Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) und McMaster University.

HINWEIS: Alle Schritte, bei denen internationale Bodenproben und/oder A. fumigatus-Sporen und Myzelien verwendet werden, müssen in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe 2 (BSCII) gearbeitet werden.
1. Isolierung von Hefe aus dem Boden
<ol><li>Herstellung von antibakteriellen und antimykotischen Lösungen<ol>
<li>Suspendieren Sie Chloramphenicolpulver in 70% Ethanol, um eine 50 g / L Stammlösung herzustellen. Durch Spritzenfiltration sterilisieren un...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Das für die Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus dem Boden entwickelte Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Hochdurchsatz-Bodenbearbeitung und Pilzisolation. Das Protokoll erfordert nur eine geringe Menge Boden (0,1-0,2 g) pro Probe, so dass mehr Standorte mit ähnlichem Aufwand beprobt werden können. Die schnelle Durchlaufzeit stellt sicher, dass die Ergebnisse innerhalb eines kurzen Zeitrahmens erzielt werden können, und lässt Zeit für die Fehlerbehebung und bei Bedarf wiederholte E...

Pilze in Bodenökosystemen spielen eine wesentliche Rolle bei der Zersetzung organischer Stoffe, dem Nährstoffkreislauf und der Bodendüngung1. Sowohl kulturunabhängige (d.h. Hochdurchsatz-Sequenzierung) als auch kulturabhängige Ansätze werden häufig bei der Untersuchung von Bodenpilzen 2,3 eingesetzt. Während die große Datenmenge, die durch die Hochdurchsatz-Metabarcode-Sequenzierung generiert wird, nützlich ist, um breit angelegte Muster in der Gemeinschaftsstruktur und -diversität aufzuklären, kann der kulturabhängige Ansatz sehr komplementäre Informationen über die taxonomischen und funktionellen Strukturen von Pilzgemeinschaften sowie spezifischere Profile einzelner Organismen durch nachgelagerte Diversitäts- und Funktionsanalysen aufgrund der Verfügbarkeit reiner Pilzkulturen liefern.
Obwohl sie selten Tausende von Zellen pro Gramm Boden überschreiten, sind Hefen, die allgemein als einzellige Pilze definiert werden, essentielle Zersetzer und Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner 4,5. Tatsächlich können Hefen die vorherrschenden Bodenpilze in kalten Biosphären wie der kontinentalen Antarktissein 6,7. Der Boden ist auch ein primäres Reservoir für medizinisch relevante Hefen, die beim Menschen und anderen Säugetieren schwere opportunistische Infektionen verursachen8. Trotz morphologischer Ähnlichkeiten sind Hefearten phylogenetisch vielfältig und kommen unter filamentösen Pilzen in zwei Hauptstämmen, Ascomycota und Basidiomycota, innerhalb des Pilzreichs9 vor. Hefen fehlt eine definierende DNA-Signatur am pilzlichen Barcoding-Gen, der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters10, was sie in metagenomischen Untersuchungen nicht von anderen Pilzen unterscheidbar macht und daher den Einsatz kulturabhängiger Methoden zur Isolierung von Hefearten erfordert.
Das folgende Protokoll wurde implementiert, um Bodenhefegemeinschaften von neun Ländern zu charakterisieren und globale Trends und Muster in der Bodenhefediversitätzu identifizieren 9,11,12. Metagenomik-Ansätze sind von begrenztem Nutzen bei der Untersuchung von Zielgruppen von Organismen wie Hefen 2,3. Aufgrund ihrer phylogenetischen Vielfalt können Hefen allein aufgrund der DNA-Sequenz nicht von anderen Pilzen unterschieden werden. Daher erfordert die Untersuchung von Hefepopulationen die fortgesetzte Verwendung einer kulturabhängigen Isolation. Die Kultivierung ist jedoch oft deutlich zeitaufwendiger und erfordert mehr Personal, um die Experimente durchzuführen. Daher wurde das Protokoll für eine schnellere Verarbeitung mit begrenztem Personal optimiert und optimiert. Der Hauptvorteil der Kultivierung besteht darin, dass die identifizierten Hefearten lebende Hefen und keine toten sind und daher eher echte Bodenbewohner als vorübergehende Zellen in den Böden sind. Es wurde geschätzt, dass etwa 40% der Pilz-DNA im Boden entweder Verunreinigungen aus anderen Umgebungen, extrazellulär sind oder aus Zellen stammen, die nicht mehr intakt sind, was dazu führt, dass Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze den Pilzreichtum um bis zu 55% überschätzen13. Kulturabhängige Isolierung kann die Identität von Hefearten leicht bestätigen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass die Reinkultur für die Verwendung in nachgelagerten Analysen gesichert wird. Tatsächlich wurden Reinkulturen von 44 mutmaßlichen neuen Hefearten unter Verwendung dieses Bodenisolationsprotokolls identifiziert, das die Verwendung einer Reihe von Methoden zur detaillierten Untersuchung ihrer taxonomischen und funktionellen Eigenschaftenermöglichte 14.
Das folgende Protokoll kann auch verwendet werden, um im Boden vorhandene Formen wie A. fumigatus zu isolieren. Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler und saprophytischer Schimmelpilz mit einer weiten, globalen Verbreitung im Boden15. Es wurde aus zahlreichen klinischen und nicht-klinischen Umgebungen isoliert. Nicht-klinische Probenahmen umfassen üblicherweise Luft, organische Ablagerungen (Kompost, Sägestaub, Tulpenzwiebelabfälle) und Boden (landwirtschaftliche, gartenbezogene und natürliche Böden) 16,17,18,19. Aspergillus fumigatus ist ein humaner opportunistischer Erreger, der eine Reihe von Infektionen verursacht, die zusammen als Aspergillose bezeichnet werden und über 8 Millionen Menschen weltweitbetreffen 16,20. Etwa 300.000 Menschen auf der ganzen Welt leiden an invasiver Aspergillose, der schwersten Form der Aspergillose16. Abhängig von Faktoren wie der Patientenpopulation, dem Infektionsort und der Wirksamkeit der antimykotischen Therapie kann die Sterblichkeitsrate bis zu 90% betragen. In den letzten Jahrzehnten hat die Resistenz gegen antimykotische Therapien zugenommen, was globale Überwachungsbemühungen sowohl in klinischen als auch in Umweltpopulationen erfordert, um diese Resistenzgenotypen21,22,23 zu verfolgen. Aufgrund seiner Fähigkeit, bei Temperaturen von über 50 ° C zu wachsen, kann diese Temperatur genutzt werden, um A. fumigatus-Isolate aus dem Boden mit kulturabhängigen Methoden auszuwählen. Aspergillus fumigatus-Isolate werden üblicherweise an neun hochpolymorphen STR-Loci (Short Tandem Repeat) genotypisiert, von denen gezeigt wird, dass sie eine hohe Unterscheidungskraft zwischen den Stämmenaufweisen 24. Diese STR-Genotypen können mit anderen zuvor untersuchten Populationen verglichen werden, um die Ausbreitung von A. fumigatus-Genotypen, einschließlich Arzneimittelresistenzgenen, auf der ganzen Welt zu verfolgen.
Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Isolation von Hefen und A. fumigatus aus Bodenproben in kulturabhängiger Weise. Abhängig von der Menge an Boden, die pro Probe erhalten wird, können die Bodenproben zwischen den beiden Protokollen geteilt werden. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden, die Hefe und A. fumigatus aus dem Boden isolieren, verwendet dieses Protokoll 10x weniger Boden pro erhaltenem Isolat. Studien, die versuchen, A. fumigatus aus dem Boden zu isolieren, erfordern zwischen 1 und 2 g Boden pro Isolat, während dieses Protokoll nur 0,1-0,2 g Boden18,19,25 erfordert. Dieses Protokoll verwendet kleinere Kunststoffe und Behälter, die das Hochdurchsatzdesign erleichtern. Daher kann eine größere Anzahl von Proben mit weniger Platz für Geräte wie Inkubatoren und Walzentrommeln verarbeitet werden. Bodenproben können in nur 7 Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Verarbeitung von bis zu 150-200 Proben pro Tag und Person zu ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Der Boden beherbergt eine unglaubliche Menge an mikrobiellem Leben, wobei jedes Gramm bis zu Milliarden von bakteriellen, archaealen und Pilzzellen enthält. Mehrzellige Pilze wie Schimmelpilze und einzellige Pilze, die allgemein als Hefen definiert werden, spielen in Bodenökosystemen eine wesentliche Rolle als Zersetzer von organischem Material und als Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner. Die Vielfalt der Pilzarten im Boden hängt von einer Vielzahl von klimatischen Faktoren wie Niederschlag und Temperatur sowie von Bodeneigenschaften wie organischer Substanz, pH-Wert und Feuchtigkeit ab. Das Fehlen angemessener Umweltproben, insbesondere in Regionen Asiens, Afrikas, Südamerikas und Mittelamerikas, behindert die Charakterisierung von Bodenpilzgemeinschaften und die Entdeckung neuartiger Arten. 
Wir charakterisierten Bodenpilzgemeinschaften in neun Ländern auf sechs Kontinenten anhand von ~ 4.000 Bodenproben und einem im Labor entwickelten Protokoll zur Isolierung von Hefen und Schimmelpilzen. Dieses Protokoll beginnt mit einer separaten selektiven Anreicherung für Hefen und den medizinisch relevanten Schimmelpilz Aspergillus fumigatus in flüssigen Medien unter Hemmung des Bakterienwachstums. Resultierende Kolonien werden dann in feste Medien übertragen und weiterverarbeitet, um Reinkulturen zu erhalten, gefolgt von einer nachgelagerten genetischen Charakterisierung. Die Identität der Hefespezies wird durch Sequenzierung ihrer internen transkribierten Spacer (ITS) -Region des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters festgestellt, während die globale Populationsstruktur von A. fumigatus mittels Mikrosatelliten-Markeranalyse untersucht wird. 
Das Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um Bodenhefe- und A. fumigatus-Populationen in Kamerun, Kanada, China, Costa Rica, Island, Peru, Neuseeland und Saudi-Arabien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Ergebnisse zeigten dringend benötigte Einblicke in globale Muster in der Bodenhefediversität sowie in die globale Populationsstruktur und antimykotische Resistenzprofile von A. fumigatus. In diesem Beitrag wird die Methode zur Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus internationalen Bodenproben vorgestellt.

Hefe-Isolierung vom Boden Das obige Hefe-Isolationsprotokoll wurde umgesetzt, um Hefen aus Bodenproben von 53 Standorten in neun Ländern zu kultivieren 9,12. Insgesamt wurden 1.473 Hefestämme aus 3.826 Bodenproben isoliert. Angesichts der unterschiedlichen klimatischen Bedingungen der neun Ursprungsländer wurde die beste Inkubationstemperatur für jedes Land auf der Grundlage seiner mittleren Jahrestemperatur ermittelt (Tabelle 1</s...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Unser Protokoll untersucht die Hefe- und Schimmelpilzvielfalt im Boden anhand von Bodenproben aus verschiedenen Klimaregionen. Dies gibt Einblicke in die Vielfalt der Umwelthefen und hilft, pathogene Arten zu verfolgen. Das Protokoll bietet eine kostengünstige und schnelle Methode zur Ernte von Hefen und Schimmel aus dem Boden.Bodenproben können in nur sieben Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Ein gut organisierter Versuchsaufbau, wie das Beschriften von Kulturröhrchen und das Vorbereiten von Medien einen Tag im Voraus, ist der Schlüssel, um sich während des Experiments nicht überfordert zu fühlen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Satzes steriler 13-Milliliter-Kulturröhrchen.Indem Sie sie mit Bodenproben-ID kennzeichnen, verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um fünf Milliliter Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Brühe hinzuzufügen, die mit Chloramphenicol und Benomyl in jedes Röhrchen ergänzt werden. Übertragen Sie in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei etwa 0,1 Gramm Erde mit einem sterilen hölzernen Planspitzenapplikator in das entsprechende Kulturröhrchen. Verschließen Sie das Rohr sicher bis zum ersten Anschlag, um ein Verschütten zu verhindern, während der Luftaustausch während der Inkubation ermöglicht wird.Als nächstes inkubieren Sie die Kulturröhrchen in einer Walzentrommel für 24 Stunden bei einer Temperatur, die als optimal für die Maximierung des Hefewachstums angesehen wird. Beschriften Sie dann die mit Chloramphenicol und Benomyl versetzten Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Agarplatten mit der Bodenproben-ID, bevor der Überstand auf das feste Medium übertragen wird. Entfernen Sie die Kulturrohre von der Walzentrommel.Dann in einer Biosicherheitskabine für Organismen der zweiten Stufe das Rohr kurz umdrehen, um Bodenpartikel und Zellen, die sich möglicherweise unten abgesetzt haben, wieder in die Suspension zu ziehen. Als nächstes übertragen Sie 100 Mikroliter des Überstands mit einer Mikropipette auf eine Platte. Verwenden Sie einen sterilen wiederverwendbaren Zellstreuer, um die Flüssigkeit gründlich und gleichmäßig über die Agaroberfläche zu verteilen.Nachdem Sie eine ausreichende Inkubationszeit von zwei bis drei Tagen eingeplant haben, untersuchen Sie die Platten auf Hefewachstum in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei. Suchen Sie nach cremigen, runden, matten Hefen, die leicht von Bakterien- und Schimmelpilzkolonien unterschieden werden können. Wählen Sie eine hefeartige Kolonie aus jeder Platte mit sterilen einfachen Applikatorstäben aus Holz.Übertragen Sie jede ausgewählte Kolonie auf einen frischen Hefeextrakt Pepton-Dextro-Agar-Platten, ergänzt mit Chloramphenicol und Benomyl und Streifen für einzelne Kolonien. Führen Sie drei separate Streifen durch und verwenden Sie für jeden Streifen einen neuen Applikatorstick. Als nächstes verwenden Sie frische Zellen, die auf einer Platte entwickelt wurden, um eine Koloniepolymerase-Kettenreaktion durchzuführen.Verwenden Sie interne transkribierte Abstandshalter ITS1 und ITS4 Primer, um das Pilz-Bar-Coding-Gen zu verstärken. Vergleichen Sie die erhaltene interne transkribierte Abstandshaltersequenz der Hefestämme, zwei Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie dem National Center for Biotechnology Information GenBank und UNITE hinterlegt sind, um die Artenidentität festzustellen. Fügen Sie Erde zu 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die einen Milliliter Sabouraud-Dextrosebrühe enthalten, und inkubieren Sie bei 50 Grad Celsius für zwei bis vier Tage.Um die Myzelien aus der im Boden geimpften Brühe auf Malzextrakt-Agarplatten zu übertragen, identifizieren Sie zunächst die Bodeninokula, die sichtbares Myzelwachstum aufweisen, und fügen Sie die Sabouraud-Dextrosebrühe zur Luftgrenze hinzu. Verwenden Sie dann sterilisierte hölzerne einfache Spitzenapplikatorstäbe, um die Myzelie in die Mitte einer Malzextrakt-Agarplatte zu übertragen und diese Malzextrakt-Agarplatte drei Tage lang auf 37 Grad Celsius zu inkubieren. Identifizieren Sie für die Auswahl von Myzelien mit morphologischen Eigenschaften von Aspergillus fumigatus die Schimmelpilzkolonien, die ein charakteristisches grünes, schwankendes Wachstum aufweisen.In einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe zwei können Sie Konidien oder Myzelien ernten, indem Sie die Oberfläche einmal mit sterilisierten Holzplattierspitzen-Applikatorstäben oder einer Impfschleife abkratzen und in die Mitte einer Malzextrakt-Agarplatte überführen, indem Sie sie für einzelne Kolonien auf das Agar streichen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für zwei Tage. Subkulturieren Sie mit einem sterilen Applikationsstab oder einer Impfschleife eine einzelne Kolonie, die auf Malzextrakt-Agar erzeugt wird, indem Sie die Kolonie einmal streifen.Verteilen Sie die geernteten Sporen in der Mitte des Tellers. Bereiten Sie eine sterile 30%ige Glycerinlösung vor, um die Aspergillus fumigatus-Sporen oder Myzelien zur Kulturlagerung zu ernten. Nach den zwei Tagen der Inkubation der Agarplatten bei 37 Grad Celsius einen Milliliter der 30%igen Glycerinlösung mit einer Pipette abraten und auf die Aspergillus fumigatus-Kolonie verteilen.Zur phänotypischen Identifizierung von Aspergillus fumigatus-Stämmen aspirieren Sie 10 Mikroliter der Myzel- und Sporenvorräte, um 990 Mikroliter Wasser hinzuzufügen. Wirbeln Sie diese verdünnte Sporensuspension ein und geben Sie 10 Mikroliter der Suspension auf einen Standard-Objektträger ab. Sehen Sie sich dann mit einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung die Suspension an und lokalisieren Sie Konidiophoren.Vergleichen Sie die beobachtete Konidiophoremorphologie mit der Aspergillus fumigatus conidiophore Morphologie. Um die richtige Fragmentgröße für jeden der neun Mikrosatelliten-Loci zu bestimmen, verwenden Sie eine Software, die zur Fragmentanalyse fähig ist. Rufen Sie die Rohdaten der Kapillarelektrophorese ab und bewerten Sie die Fragmentgrößen basierend auf dem größten Peak mit der fragmentierten Analysesoftware.Als nächstes konvertieren Sie die Fragmentgrößen in Wiederholungszahlen für jede der neun niedrigen und verwenden Sie die Fragmentgrößen der Wiederholungsnummern der Referenzdehnung Af293. Von 3.826 Bodenproben, die an 53 Standorten in neun Ländern entnommen wurden, wurden 1.473 Hefestämme isoliert. Die beste Inkubationstemperatur für jedes Land wurde auf der Grundlage seiner mittleren Jahrestemperatur bestimmt.In der Verdünnungsanalyse für jedes Land wurde der Shannon-Diversitätsindex als Maß für die Bodenhefediversität verwendet. Die resultierenden Verdünnungskurven näherten sich der Sättigungsasymptote, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Probenahmen wahrscheinlich nicht zu mehr Hefediversität geführt hätten. Myzelwachstum auf Platten bildete die für Aspergillus fumigatus typische grün schwankende Morphologie.Andere thermotolerante Pilzarten könnten in derselben Bodenprobe vorhanden sein und den Aspergillus fumigatus auf derselben Platte oder selbst züchten. Aspergillus fumigatus conidiophore Struktur, die mittels Lichtmikroskopie betrachtet und identifiziert wurde, zeigte, dass Konidiophoren eine Kugel auf dem Stick Morphologie haben und Conidiophoren uniseriat sind, wobei die an den Konidienketten befestigten Phialiden direkt an das sphärische Vesikel gebunden sind. Ein Chromatogramm erzeugtes Biseriat enthüllte die drei Kanäle, die die Fragmentlängen von Aspergillus fumigatus dinucleotide, Trinukleotid und Tetranukleotid kurzen Tandemwiederholungsloci visualisierten.Ein qualitativ hochwertiges Minimum-Spanning-Netzwerk kann mit dem R-Skript plot_poppr_msn oder imsn generiert werden. Eine diskriminierende Analyse von Prinzipkomponenten ist eine weitere Methode, um die genetischen Beziehungen zwischen Stämmen sichtbar zu machen. Die Zugabe von Benomyl und Chloramphenicol zu Wachstumsmedien verhindert Schimmel- bzw. Bakterienwachstum und begünstigt die Hefeselektion.Chloramphenicol reduziert auch die Fermentation in Medien und senkt die Gasansammlung in Inkubationsröhrchen. Die Durchführung von Metagenomik an Bodenproben wird zusätzliche Informationen über die kulturelle Vielfalt liefern. Anfällige Tests von A.fumigatus-Stämmen werden das Vorhandensein von Resistenzgenotypen identifizieren.Dieses Protokoll kann mit geringen Modifikationen auf andere Hefe- und Formsysteme angewendet werden. Es erleichterte die Untersuchung der kulturellen Bodenhefediversität und ihrer Prädiktoren auf globaler Ebene.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolierung genomischer DNA aus Maus-Tails

Forschung

Biologie

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Aufrechterhaltung eines<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bevölkerung Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Entfernen von exogenen Materialien aus dem äußeren Teil der gefrorenen Kerne der Antike biologische Gemeinschaften beherbergte Innen zur Untersuchung

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...