrite obtenue des souches de levure, deux séquences déposées dans des bases de données publiques, telles que le National Center for Biotechnology Information GenBank et UNITE pour établir l’identité de l’espèce. Ajouter la terre dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de bouillon de dextrose Sabouraud et incuber à 50 degrés Celsius pendant deux à quatre jours.Pour transférer le mycélium du bouillon inoculé du sol sur des plaques de gélose à l’extrait de malt, identifiez d’abord les inoculums du sol qui ont une croissance mycélienne visible, ajoutez le bouillon de dextrose Sabouraud à la limite de l’air. Ensuite, utilisez des bâtonnets applicateurs en bois stérilisés pour transférer le mycélium au centre d’une plaque de gélose à extrait de malt et incuber ces plaques d’agar à l’extrait de malt à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Pour la sélection du mycélium, avec les propriétés morphologiques d’Aspergillus fumigatus, identifiez les colonies de moisissures qui ont une croissance caractéristique de type balancement vert.À l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour les organismes de niveau deux, récoltez les conidies ou les mycéliums en grattant la surface une fois à l’aide de bâtons applicateurs de pointe de plan en bois stérilisés ou d’une boucle d’inoculation et transférez-la au centre d’une plaque de gélose extrait de malt en striant sur la gélose pour les colonies individuelles. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux jours. À l’aide d’un bâton d’application stérile ou d’une boucle d’inoculation, sous-cultiver une seule colonie générée sur une gélose à l’extrait de malt en striant la colonie une fois.Étalez les spores récoltées au centre de la plaque. Préparez une solution stérile de glycérol à 30% pour récolter les spores d’Aspergillus fumigatus ou le mycélium pour le stockage de la culture. Après les deux jours d’incubation des plaques de gélose à 37 degrés Celsius, aspirer un millilitre de la solution de glycérol à 30% à l’aide d’une pipette et la disperser sur la colonie d’Aspergillus fumigatus.Pour l’identification phénotypique des souches d’Aspergillus fumigatus, aspirer 10 microlitres des stocks de mycélium et de spores pour ajouter 990 microlitres d’eau. Vortex cette suspension de spores diluées et distribuer 10 microlitres de la suspension sur une lame de microscope standard. Ensuite, à l’aide d’un microscope composé à un grossissement de 400X, visualisez la suspension et localisez les conidiophores.Comparez la morphologie des conidiophores observée avec la morphologie des conidiophores d’Aspergillus fumigatus. Pour déterminer la taille correcte des fragments pour chacun des neuf loci de micro-satellites, utilisez un logiciel capable d’analyser les fragments. Récupérez les données brutes obtenues par électrophorèse capillaire et notez la taille des fragments en fonction du pic le plus important à l’aide du logiciel d’analyse fragmentée.Ensuite, convertissez les tailles de fragment en nombres répétés pour chacun des neuf faibles utilisez les tailles de fragment des nombres répétés de la souche de référence Af293. Sur 3 826 échantillons de sol prélevés sur 53 sites dans neuf pays, 1 473 souches de levure ont été isolées. La meilleure température d’incubation pour chaque pays a été déterminée en fonction de sa température annuelle moyenne.Dans l’analyse de raréfaction pour chaque pays, l’indice de diversité de Shannon a été utilisé comme mesure de la diversité des levures du sol. Les courbes de raréfaction résultantes se sont approchées de l’asymptote de saturation, ce qui indique qu’un échantillonnage supplémentaire n’était pas susceptible d’avoir donné plus de diversité de levure. La croissance mycélienne sur les plaques a formé la morphologie verte oscillante typique d’Aspergillus fumigatus.D’autres espèces de champignons thermotolérants pourraient être présentes dans le même échantillon de sol et cultiver l’Aspergillus fumigatus sur la même plaque ou par elle-même. La structure conidiophore d’Aspergillus fumigatus vue et identifiée à l’aide de la microscopie optique a révélé que les conidiophores ont une boule sur la morphologie du bâton et que les conidiophores sont unisés, où les phialides attachés aux chaînes de conidies sont attachés directement à la vésicule sphérique. Un bisériement généré par chromatogramme a révélé les trois canaux visualisant les longueurs de fragments d’Aspergillus fumigatus dinucléotide, de trinucléotide et de tétranucléotide courts loci de répétition en tandem.Un réseau couvrant au minimum de haute qualité peut être généré à l’aide du script R plot_poppr_msn ou imsn. Une analyse discriminatoire des composants principaux est une autre méthode pour visualiser les relations génétiques entre les souches. L’ajout de bénomyl et de chloramphénicol aux milieux de croissance empêche la croissance des moisissures et des bactéries, respectivement, et favorise la sélection des levures.Le chloramphénicol réduit également la fermentation dans les milieux, réduisant l’accumulation de gaz dans les tubes d’incubation. La réalisation de métagénomiques sur des échantillons de sol fournira des informations supplémentaires sur la diversité culturelle. Des tests sensibles sur les souches d’A.fumigatus permettront d’identifier la présence de génotypes de résistance.Ce protocole peut être appliqué à d’autres systèmes de levure et de moisissure avec peu de modification. Il a facilité l’étude de la diversité des levures de sol et de ses prédicteurs à l’échelle mondiale.

Research

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