Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
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Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención No. ALLRP 570780-2021) y McMaster University.

NOTA: Cualquier paso que utilice muestras internacionales de suelo y / o esporas y micelios de A. fumigatus requiere trabajar dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel 2 (BSCII).
1. Aislamiento de levadura del suelo
<ol><li>Preparación de soluciones antibacterianas y antifúngicas<ol>
<li>Suspenda el polvo de cloranfenicol en etanol al 70% para preparar una solución madre de 50 g/L. Esterilizar mediante filtración con jeringa y conservar a 4 ...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. 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A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

El protocolo desarrollado para aislar levaduras y A. fumigatus del suelo es un método rápido y eficiente para el procesamiento de suelos de alto rendimiento y el aislamiento de hongos. El protocolo solo requiere una pequeña cantidad de suelo (0.1-0.2 g) por muestra, lo que permite muestrear más sitios con un esfuerzo similar. El rápido tiempo de respuesta garantiza que los resultados se puedan obtener en un corto período de tiempo y permite tiempo para solucionar problemas y repetir experimentos si es nece...

Los hongos en los ecosistemas del suelo desempeñan un papel esencial en la descomposición de la materia orgánica, el ciclo de nutrientes y la fertilización del suelo1. Tanto los enfoques independientes del cultivo (es decir, secuenciación de alto rendimiento) como los centrados en el cultivo son ampliamente utilizados en el estudio de los hongos del suelo 2,3. Si bien la gran cantidad de datos generados por la secuenciación de metacódigo de barras de alto rendimiento es útil para dilucidar patrones a gran escala en la estructura y diversidad de la comunidad, el enfoque dependiente de la cultura puede proporcionar información altamente complementaria sobre las estructuras taxonómicas y funcionales de las comunidades de hongos, así como perfiles más específicos de organismos individuales a través de la diversidad aguas abajo y los análisis funcionales debido a la disponibilidad de cultivos de hongos puros.
A pesar de que rara vez superan los miles de células por gramo de suelo, las levaduras, ampliamente definidas como hongos unicelulares, son descomponedores esenciales y fuentes de alimento para otros habitantes del suelo 4,5. De hecho, las levaduras pueden ser los hongos predominantes del suelo en biosferas frías como la Antártida continental 6,7. El suelo es también un reservorio primario de levaduras médicamente relevantes que causan infecciones oportunistas graves en humanos y otros mamíferos8. A pesar de las similitudes morfológicas, las especies de levadura son filogenéticamente diversas y se encuentran entre los hongos filamentosos en dos filos principales, Ascomycota y Basidiomycota, dentro del reino fúngico9. Las levaduras carecen de una firma de ADN definitoria en el gen de código de barras fúngico, la región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear10, lo que las hace indistinguibles de otros hongos en las investigaciones de metagenómica y, por lo tanto, requieren el uso de métodos dependientes del cultivo para aislar especies de levaduras.
El siguiente protocolo se implementó para caracterizar las comunidades de levadura del suelo de nueve países e identificar las tendencias y patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo 9,11,12. Los enfoques de metagenómica son de uso limitado cuando se estudian grupos específicos de organismos como las levaduras 2,3. Debido a su diversidad filogenética, las levaduras no se pueden distinguir de otros hongos basándose solo en la secuencia de ADN. Por lo tanto, el estudio de las poblaciones de levadura requiere el uso continuo del aislamiento dependiente del cultivo. Sin embargo, el cultivo a menudo consume mucho más tiempo y requiere más personal para realizar los experimentos. Por lo tanto, el protocolo se ha optimizado y optimizado para un procesamiento más rápido con personal limitado. La principal ventaja del cultivo es que las especies de levadura identificadas son levaduras vivas y no muertas, y por lo tanto es más probable que sean verdaderos habitantes del suelo en lugar de células transitorias presentes en los suelos. Se ha estimado que aproximadamente el 40% del ADN fúngico en el suelo son contaminantes de otros ambientes, extracelulares, o provienen de células que ya no están intactas, lo que provoca enfoques de secuenciación de alto rendimiento para sobreestimar la riqueza de hongos hasta en un 55%13. El aislamiento dependiente del cultivo puede confirmar fácilmente la identidad de las especies de levadura con el beneficio adicional de asegurar el cultivo puro para ser utilizado en análisis posteriores. De hecho, se identificaron cultivos puros de 44 nuevas especies de levaduras putativas utilizando este protocolo de aislamiento del suelo que permitió el uso de una variedad de métodos para estudiar sus propiedades taxonómicas y funcionales en detalle14.
El siguiente protocolo también se puede utilizar para aislar mohos presentes en el suelo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus es un moho termófilo y saprófito con una amplia distribución global en el suelo15. Se ha aislado de numerosos entornos clínicos y no clínicos. El muestreo no clínico comúnmente incluye aire, desechos orgánicos (compost, polvo de sierra, desechos de bulbos de tulipanes) y suelo (suelos agrícolas, de jardín y naturales)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista humano que causa una serie de infecciones denominadas colectivamente aspergilosis, que afectan a más de 8 millones de personas en todo el mundo16,20. Aproximadamente 300.000 personas en todo el mundo sufren de aspergilosis invasiva, que es la forma más grave de aspergilosis16. Dependiendo de factores como la población de pacientes, el sitio de infección y la eficacia de la terapia antifúngica, la tasa de mortalidad puede ser tan alta como el 90%. En las últimas décadas, la resistencia a las terapias antifúngicas ha aumentado, lo que requiere esfuerzos de vigilancia global en poblaciones clínicas y ambientales para rastrear estos genotipos de resistencia 21,22,23. Dada su capacidad para crecer a temperaturas superiores a 50 °C, esta temperatura puede aprovecharse para seleccionar aislados de A. fumigatus del suelo utilizando métodos dependientes del cultivo. Los aislados de Aspergillus fumigatus se genotipan comúnmente en nueve loci de repetición corta en tándem (STR) altamente polimórficos, que han demostrado tener un alto poder discriminatorio entre cepas24. Estos genotipos STR se pueden comparar con otras poblaciones previamente encuestadas para rastrear la propagación de los genotipos de A. fumigatus, incluidos los genes de resistencia a los medicamentos, en todo el mundo.
A continuación describimos un protocolo para el aislamiento rápido de levaduras y A. fumigatus de muestras de suelo de una manera dependiente del cultivo. Dependiendo de la cantidad de suelo obtenido por muestra, las muestras de suelo se pueden compartir entre los dos protocolos. En comparación con métodos similares que aíslan levadura y A. fumigatus del suelo, este protocolo utiliza 10 veces menos suelo por aislado obtenido. Los estudios que intentan aislar A. fumigatus del suelo requieren entre 1 y 2 g de suelo por aislado, mientras que este protocolo requiere solo 0.1-0.2 g de suelo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos y contenedores más pequeños que facilitan su diseño de alto rendimiento. Por lo tanto, se puede procesar un mayor número de muestras utilizando menos espacio para equipos como incubadoras y tambores. Las muestras de suelo se pueden procesar completamente para obtener aislamientos en tan solo 7 días. Este protocolo ha sido optimizado para permitir el procesamiento de hasta 150-200 muestras por día por persona.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

El suelo alberga una increíble cantidad de vida microbiana, y cada gramo contiene hasta miles de millones de células bacterianas, arqueas y fúngicas. Los hongos multicelulares como los mohos y los hongos unicelulares, ampliamente definidos como levaduras, cumplen funciones esenciales en los ecosistemas del suelo como descomponedores de material orgánico y como fuentes de alimento para otros habitantes del suelo. La diversidad de especies de hongos en el suelo depende de una multitud de factores climáticos como la lluvia y la temperatura, así como de las propiedades del suelo, incluida la materia orgánica, el pH y la humedad. La falta de un muestreo ambiental adecuado, especialmente en regiones de Asia, África, América del Sur y América Central, dificulta la caracterización de las comunidades de hongos del suelo y el descubrimiento de nuevas especies. 
Caracterizamos comunidades de hongos del suelo en nueve países de seis continentes utilizando ~ 4,000 muestras de suelo y un protocolo desarrollado en el laboratorio para el aislamiento de levaduras y mohos. Este protocolo comienza con un enriquecimiento selectivo separado para levaduras y el moho médicamente relevante Aspergillus fumigatus, en medios líquidos mientras inhibe el crecimiento bacteriano. Las colonias resultantes se transfieren a medios sólidos y se procesan posteriormente para obtener cultivos puros, seguidos de la caracterización genética posterior. La identidad de las especies de levadura se establece a través de la secuenciación de su región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear, mientras que la estructura de la población global de A. fumigatus se explora a través del análisis de marcadores de microsatélites. 
El protocolo se aplicó con éxito para aislar y caracterizar las poblaciones de levadura del suelo y A. fumigatus en Camerún, Canadá, China, Costa Rica, Islandia, Perú, Nueva Zelanda y Arabia Saudita. Estos hallazgos revelaron información muy necesaria sobre los patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo, así como la estructura de la población mundial y los perfiles de resistencia antifúngica de A. fumigatus. Este artículo presenta el método de aislamiento tanto de levaduras como de A. fumigatus a partir de muestras internacionales de suelo.

Aislamiento de levadura del suelo El protocolo de aislamiento de levaduras anterior se implementó para cultivar levaduras a partir de muestras de suelo originarias de 53 ubicaciones en nueve países 9,12. En total, se aislaron 1.473 cepas de levadura de 3.826 muestras de suelo. Dadas las diferentes condiciones climáticas de los nueve países de origen, la mejor temperatura de incubación para cada país se determinó en función de su temper...

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Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Nuestro protocolo investiga la diversidad de levaduras y mohos en el suelo utilizando muestras de suelo obtenidas de diferentes regiones climáticas. Esto proporciona información sobre la diversidad ambiental de levaduras y ayuda a rastrear especies patógenas. El protocolo ofrece un método rentable y rápido de cosechar levaduras y moho del suelo.Las muestras de suelo se pueden procesar completamente para obtener aislamientos en tan solo siete días. Una configuración experimental bien organizada, como etiquetar los tubos de cultivo y preparar los medios con un día de anticipación es la clave para evitar sentirse abrumado durante el experimento. Comience con la preparación de un conjunto de tubos de cultivo estériles de 13 mililitros.Al etiquetarlos con id de muestra de suelo, luego use una pipeta serológica para agregar cinco mililitros de caldo de extracto de levadura-peptona-dextrosa suplementado con cloranfenicol y benomilo en cada tubo. Dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, transfiera aproximadamente 0,1 gramos de suelo al tubo de cultivo apropiado utilizando un aplicador de punta plana de madera estéril. Cubra el tubo de forma segura hasta la primera parada, evitando derrames y permitiendo el intercambio de aire durante la incubación.A continuación, incube los tubos de cultivo en un tambor de rodillos durante 24 horas a una temperatura que se considere óptima para maximizar el crecimiento de la levadura. Luego etiquete las placas de agar peptona-dextrosa de extracto de levadura suplementadas con cloranfenicol y benomilo con la identificación de la muestra de suelo antes de transferir el sobrenadante al medio sólido. Retire los tubos de cultivo del tambor de rodillos.Luego, dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, vórtice brevemente el tubo para dibujar las partículas del suelo y las células que pueden haberse asentado en la parte inferior de nuevo en suspensión. A continuación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa usando una micropipeta. Use un esparcidor de células reutilizable estéril para esparcir el líquido de manera completa y uniforme sobre la superficie del agar.Después de permitir un tiempo de incubación suficiente de dos a tres días, inspeccione las placas para detectar cualquier crecimiento de levadura dentro de un gabinete de bioseguridad para detectar organismos de nivel dos. Busque levaduras cremosas, redondas y mates que puedan distinguirse fácilmente de las colonias bacterianas y de moho. Seleccione una colonia similar a la levadura de cada placa utilizando barras aplicadoras estériles de madera con punta lisa.Transfiera cada colonia seleccionada a un extracto de levadura fresca placas de agar peptona-dextro suplementadas con cloranfenicol y benomilo y raya para colonias individuales. Realice tres rayas separadas y use una nueva barra aplicadora para cada raya. A continuación, use células frescas desarrolladas en una placa para realizar una reacción en cadena de la colonia polimerasa.Utilice los espaciadores internos transcritos ITS1 e ITS4 para amplificar el gen de codificación de barras fúngicas. Comparar la secuencia del espaciador transcrito interno obtenido de las cepas de levadura, dos secuencias depositadas en bases de datos públicas, como el Centro Nacional de Información Biotecnológica GenBank y UNITE para establecer la identidad de la especie. Agregue tierra a los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan un mililitro de caldo de dextrosa Sabouraud e incube a 50 grados centígrados durante dos a cuatro días.Para transferir el micelio del caldo inoculado del suelo a las placas de agar de extracto de malta, primero, identifique los inóculos del suelo que tienen un crecimiento micelial visible, agregue el caldo de dextrosa Sabouraud al límite del aire. Luego use palitos aplicadores de punta lisa de madera esterilizados para transferir el micelio al centro de una placa de agar de extracto de malta e incube estas placas de agar de extracto de malta a 37 grados Celsius durante tres días. Para la selección de micelios, con propiedades morfológicas de Aspergillus fumigatus, identifique las colonias de moho que tienen un crecimiento característico de tipo verde balanceado.Dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel dos, recolecte conidios o micelios raspando la superficie una vez que use palos aplicadores de punta plana de madera esterilizados o un lazo de inoculación y transfiéralo al centro de una placa de agar de extracto de malta rayando en el agar para colonias individuales. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante dos días. Usando una barra de aplicación estéril o un bucle de inoculación, subcultiva una sola colonia generada en el agar de extracto de malta al rayar la colonia una vez.Extienda las esporas cosechadas en el centro de la placa. Prepare una solución estéril de glicerol al 30% para cosechar las esporas o micelios de Aspergillus fumigatus para el almacenamiento en cultivo. Después de los dos días de incubación de las placas de agar a 37 grados centígrados, aspire un mililitro de la solución de glicerol al 30% con una pipeta y disperse sobre la colonia de Aspergillus fumigatus.Para la identificación fenotípica de las cepas de Aspergillus fumigatus, aspire 10 microlitros de las existencias de micelios y esporas para agregar 990 microlitros de agua. Vórtice esta suspensión de esporas diluida y dispense 10 microlitros de la suspensión en un portaobjetos de microscopio estándar. Luego, utilizando un microscopio compuesto con un aumento de 400X, vea la suspensión y localice los conidióforos.Compare la morfología del conidióforo observada con la morfología del conidióforo de Aspergillus fumigatus. Para determinar el tamaño de fragmento correcto para cada uno de los nueve loci microsatélites, utilice un software capaz de análisis de fragmentos. Recupere los datos brutos obtenidos de la electroforesis capilar y califique los tamaños de los fragmentos en función del pico más grande utilizando el software de análisis fragmentado.A continuación, convierta los tamaños de fragmento en números repetidos para cada uno de los nueve bajos use los tamaños de fragmento de los números de repetición de la cepa de referencia Af293. De 3. 826 muestras de suelo recogidas en 53 ubicaciones en nueve países, se aislaron 1.473 cepas de levadura. La mejor temperatura de incubación para cada país se determinó en función de su temperatura media anual.En el análisis de rarefacción para cada país, se utilizó el índice de diversidad de Shannon como una medida de la diversidad de levaduras del suelo. Las curvas de rarefacción resultantes se acercaron a la asintota de saturación, lo que indica que no era probable que el muestreo adicional hubiera producido más diversidad de levaduras. El crecimiento micelial en las placas formó la morfología verde balanceada típica de Aspergillus fumigatus.Otras especies de hongos termotolerantes podrían estar presentes dentro de la misma muestra de suelo y cultivar el Aspergillus fumigatus en la misma placa o por sí mismos. La estructura del conidióforo de Aspergillus fumigatus vista e identificada mediante microscopía de luz reveló que los conidióforos tienen una bola en la morfología del palo y los conidióforos son uniseriados, donde los fialides unidos a las cadenas de conidios están unidos directamente a la vesícula esférica. Un biseriato generado por cromatograma reveló los tres canales que visualizan las longitudes de los fragmentos de Aspergillus fumigatus dinucleótido, trinucleótido y tetranucleótido corto en tándem repetidos loci.Se puede generar una red de expansión mínima de alta calidad utilizando el script R plot_poppr_msn o imsn. Un análisis discriminatorio de los componentes principales es otro método para visualizar las relaciones genéticas entre las cepas. La adición de benomilo y cloranfenicol a los medios de crecimiento previene el crecimiento de moho y bacterias, respectivamente, y favorece la selección de levaduras.El cloranfenicol también reduce la fermentación en los medios, disminuyendo la acumulación de gas en los tubos de incubación. La realización de metagenómica en muestras de suelo proporcionará información adicional sobre la diversidad cultural. Las pruebas susceptibles de cepas de A.fumigatus identificarán la presencia de genotipos de resistencia.Este protocolo se puede aplicar a otros sistemas de levadura y moho con poca modificación. Facilitó la investigación de la diversidad cultural de levaduras del suelo y sus predictores a escala global.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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