Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (अनुदान सं। एएलएलआरपी 570780-2021) और मैकमास्टर विश्वविद्यालय।

नोट: अंतरराष्ट्रीय मिट्टी के नमूनों और / या ए फ्यूमिगेटस बीजाणुओं और मायसेलिया का उपयोग करने वाले किसी भी कदम को स्तर 2 जीवों (बीएससीआईआई) के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर काम करने की आवश्यकता होती ?...

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A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. 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मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट मिट्टी प्रसंस्करण और फंगल अलगाव के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका है। प्रोटोकॉल केवल प्रति नमूना मिट्टी (0.1-0.2 ग्राम) की एक छो...

मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कवक कार्बनिक पदार्थ अपघटन, पोषक तत्व साइकिल चालन और मिट्टी के निषेचन में आवश्यक भूमिका निभाते हैं1. दोनों संस्कृति-स्वतंत्र (यानी, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण) और संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण व्यापक रूप से मिट्टी कवक 2,3 के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। जबकि उच्च-थ्रूपुट मेटाबारकोड अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा सामुदायिक संरचना और विविधता में व्यापक पैमाने पर पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है, संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण कवक समुदायों के वर्गीकरण और कार्यात्मक संरचनाओं पर अत्यधिक पूरक जानकारी प्रदान कर सकता है, साथ ही शुद्ध कवक संस्कृतियों की उपलब्धता के कारण डाउनस्ट्रीम विविधता और कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से व्यक्तिगत जीवों के अधिक विशिष्ट प्रोफाइल भी प्रदान कर सकता है।
मिट्टी के प्रति ग्राम शायद ही कभी हजारों कोशिकाओं से अधिक होने के बावजूद, खमीर, मोटे तौर पर एककोशिकीय कवक के रूप में परिभाषित किया गया है, अन्य मिट्टी निवासियों 4,5 के लिए आवश्यक डीकंपोजर और खाद्य स्रोत हैं। वास्तव में, खमीर महाद्वीपीय अंटार्कटिका 6,7 जैसे ठंडे जीवमंडलों में प्रमुख मिट्टी कवक हो सकता है। मिट्टी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खमीर का एक प्राथमिक भंडार भी है जो मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों में गंभीर अवसरवादी संक्रमण का कारण बनतीहै 8. रूपात्मक समानता के बावजूद, खमीर प्रजातियां फाइटोलैनेटिक रूप से विविध हैं और कवक साम्राज्य 9 के भीतर दो प्रमुख फाइला, एस्कोमाइकोटा और बेसिडिओमाइकोटा में फिलामेंटस कवक के बीच होतीहैं। खमीर में फंगल बारकोडिंग जीन में एक परिभाषित डीएनए हस्ताक्षर की कमी होती है, परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर10 के आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र, उन्हें मेटाजेनोमिक्स जांच में अन्य कवक से अप्रभेद्य बनाते हैं और इस प्रकार खमीर प्रजातियों को अलग करने के लिए संस्कृति-निर्भर तरीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को नौ देशों के मिट्टी खमीर समुदायों को चिह्नित करने और मिट्टी खमीर विविधता 9,11,12 में वैश्विक रुझानों और पैटर्न की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। खमीर 2,3 जैसे जीवों के लक्षित समूहों का अध्ययन करते समय मेटाजेनोमिक्स दृष्टिकोण सीमित उपयोग के होते हैं। उनकी फाइटोलैनेटिक विविधता के कारण, खमीर को अकेले डीएनए अनुक्रम के आधार पर अन्य कवक से अलग नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, खमीर आबादी का अध्ययन करने के लिए संस्कृति-निर्भर अलगाव के निरंतर उपयोग की आवश्यकता होती है। हालांकि, संवर्धन अक्सर काफी अधिक समय लेने वाला होता है और प्रयोगों को करने के लिए अधिक कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रोटोकॉल को सीमित कर्मियों के साथ तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित और सुव्यवस्थित किया गया है। संवर्धन का मुख्य लाभ यह है कि पहचानी गई खमीर प्रजातियां जीवित खमीर हैं और मृत नहीं हैं, और इस प्रकार मिट्टी में मौजूद क्षणिक कोशिकाओं के बजाय सच्चे मिट्टी के निवासी होने की अधिक संभावना है। यह अनुमान लगाया गया है कि मिट्टी में लगभग 40% फंगल डीएनए या तो अन्य वातावरण, बाह्य कोशिकीय से दूषित होते हैं, या कोशिकाओं से आते हैं जो अब बरकरार नहीं हैं, जिससे उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण फंगल समृद्धि को 55% 13 तक अधिक अनुमानित करते हैं। संस्कृति पर निर्भर अलगाव आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध संस्कृति को सुरक्षित करने के अतिरिक्त लाभ के साथ खमीर प्रजातियों की पहचान की पुष्टि कर सकता है। दरअसल, इस मिट्टी अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके 44 नई खमीर प्रजातियों की शुद्ध संस्कृतियों की पहचान की गई थी जिसने विस्तार से अपने वर्गीकरण और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए कई तरीकों के उपयोग की अनुमति दीथी।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग मिट्टी के भीतर मौजूद सांचों को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि ए। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस मिट्टी15 में एक विस्तृत, वैश्विक वितरण के साथ एक थर्मोफिलिक और सैप्रोफाइटिक मोल्ड है। इसे कई नैदानिक और गैर-नैदानिक वातावरण से अलग किया गया है। गैर-नैदानिक नमूने में आमतौर पर हवा, कार्बनिक मलबे (खाद, देखा धूल, ट्यूलिप बल्ब अपशिष्ट), और मिट्टी (कृषि, उद्यान और प्राकृतिक मिट्टी) 16,17,18,19 शामिल हैं। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस एक मानव अवसरवादी रोगज़नक़ है जो सामूहिक रूप से एस्परगिलोसिस नामक संक्रमण की एक श्रृंखला का कारण बनता है, जो दुनिया भर में16,20 में 8 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। दुनिया भर में लगभग 300,000 लोग आक्रामक एस्परगिलोसिस से पीड़ित हैं, जो एस्परगिलोसिस16 का सबसे गंभीर रूप है। रोगी आबादी, संक्रमण की साइट और एंटिफंगल थेरेपी की प्रभावकारिता जैसे कारकों के आधार पर, मृत्यु दर 90% जितनी अधिक हो सकती है। पिछले कई दशकों में, एंटिफंगल उपचारों के प्रतिरोध में वृद्धि हुई है, इन प्रतिरोध जीनोटाइप21,22,23 को ट्रैक करने के लिए नैदानिक और पर्यावरणीय आबादी दोनों में वैश्विक निगरानी प्रयासों की आवश्यकता है। 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर बढ़ने की क्षमता को देखते हुए, इस तापमान का उपयोग संस्कृति-निर्भर तरीकों का उपयोग करके मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स के लिए चयन करने के लिए शोषण किया जा सकता है। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स को आमतौर पर नौ अत्यधिक बहुरूपी लघु अग्रानुक्रम दोहराव (एसटीआर) लोकी पर जीनोटाइप किया जाता है, जो उपभेदों24 के बीच उच्च भेदभावपूर्ण शक्ति दिखाया जाता है। इन एसटीआर जीनोटाइप की तुलना दुनिया भर में दवा प्रतिरोध जीन सहित ए फ्यूमिगेटस जीनोटाइप के प्रसार को ट्रैक करने के लिए अन्य पहले सर्वेक्षण की गई आबादी से की जा सकती है।
नीचे हम एक संस्कृति-निर्भर तरीके से मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस के त्वरित अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रति नमूना प्राप्त मिट्टी की मात्रा के आधार पर, मिट्टी के नमूने दो प्रोटोकॉल के बीच साझा किए जा सकते हैं। मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने वाले समान तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल प्राप्त प्रति अलग 10x कम मिट्टी का उपयोग करता है। मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस को अलग करने का प्रयास करने वाले अध्ययनों के लिए प्रति पृथक 1 से 2 ग्राम मिट्टी की आवश्यकता होती है, जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए केवल 0.1-0.2 ग्राम मिट्टी 18,19,25 की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल छोटे प्लास्टिक और कंटेनरों का उपयोग करता है जो इसके उच्च-थ्रूपुट डिजाइन की सुविधा प्रदान करते हैं। इसलिए, इनक्यूबेटर और रोलर ड्रम जैसे उपकरणों के लिए कम जगह का उपयोग करके बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित किया जा सकता है। मिट्टी के नमूनों को 7 दिनों में आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को प्रति व्यक्ति प्रति दिन 150-200 नमूनों के प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

मिट्टी माइक्रोबियल जीवन की एक अविश्वसनीय मात्रा की मेजबानी करती है, जिसमें प्रत्येक ग्राम में अरबों जीवाणु, पुरातन और कवक कोशिकाएं होती हैं। बहुकोशिकीय कवक जैसे मोल्ड और एककोशिकीय कवक, मोटे तौर पर खमीर के रूप में परिभाषित, मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कार्बनिक पदार्थों के डीकंपोजर के रूप में और अन्य मिट्टी निवासियों के लिए खाद्य स्रोतों के रूप में आवश्यक भूमिकाओं को पूरा करते हैं। मिट्टी में कवक प्रजातियों की विविधता वर्षा और तापमान जैसे जलवायु कारकों की एक भीड़ पर निर्भर करती है, साथ ही कार्बनिक पदार्थ, पीएच और नमी सहित मिट्टी के गुण भी। पर्याप्त पर्यावरणीय नमूने की कमी, विशेष रूप से एशिया, अफ्रीका, दक्षिण अमेरिका और मध्य अमेरिका के क्षेत्रों में, मिट्टी के कवक समुदायों के लक्षण वर्णन और उपन्यास प्रजातियों की खोज में बाधा डालती है। 
हमने ~ 4,000 मिट्टी के नमूनों और खमीर और मोल्डों के अलगाव के लिए प्रयोगशाला में विकसित एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके छह महाद्वीपों में नौ देशों में मिट्टी कवक समुदायों की विशेषता बताई। यह प्रोटोकॉल खमीर और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस के लिए अलग-अलग चयनात्मक संवर्धन के साथ शुरू होता है, तरल मीडिया में, जबकि जीवाणु विकास को रोकता है। परिणामस्वरूप कॉलोनियों को तब ठोस मीडिया में स्थानांतरित कर दिया जाता है और शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए आगे संसाधित किया जाता है, इसके बाद डाउनस्ट्रीम आनुवंशिक लक्षण वर्णन होता है। खमीर प्रजातियों की पहचान परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर के अपने आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र के अनुक्रमण के माध्यम से स्थापित की जाती है, जबकि ए फ्यूमिगेटस की वैश्विक जनसंख्या संरचना माइक्रोसैटेलाइट मार्कर विश्लेषण के माध्यम से खोजी जाती है। 
प्रोटोकॉल को कैमरून, कनाडा, चीन, कोस्टा रिका, आइसलैंड, पेरू, न्यूजीलैंड और सऊदी अरब में मिट्टी खमीर और ए फ्यूमिगेटस आबादी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। इन निष्कर्षों से मिट्टी खमीर विविधता में वैश्विक पैटर्न के साथ-साथ वैश्विक जनसंख्या संरचना और ए फ्यूमिगेटस के एंटिफंगल प्रतिरोध प्रोफाइल पर बहुत आवश्यक अंतर्दृष्टि का पता चला। यह पेपर अंतरराष्ट्रीय मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस दोनों को अलग करने की विधि प्रस्तुत करता है।

मिट्टी से खमीर अलगाव उपरोक्त खमीर अलगाव प्रोटोकॉल नौ देशों 9,12 में 53 स्थानों से उत्पन्न मिट्टी के नमूनों से संस्कृति खमीर के लिए लागू किया गया था। कुल मिलाकर, 1,473 खमीर उपभेदो?...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

यह प्रोटोकॉल खमीर और मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस को 7 दिनों में मिट्टी के नमूनों के बड़े सेट से संवर्धन करने का एक प्रभावी, त्वरित तरीका है। प्रयोगों के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन मीडिया और तापमान की एक श्रृंखला को समायोजित करने के लिए विधियों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

कवक जनसंख्या संरचना की जांच करने के लिए मिट्टी से कृषि योग्य खमीर और मोल्ड्स का अलगाव

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

हमारा प्रोटोकॉल विभिन्न जलवायु क्षेत्रों से प्राप्त मिट्टी के नमूनों का उपयोग करके मिट्टी में खमीर और मोल्ड विविधता की जांच करता है। यह पर्यावरण यी खमीर विविधता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और रोगजनक प्रजातियों को ट्रैक करने में मदद करता है। प्रोटोकॉल मिट्टी से खमीर और मोल्ड की कटाई की एक लागत प्रभावी और त्वरित विधि प्रदान करता है।मिट्टी के नमूनों को सात दिनों में आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है। अच्छी तरह से संगठित प्रयोगात्मक सेटअप, जैसे कि संस्कृति ट्यूबों को लेबल करना और एक दिन पहले मीडिया तैयार करना प्रयोग के दौरान अभिभूत महसूस करने से बचने की कुंजी है। बाँझ 13 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूबों का एक सेट तैयार करने के साथ शुरू करें।मिट्टी के नमूने आईडी के साथ उन्हें लेबल करके, फिर प्रत्येक ट्यूब में क्लोरैम्फेनिकॉल और बेनोमाइल के साथ पूरक खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोज शोरबा के पांच मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। स्तर दो जीवों के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, एक बाँझ लकड़ी के विमान टिप आवेदक का उपयोग करके उपयुक्त संस्कृति ट्यूब में लगभग 0.1 ग्राम मिट्टी स्थानांतरित करें। ट्यूब को पहले स्टॉप पर सुरक्षित रूप से कैप करें, इनक्यूबेशन के दौरान हवा के आदान-प्रदान की अनुमति देते हुए फैलाव को रोकें।अगला खमीर विकास को अधिकतम करने के लिए इष्टतम समझे गए तापमान पर 24 घंटे के लिए एक रोलर ड्रम में संस्कृति ट्यूबों सेते हैं। फिर सतह पर तैरनेवाला को ठोस माध्यम में स्थानांतरित करने से पहले मिट्टी के नमूने आईडी के साथ क्लोरैम्फेनिकॉल और बेनोमाइल पूरक खमीर निकालने पेप्टोन-डेक्सट्रोज अगर प्लेटों को लेबल करें। रोलर ड्रम से संस्कृति ट्यूबों निकालें।फिर स्तर दो जीवों के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, संक्षेप में मिट्टी के कणों और कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए ट्यूब को भंवर करें जो निलंबन में नीचे बस गए होंगे। इसके बाद, माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एक प्लेट पर सतह पर तैरनेवाला के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। अगर सतह पर तरल को अच्छी तरह से और समान रूप से फैलाने के लिए एक बाँझ पुन: प्रयोज्य सेल स्प्रेडर का उपयोग करें।दो से तीन दिनों के पर्याप्त इनक्यूबेशन समय की अनुमति देने के बाद, स्तर दो जीवों के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर किसी भी खमीर वृद्धि के लिए प्लेटों का निरीक्षण करें। मलाईदार, गोल, मैट जैसे खमीर की तलाश करें जिन्हें आसानी से बैक्टीरिया और मोल्ड कॉलोनियों से अलग किया जा सकता है। बाँझ लकड़ी के सादे इत्तला दे दी आवेदक छड़ें का उपयोग कर प्रत्येक प्लेट से एक खमीर की तरह कॉलोनी का चयन करें।एकल कालोनियों के लिए क्लोरैम्फेनिकॉल और बेनोमाइल और लकीर के साथ पूरक एक ताजा खमीर निकालने पेप्टोन-डेक्सट्रो अगर प्लेटों पर प्रत्येक चयनित कॉलोनी स्थानांतरण। तीन अलग-अलग लकीरें करें और प्रत्येक लकीर के लिए एक नई आवेदक छड़ी का उपयोग करें। अगला, कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन करने के लिए प्लेट पर विकसित ताजा कोशिकाओं का उपयोग करें।फंगल बार कोडिंग जीन को बढ़ाने के लिए आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर आईटीएस 1 और आईटीएस 4 प्राइमरों का उपयोग करें। खमीर उपभेदों के प्राप्त आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर अनुक्रम की तुलना करें, सार्वजनिक डेटाबेस में जमा दो अनुक्रम, जैसे कि जैव प्रौद्योगिकी सूचना जेनबैंक और यूनाइट के लिए प्रजातियों की पहचान स्थापित करने के लिए। सबौरौड डेक्सट्रोज शोरबा के एक मिलीलीटर युक्त 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में मिट्टी जोड़ें और दो से चार दिनों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।मिट्टी के शोरबा से माइसेलिया को माल्ट निकालने अगर प्लेटों पर स्थानांतरित करने के लिए, सबसे पहले, मिट्टी के इनोकुलम की पहचान करें जो माइसेलियल वृद्धि को दृश्यमान करते हैं, सबौरौड डेक्सट्रोज शोरबा को वायु सीमा में जोड़ें। फिर मायसेलिया को माल्ट निकालने अगर प्लेट के केंद्र में स्थानांतरित करने के लिए निष्फल लकड़ी के सादे टिप आवेदक छड़ों का उपयोग करें और इन माल्ट निकालने अगर प्लेट को तीन दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सेट करें। माइसेलिया के चयन के लिए, एस्परगिलस फ्यूमिगेटस रूपात्मक गुणों के साथ, मोल्ड कॉलोनियों की पहचान करें जिनमें हरे रंग की तरह वृद्धि होती है।स्तर दो जीवों के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, निष्फल लकड़ी के विमान टिप आवेदक छड़ें या एक टीकाकरण लूप का उपयोग करके एक बार सतह को स्क्रैप करके कोनिडिया या मायसेलिया की कटाई करें और इसे एकल कॉलोनियों के लिए अगर पर लकीर करके माल्ट निकालने अगर प्लेट के केंद्र में स्थानांतरित करें। दो दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते हैं। एक बाँझ एप्लिकेशन स्टिक या इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करके, एक बार कॉलोनी को लकीर करके माल्ट निकालने अगर पर उत्पन्न एक एकल कॉलोनी उपसंस्कृति।कटाई बीजाणुओं को प्लेट के केंद्र में फैलाएं। संस्कृति भंडारण के लिए एस्परगिलस फ्यूमिगेटस बीजाणुओं या मायसेलिया की कटाई के लिए एक बाँझ 30% ग्लिसरॉल समाधान तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर अगर प्लेटों के इनक्यूबेशन के दो दिनों के बाद, एक पिपेट का उपयोग करके 30% ग्लिसरॉल समाधान के एक मिलीलीटर की आकांक्षा करें और इसे एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कॉलोनी पर फैलाएं।एस्परगिलस फ्यूमिगेटस उपभेदों की फेनोटाइपिक पहचान के लिए, 990 माइक्रोलीटर पानी में जोड़ने के लिए मायसेलियल और बीजाणु स्टॉक के 10 माइक्रोलीटर की आकांक्षा करें। भंवर इस पतला बीजाणु निलंबन और एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर निलंबन के 10 माइक्रोलीटर वितरित करें। फिर 400 एक्स आवर्धन पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निलंबन देखें और कोनिडियोफोरस का पता लगाएं।एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोर आकृति विज्ञान के साथ देखे गए कोनिडियोफोर आकृति विज्ञान की तुलना करें। नौ सूक्ष्म उपग्रह लोकी में से प्रत्येक के लिए सही टुकड़ा आकार निर्धारित करने के लिए, टुकड़ा विश्लेषण में सक्षम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। केशिका वैद्युतकणसंचलन से प्राप्त कच्चे डेटा को पुनः प्राप्त करें और खंडित विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सबसे बड़ी चोटी के आधार पर टुकड़ा आकार स्कोर करें।अगला, संदर्भ तनाव Af293 की दोहराने की संख्या के टुकड़े आकार का उपयोग नौ कम उपयोग में से प्रत्येक के लिए संख्या दोहराने के लिए टुकड़ा आकार परिवर्तित करें। 3 से, नौ देशों में 53 स्थानों से एकत्र किए गए 826 मिट्टी के नमूने, 1, 473 खमीर उपभेदों को अलग किया गया था। प्रत्येक देश के लिए सबसे अच्छा इनक्यूबेशन तापमान उसके औसत वार्षिक तापमान के आधार पर निर्धारित किया गया था।प्रत्येक देश के लिए दुर्लभता विश्लेषण में, शैनन विविधता सूचकांक का उपयोग मिट्टी खमीर विविधता के उपाय के रूप में किया गया था। परिणामी दुर्लभता घटता संतृप्ति एसिम्प्टोट से संपर्क करता है जो दर्शाता है कि अतिरिक्त नमूने से अधिक खमीर विविधता प्राप्त होने की संभावना नहीं थी। प्लेटों पर मायसेलियल वृद्धि ने एस्परगिलस फ्यूमिगेटस के विशिष्ट हरे रंग की आकृति विज्ञान का गठन किया।अन्य थर्मोटोलरेंट फंगल प्रजातियां एक ही मिट्टी के नमूने के भीतर मौजूद हो सकती हैं और एस्परगिलस फ्यूमिगेटस को एक ही प्लेट पर या खुद से बढ़ा सकती हैं। प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखी और पहचानी गई एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोर संरचना से पता चला है कि कोनिडियोफोरस में छड़ी आकृति विज्ञान पर एक गेंद होती है और कोनिडियोफोरस यूनिसेरिएट होते हैं, जहां कोनिडिया श्रृंखलाओं से जुड़े फीलाइड्स सीधे गोलाकार पुटिका से जुड़े होते हैं। एक क्रोमैटोग्राम उत्पन्न बिसेरिएट ने एस्परगिलस फ्यूमिगेटस डाइन्यूक्लियोटाइड, ट्राइन्यूक्लियोटाइड और टेट्रान्यूक्लियोटाइड शॉर्ट टेंडेम रिपीट लोकी की टुकड़े की लंबाई की कल्पना करने वाले तीन चैनलों का खुलासा किया।आर स्क्रिप्ट plot_poppr_msn या आईएमएसएन का उपयोग करके एक उच्च गुणवत्ता वाला न्यूनतम स्पैनिंग नेटवर्क उत्पन्न किया जा सकता है। सिद्धांत घटकों का एक भेदभावपूर्ण विश्लेषण उपभेदों के बीच आनुवंशिक संबंधों की कल्पना करने का एक और तरीका है। विकास मीडिया में बेनोमाइल और क्लोरैम्फेनिकॉल जोड़ना क्रमशः मोल्ड और जीवाणु विकास को रोकता है, और खमीर चयन का पक्षधर है।क्लोरैम्फेनिकॉल मीडिया में किण्वन को भी कम करता है, इनक्यूबेटिंग ट्यूबों में गैस बिल्डअप को कम करता है। मिट्टी के नमूनों पर मेटाजेनोमिक्स का प्रदर्शन सांस्कृतिक विविधता पर अतिरिक्त जानकारी प्रदान करेगा। एफ्यूमिगेटस उपभेदों का अतिसंवेदनशील परीक्षण प्रतिरोध जीनोटाइप की उपस्थिति की पहचान करेगा।इस प्रोटोकॉल को थोड़ा संशोधन के साथ अन्य खमीर और मोल्ड सिस्टम पर लागू किया जा सकता है। इसने वैश्विक स्तर पर सांस्कृतिक मिट्टी खमीर विविधता और इसके भविष्यवक्ताओं की जांच की सुविधा प्रदान की।

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

जीनोमिक डीएनए के माउस पूंछ से अलगाव

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

उच्च आण्विक वजन जीनोमिक डीएनए के मृदा और निक्षेपों से निकालना

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

अलगाव और kinesin के शोधन से ड्रोसोफिला भ्रूण

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

मानव सीरम से लघु noncoding RNAs के अलगाव

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

माउस और मानव घुटकी से myofibroblasts का अलगाव

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

भोजी के विश्लेषण में<em&gt; पेनिसिलियम chrysogenum</em&gt; प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में भुखमरी पैड का उपयोग करके

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

एक का रखरखाव<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; जनसंख्या केज

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

जमे हुए कोर के बाहरी हिस्से से Exogenous सामग्री को हटाने प्राचीन जैविक समुदायों शरण के अंदर जांच करने के लिए

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

परिधीय रक्त से अलगाव और Microvesicles की विशेषता

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

तकनीक प्रेरित और यों सेलुलर बुढ़ापा को

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...