Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant No. ALLRP 570780-2021) e Universidade McMaster.

NOTA: Quaisquer etapas utilizando amostras internacionais de solo e/ou esporos de fumigatus e micélios requerem o trabalho dentro de um gabinete de biossegurança para organismos de nível 2 (BSCII).
1. Isolamento da levedura do solo
<ol><li>Preparação de soluções antibacterianas e antifúngicas<ol>
<li>Suspenda o pó de clororamfenícol em 70% de etanol para preparar uma solução de estoque de 50 g/L. Esterilize por filtragem de seringa e armazene a 4 °C.<br...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. 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O protocolo desenvolvido para isolar leveduras e A. fumigatus do solo é um método rápido e eficiente para processamento de solo de alto rendimento e isolamento fúngico. O protocolo requer apenas uma pequena quantidade de solo (0,1-0,2 g) por amostra, permitindo que mais locais sejam amostrados com esforço semelhante. O tempo de retorno rápido garante que os resultados possam ser obtidos em um curto espaço de tempo e permite tempo para solução de problemas e repetição de experimentos, se necessário. E...

Os fungos nos ecossistemas do solo desempenham papéis essenciais na decomposição da matéria orgânica, no ciclismo de nutrientes e na fertilização do solo1. Tanto abordagens independentes da cultura (ou seja, sequenciamento de alto rendimento) quanto abordagens dependentes da cultura são amplamente utilizadas no estudo dos fungos do solo 2,3. Embora a grande quantidade de dados gerados pelo sequenciamento de metabarcode de alto rendimento seja útil para a elucidação de padrões em larga escala na estrutura comunitária e na diversidade, a abordagem dependente da cultura pode fornecer informações altamente complementares sobre as estruturas taxonômicas e funcionais das comunidades fúngicas, bem como perfis mais específicos de organismos individuais através da diversidade a jusante e análises funcionais devido à disponibilidade de culturas fúngicas puras.
Apesar de raramente exceder milhares de células por grama de solo, as leveduras, amplamente definidas como fungos unicelulares, são decompodoras essenciais e fontes de alimento para outros moradores do solo 4,5. Na verdade, as leveduras podem ser os fungos do solo predominantes em biosferas frias, como a Antártida continental 6,7. O solo também é um reservatório primário de leveduras medicamente relevantes que causam infecções oportunistas graves em humanos e outros mamíferos8. Apesar das semelhanças morfológicas, as espécies de levedura são filogeneticamente diversas e ocorrem entre fungos filamentosos em dois filos, Ascomycota e Basidiomycota, dentro do reino fúngico9. As leveduras não possuem uma assinatura de DNA definidora no gene de codificação de barras fúngicas, a região interna do espaçador transcrito (ITS) do aglomerado genético RNA ribossômiconuclear 10, tornando-as indistinguíveis de outros fungos em investigações metagenômicas e, assim, exigindo o uso de métodos dependentes da cultura para isolar espécies de leveduras.
O protocolo abaixo foi implementado para caracterizar comunidades de leveduras de solo de nove países e identificar tendências e padrões globais na diversidade de leveduras do solo 9,11,12. As abordagens metagenômicas são de uso limitado ao estudar grupos direcionados de organismos como leveduras 2,3. Devido à sua diversidade filogenética, as leveduras não podem ser distinguidas de outros fungos baseados apenas na sequência de DNA. Assim, estudar populações de leveduras requer o uso contínuo do isolamento dependente da cultura. No entanto, a cultura é muitas vezes significativamente mais demorada e requer mais pessoal para realizar os experimentos. Portanto, o protocolo foi otimizado e simplificado para um processamento mais rápido com pessoal limitado. A principal vantagem da colheita é que as espécies de leveduras identificadas são leveduras vivas e não mortas, e, portanto, são mais propensas a serem verdadeiros moradores do solo do que células transitórias presentes nos solos. Estima-se que aproximadamente 40% do DNA fúngico no solo são contaminantes de outros ambientes, extracelulares, ou vêm de células que não estão mais intactas, causando abordagens de sequenciamento de alto rendimento para superestimar a riqueza fúngica em até 55%13. O isolamento dependente da cultura pode confirmar prontamente a identidade das espécies de leveduras com o benefício adicional de garantir a cultura pura para ser usada em análises a jusante. De fato, culturas puras de 44 espécies putativas de novas leveduras foram identificadas usando este protocolo de isolamento do solo que permitiu o uso de uma série de métodos para estudar suas propriedades taxonômicas e funcionais no detalhe14.
O protocolo abaixo também pode ser usado para isolar moldes presentes no solo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus é um molde termofílico e saprofítico com ampla distribuição global no solo15. Foi isolado de inúmeros ambientes clínicos e não clínicos. A amostragem não clínica geralmente inclui ar, detritos orgânicos (composto, pó de serra, resíduos de bulbos de tulipas) e solo (solos agrícolas, de jardim e naturais)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus é um patógeno oportunista humano que causa uma série de infecções coletivamente denominadas aspergillose, afetando mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo, 16,20. Aproximadamente 300.000 pessoas em todo o mundo sofrem de aspergillose invasiva, que é a forma mais grave de aspergillose16. Dependendo de fatores como a população do paciente, local de infecção e eficácia da terapia antifúngica, a taxa de mortalidade pode ser de até 90%. Nas últimas décadas, a resistência às terapias antifúngicas aumentou, exigindo esforços globais de vigilância tanto em populações clínicas quanto ambientais para rastrear esses genótipos de resistência 21,22,23. Dada a sua capacidade de crescer a temperaturas acima de 50 °C, esta temperatura pode ser explorada para selecionar para A. fumigatus isolados do solo usando métodos dependentes da cultura. Os isolados aspergillus fumigatus são comumente genótipos em nove loci de repetição de tandem curto altamente polimórfico (STR), mostrando ter alto poder discriminatório entre cepas24. Esses genótipos str podem ser comparados com outras populações previamente pesquisadas para rastrear a disseminação de genótipos A. fumigatus, incluindo genes de resistência a drogas, em todo o mundo.
Abaixo descrevemos um protocolo para o isolamento rápido de leveduras e A. fumigatus a partir de amostras de solo de forma dependente da cultura. Dependendo da quantidade de solo obtida por amostra, as amostras de solo podem ser compartilhadas entre os dois protocolos. Em comparação com métodos similares que isolam leveduras e A. fumigatus do solo, este protocolo utiliza 10x menos solo por isolado obtido. Estudos que tentam isolar A. fumigatus do solo requerem entre 1 e 2 g de solo por isolante, enquanto este protocolo requer apenas 0,1-0,2 g de solo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos e recipientes menores que facilitam seu design de alta produtividade. Portanto, um número maior de amostras pode ser processado usando menos espaço para equipamentos como incubadoras e tambores de rolo. As amostras de solo podem ser totalmente processadas para obter isolados em apenas 7 dias. Este protocolo foi otimizado para permitir o processamento de até 150-200 amostras por dia por pessoa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

O solo é hospedeiro de uma quantidade incrível de vida microbiana, com cada grama contendo até bilhões de células bacterianas, arqueais e fúngicas. Fungos multicelulares, como moldes e fungos unicelulares, amplamente definidos como leveduras, cumprem papéis essenciais nos ecossistemas do solo como decomposição de material orgânico e como fontes de alimento para outros moradores do solo. A diversidade de espécies fúngicas no solo depende de uma infinidade de fatores climáticos, como chuvas e temperatura, bem como propriedades do solo, incluindo matéria orgânica, pH e umidade. A falta de amostragem ambiental adequada, especialmente em regiões da Ásia, África, América do Sul e América Central, dificulta a caracterização das comunidades fúngicas do solo e a descoberta de novas espécies. 
Caracterizamos comunidades fúngicas do solo em nove países em seis continentes usando ~4.000 amostras de solo e um protocolo desenvolvido em laboratório para o isolamento de leveduras e moldes. Este protocolo começa com enriquecimento seletivo separado para leveduras e o molde medicamente relevante Aspergillus fumigatus, em mídia líquida enquanto inibe o crescimento bacteriano. As colônias resultantes são então transferidas para mídias sólidas e processadas para obter culturas puras, seguidas pela caracterização genética a jusante. A identidade das espécies de leveduras é estabelecida através do sequenciamento de sua região espacial transcrita interna (ITS) do aglomerado genético ribossômico nuclear RNA, enquanto a estrutura populacional global de A. fumigatus é explorada através da análise de marcadores microsatélites. 
O protocolo foi aplicado com sucesso para isolar e caracterizar as populações de leveduras de solo e A. fumigatus nos Camarões, Canadá, China, Costa Rica, Islândia, Peru, Nova Zelândia e Arábia Saudita. Esses achados revelaram insights muito necessários sobre padrões globais na diversidade de leveduras do solo, bem como estrutura populacional global e perfis de resistência antifúngica de A. fumigatus. Este artigo apresenta o método de isolar as duas leveduras e a. fumigatus de amostras internacionais de solo.

Isolamento da levedura do solo O protocolo de isolamento da levedura acima foi implementado para cultivar leveduras a partir de amostras de solo originárias de 53 locais em nove países 9,12. No total, 1.473 cepas de levedura foram isoladas de 3.826 amostras de solo. Dadas as diferentes condições climáticas dos nove países originários, a melhor temperatura de incubação para cada país foi determinada com base em sua temperatura média ...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Nosso protocolo investiga a diversidade de leveduras e moldes no solo usando amostras de solo obtidas de diferentes regiões climáticas. Isso fornece insights sobre a diversidade ambiental da levedura e ajuda a rastrear espécies patogênicas. O protocolo oferece um método econômico e rápido de colheita de leveduras e mofo do solo.As amostras de solo podem ser totalmente processadas para obter isolados em apenas sete dias. A configuração experimental bem organizada, como rotular tubos de cultura e preparar a mídia com um dia de antecedência, é a chave para evitar se sentir sobrecarregado durante o experimento. Comece com a preparação de um conjunto de tubos de cultura estéreis de 13 mililitros.Rotulando-os com iD amostra de solo, em seguida, use uma pipeta sorológica para adicionar cinco mililitros de levedura extrato-peptone-dextrose caldo complementado com clorofenicol e benomil em cada tubo. Dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois, transfira aproximadamente 0,1 gramas de solo para o tubo de cultura apropriado usando um aplicador de ponta de couro de madeira estéril. Tampe o tubo com segurança para a primeira parada, evitando derramamentos enquanto permite a troca de ar durante a incubação.Em seguida, incubar os tubos de cultura em um tambor de rolo por 24 horas a uma temperatura considerada ótima para maximizar o crescimento da levedura. Em seguida, rotule o clororamfenicol e o extrato de levedura suplementada de benomíl com placas de ágar com a identificação da amostra do solo antes de transferir o supernatante para o meio sólido. Remova os tubos de cultura do tambor de rolo.Em seguida, dentro de um gabinete de biossegurança para organismos de nível dois, brevemente vórtice do tubo para desenhar partículas de solo e células que podem ter se estabelecido no fundo de volta à suspensão. Em seguida, transfira 100 microliters do supernatante para uma placa usando uma micropipette. Use um espalhador de células reutilizáveis estéreis para espalhar o líquido completamente e uniformemente sobre a superfície do ágar.Depois de permitir tempo suficiente de incubação de dois a três dias, inspecione as placas para qualquer crescimento de levedura dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois. Procure por leveduras cremosas, redondas e foscas que podem ser facilmente distinguidas das colônias bacterianas e de moldes. Selecione uma colônia semelhante a um fermento de cada placa usando varas de aplicadora de madeira estéril.Transfira cada colônia selecionada para um extrato de levedura fresco peptone-dextro agar placas complementadas com clororamfenicol e benomyl e listras para colônias únicas. Execute três raias separadas e use uma nova vara aplicadora para cada raia. Em seguida, use células frescas desenvolvidas em uma placa para realizar uma reação em cadeia de polimerase colônia.Use esprizadores transcritos internos ITS1 e PRIMERs ITS4 para amplificar o gene de codificação da barra fúngica. Compare a sequência espacial transcrita interna obtida das cepas de levedura, duas sequências depositadas em bancos de dados públicos, como o National Center for Biotechnology Information GenBank e a UNITE para estabelecer a identidade das espécies. Adicione o solo a tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de caldo de dextrose Sabouraud e incubar a 50 graus Celsius por dois a quatro dias.Transferir a micélia do caldo inoculado do solo para placas de ágar extrato de malte, primeiro, identificar os inóculos do solo que têm crescimento micelial visível adicionam o caldo de dextrose Sabouraud à fronteira de ar. Em seguida, use varas de aplicador de ponta de madeira esterilizada para transferir a micélia para o centro de uma placa de ágar extrato de malte e incubar estes extratos de malte ágais conjuntos 37 graus Celsius por três dias. Para a seleção da micélia, com propriedades morfológicas Aspergillus fumigatus, identifique as colônias de moldes que têm crescimento verde-influenciado característico.Dentro de um armário de biossegurança para organismos de nível dois, colhe conidia ou micélio raspando a superfície uma vez usando varas de aplicador de ponta de couro de madeira esterilizada ou um laço de inoculação e transferi-lo para o centro de uma placa de ágar extrato de malte, listrando-se sobre o ágar para colônias únicas. Incubar as placas a 37 graus Celsius por dois dias. Usando uma vara de aplicação estéril ou laço de inoculação, subcultura uma única colônia gerada em ágar extrato de malte, espalhando a colônia uma vez.Espalhe os esporos colhidos no centro da placa. Prepare uma solução estéril de 30% de glicerol para colher os esporos de fumigatus Aspergillus ou micélio para armazenamento de cultura. Após os dois dias de incubação das placas de ágar a 37 graus Celsius, aspire um mililitro da solução de 30% glicerol usando uma pipeta e disperse-a para a colônia Aspergillus fumigatus.Para identificação fenotípica das cepas Aspergillus fumigatus, aspire 10 microliters dos estoques de micélio e esporos para adicionar em 990 microliters de água. Vórtice esta suspensão diluída de esporos e dispensar 10 microlitros da suspensão em um slide de microscópio padrão. Em seguida, usando um microscópio composto na ampliação de 400X, visualize a suspensão e localize os conidioforos.Compare a morfologia conidiophore observada com a morfologia aspergillus fumigatus conidiophore. Para determinar o tamanho correto do fragmento para cada um dos nove loci micro-satélites, use um software capaz de analisar fragmentos. Recupere os dados brutos obtidos da eletroforese capilar e ecore os tamanhos dos fragmentos com base no maior pico usando o software de análise fragmentado.Em seguida, converta os tamanhos dos fragmentos em números repetidos para cada um dos nove baixos use os tamanhos de fragmento dos números repetidos da cepa de referência Af293. De 3.826 amostras de solo coletadas em 53 locais em nove países, 1.473 cepas de levedura foram isoladas. A melhor temperatura de incubação para cada país foi determinada com base em sua temperatura média anual.Na análise de rarefação para cada país, o índice de diversidade de Shannon foi usado como medida da diversidade da levedura do solo. As curvas de rarefação resultantes se aproximaram da assíntota de saturação indicando que a amostragem adicional não teria rendido mais diversidade de leveduras. O crescimento micelial em placas formou a morfologia verde influenciada típica de Aspergillus fumigatus.Outras espécies fúngicas termotolerantes podem estar presentes na mesma amostra de solo e cultivar o Aspergillus fumigatus na mesma placa ou por si mesmas. Aspergillus fumigatus conidiophore estrutura vista e identificada por meio de microscopia leve revelou que os conidioforos têm uma bola na morfologia da vara e os conidioforos são uniseriados, onde os fálios ligados às cadeias de conidia são anexados diretamente à vesícula esférica. Um biserinato gerado por cromograma revelou os três canais visualizando os comprimentos fragmentos de Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinucleotídeo e tetranucleotídeo curto tandem repete loci.Uma rede de abrangência mínima de alta qualidade pode ser gerada usando o script R plot_poppr_msn ou imsn. Uma análise discriminatória dos componentes-princípio é outro método para visualizar as relações genéticas entre as cepas. Adicionar benomyl e clororamfenicol à mídia de crescimento impede o crescimento de mofo e bactérias, respectivamente, e favorece a seleção de leveduras.O clorofenicol também reduz a fermentação na mídia, reduzindo o acúmulo de gás em tubos incubadores. A realização de metagenômicas em amostras de solo fornecerá informações adicionais sobre diversidade cultural. Testes suscetíveis de cepas de A.fumigatus identificarão a presença de genótipos de resistência.Este protocolo pode ser aplicado a outros sistemas de leveduras e moldes com pouca modificação. Facilitou a investigação da diversidade cultural da levedura do solo e seus preditores em escala global.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

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The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

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Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

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Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

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