Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) e McMaster University.

NOTA: Qualsiasi passaggio che utilizzi campioni internazionali di suolo e/o spore e miceli di A. fumigatus richiede di lavorare all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello 2 (BSCII).
1. Isolamento del lievito dal terreno
<ol><li>Preparazione di soluzioni antibatteriche e antifungine<ol>
<li>Sospendere la polvere di cloramfenicolo in etanolo al 70% per preparare una soluzione madre da 50 g/L. Sterilizzare mediante filtrazione a siringa e conser...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Il protocollo sviluppato per isolare lieviti e A. fumigatus dal suolo è un metodo rapido ed efficiente per la lavorazione del suolo ad alto rendimento e l'isolamento fungino. Il protocollo richiede solo una piccola quantità di terreno (0,1-0,2 g) per campione, consentendo di campionare più siti con uno sforzo simile. I tempi di consegna rapidi assicurano che i risultati possano essere ottenuti in un breve lasso di tempo e consentono di risolvere i problemi e ripetere gli esperimenti, se necessario. Questo pro...

I funghi negli ecosistemi del suolo svolgono ruoli essenziali nella decomposizione della materia organica, nel ciclo dei nutrienti e nella fertilizzazione del suolo1. Sia gli approcci indipendenti dalla coltura (cioè il sequenziamento ad alto rendimento) che gli approcci dipendenti dalla coltura sono ampiamente utilizzati nello studio dei funghi del suolo 2,3. Mentre la grande quantità di dati generati dal sequenziamento del metabarcodo ad alto rendimento è utile per chiarire modelli su larga scala nella struttura e nella diversità della comunità, l'approccio dipendente dalla cultura può fornire informazioni altamente complementari sulle strutture tassonomiche e funzionali delle comunità fungine, nonché profili più specifici dei singoli organismi attraverso la diversità a valle e le analisi funzionali dovute alla disponibilità di colture fungine pure.
Nonostante raramente superino migliaia di cellule per grammo di terreno, i lieviti, ampiamente definiti come funghi unicellulari, sono decompositori e fonti di cibo essenziali per altri abitanti del suolo 4,5. In effetti, i lieviti possono essere i funghi del suolo predominanti nelle biosfere fredde come l'Antartide continentale 6,7. Il suolo è anche un serbatoio primario di lieviti rilevanti dal punto di vista medico che causano gravi infezioni opportunistiche negli esseri umani e in altri mammiferi8. Nonostante le somiglianze morfologiche, le specie di lievito sono filogeneticamente diverse e si trovano tra i funghi filamentosi in due phyla principali, Ascomycota e Basidiomycota, all'interno del regno fungino9. I lieviti mancano di una firma del DNA che definisce il gene del codice a barre fungino, la regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster10 del gene dell'RNA ribosomiale nucleare, rendendoli indistinguibili da altri funghi nelle indagini di metagenomica e quindi rendendo necessario l'uso di metodi dipendenti dalla coltura per isolare le specie di lievito.
Il protocollo seguente è stato implementato per caratterizzare le comunità di lieviti del suolo di nove paesi e identificare tendenze e modelli globali nella diversità del lievito del suolo 9,11,12. Gli approcci di metagenomica sono di utilità limitata quando si studiano gruppi mirati di organismi come i lieviti 2,3. A causa della loro diversità filogenetica, i lieviti non possono essere distinti da altri funghi basati sulla sola sequenza di DNA. Pertanto, lo studio delle popolazioni di lieviti richiede l'uso continuato dell'isolamento dipendente dalla cultura. Tuttavia, la coltivazione è spesso significativamente più dispendiosa in termini di tempo e richiede più personale per eseguire gli esperimenti. Pertanto, il protocollo è stato ottimizzato e semplificato per un'elaborazione più rapida con personale limitato. Il vantaggio principale della coltivazione è che le specie di lievito identificate sono lieviti vivi e non morti, e quindi hanno maggiori probabilità di essere veri abitanti del suolo piuttosto che cellule transitorie presenti nei terreni. È stato stimato che circa il 40% del DNA fungino nel suolo sono contaminanti provenienti da altri ambienti, extracellulari, o provengono da cellule che non sono più intatte, causando approcci di sequenziamento ad alto rendimento per sovrastimare la ricchezza fungina fino al 55%13. L'isolamento dipendente dalla coltura può facilmente confermare l'identità delle specie di lievito con l'ulteriore vantaggio di garantire la coltura pura da utilizzare nelle analisi a valle. In effetti, colture pure di 44 nuove specie di lievito putativo sono state identificate utilizzando questo protocollo di isolamento del suolo che ha permesso l'uso di una serie di metodi per studiare le loro proprietà tassonomiche e funzionali in dettaglio14.
Il protocollo riportato di seguito può essere utilizzato anche per isolare le muffe presenti all'interno del suolo, come A. fumigatus. Aspergillus fumigatus è una muffa termofila e saprofita con un'ampia distribuzione globale nel suolo15. È stato isolato da numerosi ambienti clinici e non clinici. Il campionamento non clinico include comunemente aria, detriti organici (compost, segatura, rifiuti di bulbi di tulipani) e suolo (terreni agricoli, da giardino e naturali)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunistico umano che causa una serie di infezioni collettivamente definite aspergillosi, che colpiscono oltre 8 milioni di persone in tutto il mondo16,20. Circa 300.000 persone in tutto il mondo soffrono di aspergillosi invasiva, che è la forma più grave di aspergillosi16. A seconda di fattori come la popolazione di pazienti, il sito di infezione e l'efficacia della terapia antifungina, il tasso di mortalità può arrivare fino al 90%. Negli ultimi decenni, la resistenza alle terapie antifungine è aumentata, richiedendo sforzi di sorveglianza globale sia nelle popolazioni cliniche che ambientali per tracciare questi genotipi di resistenza 21,22,23. Data la sua capacità di crescere a temperature superiori a 50 °C, questa temperatura può essere sfruttata per selezionare isolati di A. fumigatus dal suolo utilizzando metodi dipendenti dalla coltura. Gli isolati di Aspergillus fumigatus sono comunemente genotipizzati in nove loci a ripetizione tandem breve (STR) altamente polimorfici, che hanno dimostrato di avere un elevato potere discriminatorio tra i ceppi24. Questi genotipi STR possono essere confrontati con altre popolazioni precedentemente intervistate per tracciare la diffusione dei genotipi di A. fumigatus, compresi i geni di resistenza ai farmaci, in tutto il mondo.
Di seguito descriviamo un protocollo per il rapido isolamento di lieviti e A. fumigatus da campioni di terreno in modo dipendente dalla coltura. A seconda della quantità di terreno ottenuta per campione, i campioni di terreno possono essere condivisi tra i due protocolli. Rispetto a metodi simili che isolano il lievito e A. fumigatus dal suolo, questo protocollo utilizza 10 volte meno terreno per isolato ottenuto. Gli studi che tentano di isolare A. fumigatus dal suolo richiedono tra 1 e 2 g di terreno per isolato, mentre questo protocollo richiede solo 0,1-0,2 g diterreno 18,19,25. Questo protocollo utilizza plastiche e contenitori più piccoli che facilitano la sua progettazione ad alta produttività. Pertanto, un numero maggiore di campioni può essere elaborato utilizzando meno spazio per attrezzature come incubatori e tamburi a rulli. I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena 7 giorni. Questo protocollo è stato ottimizzato per consentire l'elaborazione di un massimo di 150-200 campioni al giorno a persona.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Il suolo ospita un'incredibile quantità di vita microbica, con ogni grammo contenente fino a miliardi di cellule batteriche, archeali e fungine. I funghi multicellulari come muffe e funghi unicellulari, ampiamente definiti come lieviti, svolgono ruoli essenziali negli ecosistemi del suolo come decompositori di materiale organico e come fonti di cibo per altri abitanti del suolo. La diversità delle specie fungine nel suolo dipende da una moltitudine di fattori climatici come precipitazioni e temperatura, nonché dalle proprietà del suolo tra cui materia organica, pH e umidità. La mancanza di un adeguato campionamento ambientale, specialmente nelle regioni dell'Asia, dell'Africa, del Sud America e dell'America centrale, ostacola la caratterizzazione delle comunità fungine del suolo e la scoperta di nuove specie. 
Abbiamo caratterizzato le comunità fungine del suolo in nove paesi in sei continenti utilizzando circa 4.000 campioni di suolo e un protocollo sviluppato in laboratorio per l'isolamento di lieviti e muffe. Questo protocollo inizia con l'arricchimento selettivo separato per i lieviti e la muffa clinicamente rilevante Aspergillus fumigatus, in mezzi liquidi mentre inibisce la crescita batterica. Le colonie risultanti vengono quindi trasferite in mezzi solidi e ulteriormente elaborate per ottenere colture pure, seguite dalla caratterizzazione genetica a valle. L'identità delle specie di lievito viene stabilita attraverso il sequenziamento della loro regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster genico dell'RNA ribosomiale nucleare, mentre la struttura della popolazione globale di A. fumigatus viene esplorata tramite l'analisi dei marcatori di microsatelliti. 
Il protocollo è stato applicato con successo per isolare e caratterizzare le popolazioni di lievito del suolo e A. fumigatus in Camerun, Canada, Cina, Costa Rica, Islanda, Perù, Nuova Zelanda e Arabia Saudita. Questi risultati hanno rivelato approfondimenti tanto necessari sui modelli globali nella diversità del lievito del suolo, nonché sulla struttura della popolazione globale e sui profili di resistenza antifungina di A. fumigatus. Questo documento presenta il metodo per isolare sia i lieviti che A. fumigatus da campioni di suolo internazionali.

Isolamento del lievito dal suolo Il protocollo di isolamento del lievito di cui sopra è stato implementato per coltivare lieviti da campioni di terreno provenienti da 53 località in nove paesi 9,12. In totale, 1.473 ceppi di lievito sono stati isolati da 3.826 campioni di suolo. Date le diverse condizioni climatiche dei nove paesi di origine, la migliore temperatura di incubazione per ciascun paese è stata determinata in base alla sua tempe...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Questo protocollo è un metodo efficace e veloce per coltivare lieviti e la muffa Aspergillus fumigatus da grandi serie di campioni di terreno in appena 7 giorni. I metodi possono essere facilmente modificati per adattarsi a una gamma di mezzi di incubazione e temperature necessarie per gli esperimenti.

Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Il nostro protocollo studia la diversità di lieviti e muffe nel suolo utilizzando campioni di terreno ottenuti da diverse regioni climatiche. Ciò fornisce approfondimenti sulla diversità ambientale del lievito e aiuta a tracciare le specie patogene. Il protocollo offre un metodo economico e veloce per la raccolta di lieviti e muffe dal terreno.I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena sette giorni. Una configurazione sperimentale ben organizzata, come l'etichettatura dei tubi di coltura e la preparazione dei supporti con un giorno di anticipo, è la chiave per evitare di sentirsi sopraffatti durante l'esperimento. Inizia con la preparazione di un set di tubi di coltura sterili da 13 millilitri.Etichettandoli con ID campione di terreno, quindi utilizzare una pipetta sierologica per aggiungere cinque millilitri di estratto di lievito-peptone-destrosio brodo integrato con cloramfenicolo e benomil in ogni tubo. All'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, trasferire circa 0,1 grammi di terreno nel tubo di coltura appropriato utilizzando un applicatore sterile di punta piana in legno. Tappare saldamente il tubo fino alla prima fermata, evitando fuoriuscite e consentendo lo scambio d'aria durante l'incubazione.Quindi incubare i tubi di coltura in un tamburo a rulli per 24 ore a una temperatura ritenuta ottimale per massimizzare la crescita del lievito. Quindi etichettare le piastre di agar peptone-destrosio dell'estratto di cloruro e benomyl con l'ID del campione di terreno prima di trasferire il surnatante sul terreno sul terreno solido. Rimuovere i tubi di coltura dal tamburo a rulli.Quindi, all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, ruotare brevemente il tubo per attirare particelle di terreno e cellule che potrebbero essersi depositate nella parte inferiore in sospensione. Quindi, trasferire 100 microlitri del surnatante su una piastra utilizzando una micropipetta. Utilizzare uno spandicelle sterile riutilizzabile per distribuire il liquido in modo completo e uniforme sulla superficie dell'agar.Dopo aver concesso un tempo di incubazione sufficiente di due o tre giorni, ispezionare le piastre per qualsiasi crescita di lievito all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due. Cerca lieviti cremosi, rotondi, opachi che possano essere facilmente distinti dalle colonie batteriche e di muffa. Selezionare una colonia simile a un lievito da ogni piatto utilizzando bastoncini di applicatore sterili in legno con punta semplice.Trasferire ogni colonia selezionata su un estratto di lievito fresco peptone-destro agar piastre integrate con cloramfenicolo e benomil e striscia per singole colonie. Eseguire tre strisce separate e utilizzare un nuovo stick applicatore per ogni striscia. Successivamente, utilizzare cellule fresche sviluppate su una piastra per eseguire una reazione a catena della polimerasi della colonia.Utilizzare distanziali trascritti interni ITS1 e ITS4 primer per amplificare il gene della codifica a barre fungina. Confronta la sequenza di distanziatori trascritti internamente ottenuta dei ceppi di lievito, due sequenze depositate in database pubblici, come il National Center for Biotechnology Information GenBank e UNITE per stabilire l'identità delle specie. Aggiungere terreno a tubi di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti un millilitro di brodo di destrosio Sabouraud e incubare a 50 gradi Celsius per due o quattro giorni.Per trasferire i miceli dal brodo inoculato del terreno su piastre di agar estratto di malto, in primo luogo, identificare gli inoculi del suolo che hanno una crescita miceliale visibile aggiungere il brodo di destrosio Sabouraud al confine dell'aria. Quindi utilizzare bastoncini di applicatore a punta semplice in legno sterilizzati per trasferire il micelio al centro di una piastra di agar estratto di malto e incubare questi piatti di agar estratto di malto impostati a 37 gradi Celsius per tre giorni. Per la selezione dei miceli, con proprietà morfologiche di Aspergillus fumigatus, identificare le colonie di muffe che hanno una caratteristica crescita verde ondeggiante.All'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello due, raccogliere conidi o miceli raschiando la superficie una volta usando bastoncini di applicazione della punta piana in legno sterilizzati o un anello di inoculazione e trasferirlo al centro di una piastra di agar estratto di malto strisciando sull'agar per singole colonie. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due giorni. Utilizzando un bastoncino di applicazione sterile o un ciclo di inoculazione, sottocultura una singola colonia generata sull'estratto di malto di agar strisciando la colonia una volta.Distribuire le spore raccolte al centro del piatto. Preparare una soluzione sterile di glicerolo al 30% per raccogliere le spore o i miceli di Aspergillus fumigatus per la conservazione in coltura. Dopo i due giorni di incubazione delle piastre di agar a 37 gradi Celsius, aspirare un millilitro della soluzione di glicerolo al 30% usando una pipetta e disperderlo nella colonia di Aspergillus fumigatus.Per l'identificazione fenotipica dei ceppi di Aspergillus fumigatus, aspirare 10 microlitri degli stock miceliali e sporici da aggiungere in 990 microlitri di acqua. Vortex questa sospensione di spore diluite ed erogare 10 microlitri della sospensione su un vetrino per microscopio standard. Quindi utilizzando un microscopio composto con ingrandimento 400X visualizzare la sospensione e individuare i conidiofori.Confronta la morfologia conidiofora osservata con la morfologia dell'Aspergillus fumigatus conidiophore. Per determinare la dimensione corretta del frammento per ciascuno dei nove loci micro-satellite, utilizzare un software in grado di analizzare i frammenti. Recupera i dati grezzi ottenuti dall'elettroforesi capillare e assegna un punteggio alle dimensioni dei frammenti in base al picco più grande utilizzando il software di analisi frammentato.Quindi, convertire le dimensioni dei frammenti in numeri ripetuti per ciascuno dei nove bassi utilizzare le dimensioni dei frammenti dei numeri di ripetizione del ceppo di riferimento Af293. Da 3.826 campioni di suolo raccolti da 53 località in nove paesi, 1.473 ceppi di lievito sono stati isolati. La migliore temperatura di incubazione per ogni paese è stata determinata in base alla sua temperatura media annuale.Nell'analisi di rarefazione per ogni paese, l'indice di diversità di Shannon è stato utilizzato come misura della diversità del lievito del suolo. Le curve di rarefazione risultanti si avvicinavano all'asintoto di saturazione, indicando che un campionamento aggiuntivo non avrebbe probabilmente prodotto una maggiore diversità di lieviti. La crescita miceliale su placche formava la morfologia verde ondeggiata tipica dell'Aspergillus fumigatus.Altre specie fungine termotolleranti potrebbero essere presenti all'interno dello stesso campione di terreno e far crescere l'Aspergillus fumigatus sulla stessa piastra o da sole. La struttura del conidioforo aspergillus fumigatus osservata e identificata al microscopio ottico ha rivelato che i conidiofori hanno una palla sulla morfologia del bastone e i conidiofori sono uniseriati, dove le fialidi attaccate alle catene dei conidi sono attaccate direttamente alla vescicola sferica. Un bieriato generato dal cromatogramma ha rivelato i tre canali visualizzando le lunghezze dei frammenti di Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinucleotide e tetranucleotide brevi ripetizioni tandem loci.È possibile generare una rete di spanning minimo di alta qualità utilizzando lo script R plot_poppr_msn o imsn. Un'analisi discriminatoria dei componenti principali è un altro metodo per visualizzare le relazioni genetiche tra i ceppi. L'aggiunta di benomil e cloramfenicolo ai mezzi di crescita previene la crescita di muffe e batteri, rispettivamente, e favorisce la selezione del lievito.Il cloramfenicolo riduce anche la fermentazione nei mezzi, riducendo l'accumulo di gas nei tubi di incubazione. L'esecuzione di metagenomica su campioni di suolo fornirà ulteriori informazioni sulla diversità culturale. Test sensibili di ceppi di A.fumigatus identificheranno la presenza di genotipi di resistenza.Questo protocollo può essere applicato ad altri sistemi di lieviti e muffe con poche modifiche. Ha facilitato lo studio della diversità culturale del lievito del suolo e dei suoi predittori su scala globale.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

Ricerca

Biologia

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

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The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

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Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

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Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

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Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

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Le tecniche per indurre e Quantificare cellulare senescenza

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