Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant nr. ALLRP 570780-2021) og McMaster University.

MERK: Eventuelle trinn ved bruk av internasjonale jordprøver og / eller A. fumigatussporer og mycelia krever arbeid i et biosikkerhetsskap for nivå 2 organismer (BSCII).
1. Isolering av gjær fra jord
<ol><li>Fremstilling av antibakterielle og antifungale løsninger<ol>
<li>Suspend kloramfenikolpulver i 70% etanol for å fremstille en 50 g / L stamløsning. Steriliser ved sprøytefiltrering og oppbevar ved 4 °C. MERK: Dette antibiotikumet vil forhindre vekst a...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivariate+analysis+of+soil+yeasts+isolated+from+a+latitudinal+gradient.">A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient.</a> Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).</li><li>Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).</li><li>Samarasinghe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+culturable+soil+yeast+diversity.">Global patterns in culturable soil yeast diversity.</a> iScience. 24 (10), 103098 (2021).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+DNA+barcoding.">Fungal DNA barcoding.</a> Genome. 59 (11), 913-932 (2016).</li><li>Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+yeasts+and+where+to+find+them:+the+discovery+of+a+predominantly+clonal+Cryptococcus+deneoformans+population+in+Saudi+Arabian+soils.">Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).</li><li>Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relationships+among+strains+of+culturable+yeasts+in+agricultural+soils+in+Cameroon.">Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity.">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+species+concepts+in+the+genomics+era.">Fungal species concepts in the genomics era.</a> Genome. 63 (9), 459-468 (2020).</li><li>Brakhage, A. A., Langfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menacing+mold:+The+molecular+biology+of+Aspergillus+fumigatus.">Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus.</a> Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).</li><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+multi-national+prevalence+of+fungal+diseases-Estimate+precision.">Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision.</a> Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).</li><li>Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Protokollen utviklet for isolering av gjær og A. fumigatus fra jord er en rask og effektiv metode for jordbehandling og soppisolering med høy gjennomstrømning. Protokollen krever bare en liten mengde jord (0,1-0,2 g) per prøve, slik at flere steder kan prøves med lignende innsats. Den raske behandlingstiden sikrer at resultatene kan oppnås innen en kort tidsramme og gir tid til feilsøking og gjentatte eksperimenter om nødvendig. Denne protokollen kan enkelt replikeres på tvers av mange laboratorieinnsti...

Sopp i jordøkosystemer spiller viktige roller i nedbrytning av organisk materiale, næringssyklus og jordgjødsel1. Både kulturuavhengige (dvs. høykapasitetssekvensering) og kulturavhengige tilnærminger er mye brukt i studiet av jordsvamp 2,3. Mens den store mengden data som genereres av metabarkodesekvensering med høy gjennomstrømning er nyttig for å belyse brede mønstre i samfunnsstruktur og mangfold, kan den kulturavhengige tilnærmingen gi svært komplementær informasjon om de taksonomiske og funksjonelle strukturer i soppsamfunn, samt mer spesifikke profiler av individuelle organismer gjennom nedstrøms mangfold og funksjonelle analyser på grunn av tilgjengeligheten av rene soppkulturer.
Til tross for sjelden overskridelse av tusenvis av celler per gram jord, er gjær, bredt definert som encellede sopp, essensielle nedbrytere og matkilder for andre jordboere 4,5. Faktisk kan gjær være den dominerende jordsoppen i kalde biosfærer som kontinental Antarktis 6,7. Jord er også et primært reservoar av medisinsk relevante gjær som forårsaker alvorlige opportunistiske infeksjoner hos mennesker og andre pattedyr8. Til tross for morfologiske likheter er gjærarter fylogenetisk mangfoldige og forekommer blant filamentøse sopp i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, innenfor soppriket9. Gjær mangler en definerende DNA-signatur ved soppstrekkodingsgenet, den interne transkriberte avstandsstykket (ITS) -regionen i den nukleære ribosomale RNA-genklyngen10, noe som gjør dem umulige å skille fra andre sopp i metagenomikkundersøkelser og dermed nødvendiggjør bruk av kulturavhengige metoder for å isolere gjærarter.
Protokollen nedenfor ble implementert for å karakterisere jordgjærsamfunn i ni land og identifisere globale trender og mønstre i jordgjærdiversitet 9,11,12. Metagenomikk tilnærminger er av begrenset bruk når man studerer målrettede grupper av organismer som gjær 2,3. På grunn av deres fylogenetiske mangfold kan gjær ikke skilles fra andre sopp basert på DNA-sekvens alene. Dermed krever studier av gjærpopulasjoner fortsatt bruk av kulturavhengig isolasjon. Dyrking er imidlertid ofte betydelig mer tidkrevende og krever mer personell til å utføre forsøkene. Derfor har protokollen blitt optimalisert og strømlinjeformet for raskere behandling med begrenset personell. Den største fordelen med dyrking er at de identifiserte gjærartene er levende gjær og ikke døde, og dermed er det mer sannsynlig at de er sanne jordboere i stedet for forbigående celler som er tilstede i jordene. Det har blitt anslått at omtrent 40% av sopp-DNA i jord enten er forurensninger fra andre miljøer, ekstracellulære, eller kommer fra celler som ikke lenger er intakte, noe som forårsaker sekvenseringsmetoder med høy gjennomstrømning for å overvurdere sopprikdom med så mye som 55% 13. Kulturavhengig isolasjon kan lett bekrefte gjærartens identitet med den ekstra fordelen av å sikre ren kultur som skal brukes i nedstrømsanalyser. Faktisk ble rene kulturer av 44 antatte nye gjærarter identifisert ved hjelp av denne jordisolasjonsprotokollen som tillot bruk av en rekke metoder for å studere deres taksonomiske og funksjonelle egenskaper i detalj14.
Protokollen nedenfor kan også brukes til å isolere muggsopp som finnes i jord, for eksempel A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk form med en bred, global fordeling i jord15. Det har blitt isolert fra mange kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøvetaking inkluderer vanligvis luft, organisk avfall (kompost, sagstøv, tulipanpæreavfall) og jord (landbruks-, hage- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen som forårsaker en rekke infeksjoner som samlet kalles aspergillose, som påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden16,20. Omtrent 300 000 mennesker over hele verden lider av invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige formen for aspergillose16. Avhengig av faktorer som pasientpopulasjonen, infeksjonsstedet og effekten av antifungal terapi, kan dødeligheten være så høy som 90%. I løpet av de siste tiårene har motstanden mot antifungal terapi økt, noe som krever global overvåkingsinnsats i både kliniske og miljømessige populasjoner for å spore disse resistensgenotypene 21,22,23. Gitt sin evne til å vokse ved temperaturer over 50 ° C, kan denne temperaturen utnyttes til å velge for A. fumigatus isolater fra jord ved hjelp av kulturavhengige metoder. Aspergillus fumigatus isolater genotypes vanligvis ved ni svært polymorfe korte tandem repeterende (STR) loci, vist å ha høy diskriminerende kraft mellom stammer24. Disse STR-genotypene kan sammenlignes med andre tidligere undersøkte populasjoner for å spore spredningen av A. fumigatus-genotyper, inkludert stoffresistensgener, rundt om i verden.
Nedenfor beskriver vi en protokoll for rask isolering av gjær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturavhengig måte. Avhengig av mengden jord oppnådd per prøve, kan jordprøvene deles mellom de to protokollene. Sammenlignet med lignende metoder som isolerer gjær og A. fumigatus fra jord, bruker denne protokollen 10 ganger mindre jord per oppnådd isolat. Studier som forsøker å isolere A. fumigatus fra jord krever mellom 1 og 2 g jord per isolat, mens denne protokollen krever bare 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokollen benytter mindre plast og beholdere som letter den høye gjennomstrømningsdesignen. Derfor kan et større antall prøver behandles med mindre plass til utstyr som inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fullt ut for å oppnå isolater på så lite som 7 dager. Denne protokollen er optimalisert for å tillate behandling av opptil 150-200 prøver per dag per person.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Jord er vert for en utrolig mengde mikrobielt liv, med hvert gram som inneholder opptil milliarder bakterielle, arkeale og soppceller. Multicellulære sopp som mugg og encellede sopp, bredt definert som gjær, oppfyller viktige roller i jordøkosystemer som nedbrytere av organisk materiale og som matkilder for andre jordboere. Svampeartenes mangfold i jord er avhengig av en rekke klimatiske faktorer som nedbør og temperatur, samt jordegenskaper, inkludert organisk materiale, pH og fuktighet. Mangel på tilstrekkelig miljøprøvetaking, spesielt i regioner i Asia, Afrika, Sør-Amerika og Mellom-Amerika, hindrer karakterisering av jordsoppsamfunn og oppdagelsen av nye arter. 
Vi karakteriserte jordsoppsamfunn i ni land på seks kontinenter ved hjelp av ~ 4000 jordprøver og en protokoll utviklet i laboratoriet for isolering av gjær og mugg. Denne protokollen begynner med separat selektiv anrikning for gjær og den medisinsk relevante formen Aspergillus fumigatus, i flytende medier mens den hemmer bakterievekst. Resulterende kolonier overføres deretter til faste medier og viderebehandles for å oppnå rene kulturer, etterfulgt av nedstrøms genetisk karakterisering. Gjærartens identitet etableres via sekvensering av deres interne transkriberte spacer (ITS) -region av den nukleære ribosomale RNA-genklyngen, mens den globale populasjonsstrukturen til A. fumigatus utforskes via mikrosatellittmarkøranalyse. 
Protokollen ble vellykket brukt til å isolere og karakterisere jordgjær og A. fumigatuspopulasjoner i Kamerun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabia. Disse funnene avslørte sårt tiltrengt innsikt i globale mønstre i jordgjærdiversitet, samt global befolkningsstruktur og antifungale motstandsprofiler av A. fumigatus. Denne artikkelen presenterer metoden for å isolere både gjær og A. fumigatus fra internasjonale jordprøver.

Gjærisolasjon fra jord Ovennevnte gjærisolasjonsprotokoll ble implementert for å dyrke gjær fra jordprøver som stammer fra 53 steder i ni land 9,12. Totalt ble 1.473 gjærstammer isolert fra 3.826 jordprøver. Gitt de forskjellige klimatiske forholdene i de ni opprinnelseslandene, ble den beste inkubasjonstemperaturen for hvert land bestemt basert på den gjennomsnittlige årlige temperaturen (tabell 1). Gitt den langsomm...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Denne protokollen er en effektiv, rask metode for dyrking av gjær og formen Aspergillus fumigatus fra store sett med jordprøver på så lite som 7 dager. Metodene kan enkelt modifiseres for å imøtekomme en rekke inkubasjonsmedier og temperaturer etter behov for eksperimenter.

Isolering av dyrkbar gjær og mugg fra jord for å undersøke sopppopulasjonsstruktur

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Vår protokoll undersøker gjær- og muggdiversitet i jord ved hjelp av jordprøver hentet fra forskjellige klimatiske regioner. Dette gir innsikt i miljømessig gjærdiversitet og bidrar til å spore patogene arter. Protokollen tilbyr en kostnadseffektiv og rask metode for høsting av gjær og mugg fra jorda.Jordprøver kan behandles fullt ut for å oppnå isolater på så lite som syv dager. Godt organisert eksperimentelt oppsett, for eksempel merking av kulturrør og forberedelse av media en dag i forveien, er nøkkelen til å unngå å føle seg overveldet under eksperimentet. Begynn med å forberede et sett med sterile 13 milliliter kulturrør.Ved å merke dem med jordprøve-ID, bruk deretter en serologisk pipette for å legge til fem milliliter gjærekstrakt-pepton-druesukkerbuljong supplert med kloramfenikol og benomyl i hvert rør. Inne i et biosikkerhetsskap for nivå to organismer, overfør ca. 0,1 gram jord til riktig kulturrør ved hjelp av en steril treplanspissapplikator. Lukk røret sikkert til første stopp, og forhindre søl samtidig som luftutvekslingen tillates under inkubasjon.Deretter inkuberer kulturrørene i en rulletrommel i 24 timer ved en temperatur som anses optimal for å maksimere gjærveksten. Merk deretter kloramfenikol og benomyltilskuddt gjærekstrakt pepton-dextrose agarplater med jordprøve-ID før du overfører supernatanten til det faste mediet. Fjern kulturrørene fra rulletrommelen.Deretter inne i et biosikkerhetsskap for nivå to organismer, kort virvel røret for å trekke jordpartikler og celler som kan ha avgjort på bunnen tilbake i suspensjon. Deretter overfører du 100 mikroliter av supernatanten til en plate ved hjelp av en mikropipette. Bruk en steril gjenbrukbar cellespreder for å spre væsken grundig og jevnt over agaroverflaten.Etter å ha gitt tilstrekkelig inkubasjonstid på to til tre dager, inspiser platene for gjærvekst inne i et biosikkerhetsskap for nivå to organismer. Se etter kremete, runde, matte gjær som lett kan skilles fra bakterie- og muggkolonier. Velg en gjærlignende koloni fra hver plate ved hjelp av sterile treslettede applikatorpinner.Overfør hver utvalgte koloni til et ferskt gjærekstrakt pepton-dextro agarplater supplert med kloramfenikol og benomyl og strek for enkeltkolonier. Utfør tre separate striper og bruk en ny applikatorpinne for hver strek. Deretter bruker du friske celler utviklet på en plate for å utføre en kolonipolymerasekjedereaksjon.Bruk interne transkriberte avstandsstykker ITS1 og ITS4 primere for å forsterke soppstangkodingsgenet. Sammenlign den oppnådde interne transkriberte avstandssekvensen av gjærstammene, to sekvenser deponert i offentlige databaser, for eksempel National Center for Biotechnology Information GenBank og UNITE for å etablere artsidentitet. Legg jord til 1,5 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder en milliliter Sabouraud druesukkerbuljong og ruge ved 50 grader Celsius i to til fire dager.For å overføre mycelia fra jordinokulert kjøttkraft på maltekstraktagarplater, identifiser først jordens inokulum som har synlig mycelvekst, legg til Sabouraud dextrose-buljongen til luftgrensen. Bruk deretter steriliserte tre vanlig spiss applikatorpinner for å overføre mycelia til midten av en malt ekstrakt agar plate og inkubere disse malt ekstrakt agar plate sett 37 grader Celsius i tre dager. For valg av mycelia, med Aspergillus fumigatus morfologiske egenskaper, identifiser muggkoloniene som har karakteristisk grønn svinglignende vekst.Inne i et biosikkerhetsskap for nivå to organismer, høst conidia eller mycelia ved å skrape overflaten en gang ved hjelp av steriliserte treplanspissapplikatorpinner eller en inokulasjonssløyfe og overfør den til midten av en maltekstraktagarplate ved å strekke seg på agaren for enkeltkolonier. Inkuber platene ved 37 grader Celsius i to dager. Ved hjelp av en steril applikasjonspinne eller inokulasjonssløyfe genererte subkultur en enkelt koloni på maltekstraktagar ved å strekke kolonien en gang.Spred de høstede sporene inn i midten av platen. Forbered en steril 30% glyserolløsning for å høste Aspergillus fumigatus sporer eller mycelia for kulturlagring. Etter de to dagene med inkubasjon av agarplatene ved 37 grader Celsius, aspirer en milliliter av 30% glyseroloppløsningen ved hjelp av en pipette og spre den på Aspergillus fumigatus-kolonien.For fenotypisk identifisering av Aspergillus fumigatus stammer, aspirere 10 mikroliter av mycelial og spore aksjer for å legge i 990 mikroliter vann. Vortex denne fortynnede spore suspensjonen og dispensere 10 mikroliter av suspensjonen på en standard mikroskop lysbilde. Deretter bruker du et sammensatt mikroskop ved 400X forstørrelse, se suspensjonen og finn konidioforer.Sammenlign den observerte konidioformorfologien med Aspergillus fumigatus conidiophore morfologi. For å bestemme riktig fragmentstørrelse for hver av de ni mikrosatellittlokiene, bruk programvare som er i stand til fragmentanalyse. Hent rådata hentet fra kapillærelektroforese og score fragmentstørrelsene basert på den største toppen ved hjelp av den fragmenterte analyseprogramvaren.Deretter konverterer du fragmentstørrelsene til gjentatte tall for hver av de ni lave, og bruker fragmentstørrelsene til repetisjonsnumrene til referansestammen Af293. Fra 3.826 jordprøver samlet inn fra 53 steder i ni land, ble 1.473 gjærstammer isolert. Den beste inkubasjonstemperaturen for hvert land ble bestemt basert på sin gjennomsnittlige årlige temperatur.I sjeldne analyser for hvert land ble Shannon mangfoldsindeks brukt som et mål på jordgjærdiversitet. De resulterende sjeldenhetskurvene nærmet seg metningsasymptoten, noe som indikerer at ytterligere prøvetaking sannsynligvis ikke hadde gitt mer gjærdiversitet. Mycelial vekst på plater dannet den grønne svingete morfologien som er typisk for Aspergillus fumigatus.Andre termotolerante sopparter kan være til stede i samme jordprøve og dyrke Aspergillus fumigatus på samme plate eller av seg selv. Aspergillus fumigatus conidiophore struktur sett og identifisert ved hjelp av lysmikroskopi avslørte at konidioforer har en ball på pinnemorfologien og konidioforer er uniseriate, hvor phialidene festet til konidiakjedene er festet direkte til den sfæriske vesiklet. Et kromatogram generert biseriat avslørte de tre kanalene som visualiserer fragmentlengdene til Aspergillus fumigatus dinukleotid, trinukleotid og tetranukleotid korte tandemrepetisjoner loci.Et minimumsspesongnettverk av høy kvalitet kan genereres ved hjelp av R-skriptet plot_poppr_msn eller imsn. En diskriminerende analyse av prinsippkomponenter er en annen metode for å visualisere de genetiske forholdene mellom stammer. Tilsetning av benomyl og kloramfenikol til vekstmedier forhindrer henholdsvis mugg og bakterievekst, og favoriserer gjærvalg.Kloramfenikol reduserer også gjæring i media, senker gassoppbygging i inkuberingsrør. Å utføre metagenomikk på jordprøver vil gi ytterligere informasjon om kulturelt mangfold. Mottakelig testing av A.fumigatus-stammer vil identifisere tilstedeværelsen av resistensgenotyper.Denne protokollen kan brukes på andre gjær- og muggsystemer med liten modifikasjon. Det gjorde det lettere å undersøke kulturelt jordgjærdiversitet og dets prediktorer på global skala.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av Small kodende RNA fra Menneskelig Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av myofibroblasts fra Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Vedlikehold av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Fjerning av eksogene materialer fra den ytre delen av frosne kjerner for å undersøke den gamle biologiske samfunn skjult Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolering og karakterisering av mikrovesikler fra perifert blod

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...