Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Denna forskning stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) och McMaster University.

OBS: Alla steg som använder internationella jordprover och / eller A. fumigatussporer och mycelia kräver att man arbetar i ett biosäkerhetsskåp för nivå 2-organismer (BSCII).
1. Isolering av jäst från jord
<ol><li>Framställning av antibakteriella och antifungala lösningar<ol>
<li>Suspendera kloramfenikolpulver i 70 % etanol för att bereda en stamlösning på 50 g/l. Sterilisera genom sprutfiltrering och förvara vid 4 °C. OBS: Detta antibiotikum komme...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivariate+analysis+of+soil+yeasts+isolated+from+a+latitudinal+gradient.">A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient.</a> Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).</li><li>Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).</li><li>Samarasinghe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+culturable+soil+yeast+diversity.">Global patterns in culturable soil yeast diversity.</a> iScience. 24 (10), 103098 (2021).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+DNA+barcoding.">Fungal DNA barcoding.</a> Genome. 59 (11), 913-932 (2016).</li><li>Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+yeasts+and+where+to+find+them:+the+discovery+of+a+predominantly+clonal+Cryptococcus+deneoformans+population+in+Saudi+Arabian+soils.">Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).</li><li>Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relationships+among+strains+of+culturable+yeasts+in+agricultural+soils+in+Cameroon.">Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity.">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+species+concepts+in+the+genomics+era.">Fungal species concepts in the genomics era.</a> Genome. 63 (9), 459-468 (2020).</li><li>Brakhage, A. A., Langfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menacing+mold:+The+molecular+biology+of+Aspergillus+fumigatus.">Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus.</a> Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).</li><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+multi-national+prevalence+of+fungal+diseases-Estimate+precision.">Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision.</a> Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).</li><li>Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Protokollet som utvecklats för att isolera jäst och A. fumigatus från jord är en snabb och effektiv metod för jordbearbetning med hög kapacitet och svampisolering. Protokollet kräver endast en liten mängd jord (0,1-0,2 g) per prov, vilket gör att fler platser kan provtas med liknande ansträngning. Den snabba handläggningstiden säkerställer att resultat kan erhållas inom en kort tidsram och ger tid för felsökning och upprepning av experiment vid behov. Detta protokoll kan enkelt replikeras över m...

Svampar i markens ekosystem spelar viktiga roller i nedbrytning av organiskt material, näringscykel och markgödsling1. Både kulturoberoende (dvs. sekvensering med hög genomströmning) och kulturberoende metoder används ofta i studien av marksvampar 2,3. Medan den stora mängden data som genereras av metabarkodsekvensering med hög genomströmning är användbar för att belysa storskaliga mönster i samhällsstruktur och mångfald, kan det kulturberoende tillvägagångssättet ge mycket kompletterande information om de taxonomiska och funktionella strukturerna i svampsamhällen, liksom mer specifika profiler av enskilda organismer genom nedströms mångfald och funktionella analyser på grund av tillgången på rena svampkulturer.
Trots att de sällan överstiger tusentals celler per gram jord, är jäst, brett definierad som encelliga svampar, viktiga sönderdelare och matkällor för andra jordbor 4,5. Faktum är att jäst kan vara de dominerande marksvamparna i kalla biosfärer som kontinentala Antarktis 6,7. Jord är också en primär reservoar av medicinskt relevanta jästsvampar som orsakar allvarliga opportunistiska infektioner hos människor och andra däggdjur8. Trots morfologiska likheter är jästarter fylogenetiskt olika och förekommer bland trådformiga svampar i två stora phyla, Ascomycota och Basidiomycota, inom svampriket9. Jäst saknar en definierande DNA-signatur vid svampbarkodningsgenen, den interna transkriberade distansregionen (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret10, vilket gör dem oskiljbara från andra svampar i metagenomiska undersökningar och därmed kräver användning av kulturberoende metoder för att isolera jästarter.
Protokollet nedan implementerades för att karakterisera jordjästsamhällen i nio länder och identifiera globala trender och mönster i markjästdiversitet 9,11,12. Metagenomiska metoder är av begränsad nytta när man studerar riktade grupper av organismer såsom jäst 2,3. På grund av deras fylogenetiska mångfald kan jäst inte särskiljas från andra svampar baserat på DNA-sekvens ensam. Att studera jästpopulationer kräver således fortsatt användning av kulturberoende isolering. Odling är dock ofta betydligt mer tidskrävande och kräver mer personal för att utföra experimenten. Därför har protokollet optimerats och effektiviserats för snabbare bearbetning med begränsad personal. Den största fördelen med odling är att de identifierade jästarterna är levande jäst och inte döda, och därmed är mer benägna att vara sanna jordbor snarare än övergående celler som finns i jordarna. Det har uppskattats att cirka 40% av svamp-DNA i jord antingen är föroreningar från andra miljöer, extracellulära eller kommer från celler som inte längre är intakta, vilket orsakar sekvenseringsmetoder med hög genomströmning för att överskatta svamprikedomen med så mycket som 55%13. Kulturberoende isolering kan lätt bekräfta jästartsidentitet med den extra fördelen att säkerställa ren kultur som kan användas i nedströmsanalyser. Faktum är att rena kulturer av 44 förmodade nya jästarter identifierades med hjälp av detta jordisoleringsprotokoll som möjliggjorde användningen av en rad metoder för att studera deras taxonomiska och funktionella egenskaper i detalj14.
Protokollet nedan kan också användas för att isolera mögel som finns i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus är en termofil och saprofytisk form med en bred, global fördelning i jord15. Det har isolerats från många kliniska och icke-kliniska miljöer. Icke-klinisk provtagning inkluderar vanligtvis luft, organiskt skräp (kompost, sågdamm, tulpanlökavfall) och jord (jordbruks-, trädgårds- och naturjord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus är en mänsklig opportunistisk patogen som orsakar en rad infektioner som kollektivt kallas aspergillos, som påverkar över 8 miljoner människor världen över16,20. Cirka 300 000 människor runt om i världen lider av invasiv aspergillos, vilket är den allvarligaste formen av aspergillos16. Beroende på faktorer som patientpopulationen, infektionsstället och effekten av svampdödande behandling kan dödligheten vara så hög som 90%. Under de senaste decennierna har resistensen mot svampdödande terapier ökat, vilket kräver globala övervakningsinsatser i både kliniska och miljömässiga populationer för att spåra dessa resistensgenotyper 21,22,23. Med tanke på dess förmåga att växa vid temperaturer upp till 50 ° C kan denna temperatur utnyttjas för att välja för A. fumigatusisolat från jord med hjälp av kulturberoende metoder. Aspergillus fumigatus-isolat är vanligtvis genotypade vid nio mycket polymorfa korta tandemupprepning (STR) loci, som visat sig ha hög diskriminerande effekt mellan stammar24. Dessa STR-genotyper kan jämföras med andra tidigare undersökta populationer för att spåra spridningen av A. fumigatus-genotyper, inklusive läkemedelsresistensgener, runt om i världen.
Nedan beskriver vi ett protokoll för snabb isolering av jäst och A. fumigatus från jordprover på ett kulturberoende sätt. Beroende på mängden jord som erhålls per prov kan jordproverna delas mellan de två protokollen. I jämförelse med liknande metoder som isolerar jäst och A. fumigatus från jord, använder detta protokoll 10 gånger mindre jord per erhållet isolat. Studier som försöker isolera A. fumigatus från jord kräver mellan 1 och 2 g jord per isolat, medan detta protokoll endast kräver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Detta protokoll använder mindre plast och behållare som underlättar dess design med hög genomströmning. Därför kan ett större antal prover bearbetas med mindre utrymme för utrustning som inkubatorer och rulltrummor. Jordprover kan bearbetas fullständigt för att få isolat på så lite som 7 dagar. Detta protokoll har optimerats för att möjliggöra bearbetning av upp till 150-200 prover per dag och person.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Jord är värd för en otrolig mängd mikrobiellt liv, där varje gram innehåller upp till miljarder bakterie-, arkeala och svampceller. Flercelliga svampar som mögel och encelliga svampar, brett definierade som jäst, fyller viktiga roller i markens ekosystem som sönderdelare av organiskt material och som matkällor för andra jordbor. Svamparternas mångfald i marken är beroende av en mängd klimatfaktorer som nederbörd och temperatur, liksom markegenskaper inklusive organiskt material, pH och fukt. Brist på adekvat miljöprovtagning, särskilt i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika och Centralamerika, hindrar karakteriseringen av marksvampsamhällen och upptäckten av nya arter. 
Vi karakteriserade jordsvampsamhällen i nio länder på sex kontinenter med hjälp av ~ 4 000 jordprover och ett protokoll som utvecklats i laboratoriet för isolering av jäst och mögel. Detta protokoll börjar med separat selektiv anrikning för jäst och den medicinskt relevanta formen Aspergillus fumigatus, i flytande media samtidigt som bakterietillväxt hämmas. Resulterande kolonier överförs sedan till fasta medier och bearbetas vidare för att erhålla rena kulturer, följt av nedströms genetisk karakterisering. Jästartsidentiteten fastställs genom sekvensering av deras inre transkriberade distansregion (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret, medan den globala populationsstrukturen för A. fumigatus utforskas via mikrosatellitmarköranalys. 
Protokollet tillämpades framgångsrikt för att isolera och karakterisera jordjäst och A. fumigatuspopulationer i Kamerun, Kanada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, Nya Zeeland och Saudiarabien. Dessa fynd avslöjade välbehövliga insikter om globala mönster i markjästdiversitet, liksom global befolkningsstruktur och svampdödande resistensprofiler för A. fumigatus. Detta dokument presenterar metoden för att isolera både jäst och A. fumigatus från internationella jordprover.

Jästisolering från jord Ovanstående jästisoleringsprotokoll implementerades för att odla jäst från jordprover med ursprung från 53 platser i nio länder 9,12. Totalt isolerades 1 473 jäststammar från 3 826 jordprover. Med tanke på de olika klimatförhållandena i de nio ursprungsländerna fastställdes den bästa inkubationstemperaturen för varje land på grundval av dess årsmedeltemperatur (tabell 1). Med tanke p...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Detta protokoll är en effektiv, snabb metod för odling av jäst och mögel Aspergillus fumigatus från stora uppsättningar jordprover på så lite som 7 dagar. Metoderna kan enkelt modifieras för att rymma en rad inkubationsmedier och temperaturer efter behov för experiment.

Isolering av odlingsbara jästar och mögel från jordar för att undersöka svamppopulationsstruktur

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Vårt protokoll undersöker jäst- och mögeldiversitet i jord med hjälp av jordprover erhållna från olika klimatregioner. Detta ger insikter om miljöjästdiversitet och hjälper till att spåra patogena arter. Protokollet erbjuder en kostnadseffektiv och snabb metod för att skörda jäst och mögel från jorden.Jordprover kan bearbetas fullständigt för att få isolat på så lite som sju dagar. Välorganiserad experimentell installation, som att märka kulturrör och förbereda media en dag i förväg är nyckeln till att undvika att känna sig överväldigad under experimentet. Börja med att förbereda en uppsättning sterila 13 ml odlingsrör.Genom att märka dem med jordprov-ID, använd sedan en serologisk pipett för att tillsätta fem milliliter jästextrakt-pepton-dextrosbuljong kompletterad med kloramfenikol och benomyl i varje rör. Inuti ett biosäkerhetsskåp för nivå två organismer, överför cirka 0,1 gram jord till lämpligt odlingsrör med hjälp av en steril träplanspetsapplikator. Täck röret ordentligt till det första stoppet, förhindra spill samtidigt som luftutbytet tillåts under inkubation.Inkubera sedan odlingsrören i en rulltrumma i 24 timmar vid en temperatur som anses optimal för att maximera jästtillväxten. Märk sedan kloramfenikol och benomylkompenserad jästextrakt pepton-dextrosagarplattor med jordprov-ID innan supernatanten överförs till det fasta mediet. Ta bort kulturrören från rulltrumman.Sedan inuti ett biosäkerhetsskåp för nivå två organismer, virvla kort röret för att dra jordpartiklar och celler som kan ha lagt sig längst ner tillbaka till suspension. Överför sedan 100 mikroliter av supernatanten till en platta med en mikropipett. Använd en steril återanvändbar cellspridare för att sprida vätskan noggrant och jämnt över agarytan.Efter att ha tillåtit tillräcklig inkubationstid på två till tre dagar, inspektera plattorna för eventuell jästtillväxt inuti ett biosäkerhetsskåp för nivå två organismer. Leta efter krämiga, runda, mattliknande jästar som lätt kan skiljas från bakterie- och mögelkolonier. Välj en jästliknande koloni från varje platta med sterila applikatorpinnar i trä.Överför varje utvald koloni till ett färskt jästextrakt pepton-dextro-agarplattor kompletterat med kloramfenikol och benomyl och strimma för enstaka kolonier. Utför tre separata streck och använd en ny applikatorpinne för varje strimma. Använd sedan färska celler som utvecklats på en platta för att utföra en kolonipolymeraskedjereaktion.Använd interna transkriberade distanser ITS1- och ITS4-primers för att förstärka svampstångskodgenen. Jämför den erhållna interna transkriberade distanssekvensen för jäststammarna, två sekvenser deponerade i offentliga databaser, såsom National Center for Biotechnology Information GenBank och UNITE för att fastställa artidentitet. Tillsätt jord till 1,5 ml mikrocentrifugrör som innehåller en milliliter Sabouraud-dextrosbuljong och inkubera vid 50 grader Celsius i två till fyra dagar.För att överföra mycelia från den jordinokulerade buljongen till agarplattor med maltextrakt, identifiera först de jordinokulum som har synlig myceltillväxt, tillsätt Sabouraud dextrosbuljongen till luftgränsen. Använd sedan steriliserade träapplikatorpinnar för att överföra mycelia till mitten av en maltextraktagarplatta och inkubera dessa maltextraktagarplattor som är 37 grader Celsius i tre dagar. För valet av mycelia, med Aspergillus fumigatus morfologiska egenskaper, identifiera mögelkolonierna som har karakteristisk grön svängdliknande tillväxt.Inuti ett biosäkerhetsskåp för nivå två organismer, skörda konidier eller mycelia genom att skrapa ytan en gång med steriliserade träplanspetsapplikatorpinnar eller en ympningsslinga och överför den till mitten av en maltextraktagarplatta genom att stryka på agar för enstaka kolonier. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i två dagar. Med hjälp av en steril applikationspinne eller ympningsslinga, subkultur en enda koloni genererad på maltextraktagar genom att stryka kolonin en gång.Sprid de skördade sporerna i mitten av plattan. Förbered en steril 30% glycerollösning för att skörda Aspergillus fumigatus-sporerna eller mycelia för odlingslagring. Efter de två dagarnas inkubation av agarplattorna vid 37 grader Celsius, aspirera en milliliter av 30% glycerollösningen med hjälp av en pipett och sprida den på Aspergillus fumigatus-kolonin.För fenotypisk identifiering av Aspergillus fumigatus-stammar, aspirera 10 mikroliter av mycel- och sporbestånden för att lägga till 990 mikroliter vatten. Vortex denna utspädda sporsuspension och dispensera 10 mikroliter av suspensionen på ett vanligt mikroskopglas. Använd sedan ett sammansatt mikroskop vid 400X förstoring för att se suspensionen och lokalisera konidioforer.Jämför den observerade konidioformorfologin med Aspergillus fumigatus conidiophore morfologi. För att bestämma rätt fragmentstorlek för var och en av de nio mikrosatellit-loci, använd programvara som kan fragmentanalys. Hämta rådata som erhållits från kapillärelektrofores och poängsätta fragmentstorlekarna baserat på den största toppen med hjälp av den fragmenterade analysprogramvaran.Konvertera sedan fragmentstorlekarna till upprepningsnummer för var och en av de nio låga använd fragmentstorlekarna för de upprepade numren för referensstammen Af293. Från 3 826 jordprover som samlats in från 53 platser i nio länder isolerades 1 473 jäststammar. Den bästa inkubationstemperaturen för varje land bestämdes utifrån dess årsmedeltemperatur.I sällsynthetsanalys för varje land användes Shannon-mångfaldsindexet som ett mått på jordjästdiversitet. De resulterande rarefaction-kurvorna närmade sig mättnadsasymptoten, vilket indikerar att ytterligare provtagning sannolikt inte skulle ha gett mer jästdiversitet. Myceltillväxt på plattor bildade den gröna svängda morfologin som är typisk för Aspergillus fumigatus.Andra termotoleranta svamparter kan finnas i samma jordprov och odla Aspergillus fumigatus på samma platta eller av sig själva. Aspergillus fumigatus conidiophore struktur betraktad och identifierad med hjälp av ljusmikroskopi avslöjade att konidioforer har en boll på stickmorfologin och konidioforer är uniseriate, där phialiderna fästa vid konidiakedjorna är fästa direkt på den sfäriska vesikeln. Ett kromatogramgenererat biseriat avslöjade de tre kanalerna som visualiserade fragmentlängderna av Aspergillus fumigatus dinucleotide, trinukleotid och tetranukleotid korta tandemupprepningar loci.Ett nätverk med minimal spännvidd av hög kvalitet kan genereras med hjälp av R-skriptet plot_poppr_msn eller imsn. En diskriminerande analys av principkomponenter är en annan metod för att visualisera de genetiska relationerna mellan stammar. Att tillsätta benomyl och kloramfenikol till tillväxtmedier förhindrar mögel respektive bakterietillväxt och gynnar jästval.Kloramfenikol minskar också jäsningen i media, vilket sänker gasuppbyggnaden i inkuberingsrör. Att utföra metagenomik på jordprover kommer att ge ytterligare information om kulturell mångfald. Mottaglig testning av A.fumigatus-stammar kommer att identifiera förekomsten av resistensgenotyper.Detta protokoll kan tillämpas på andra jäst- och mögelsystem med liten modifiering. Det underlättade undersökningen av kulturell markjästdiversitet och dess prediktorer på global nivå.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolering av genomisk DNA från mus Tails

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Isolering av små icke-kodande RNA från humant serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolering av Myofibroblaster från mus och Human matstrupen

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analys av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Underhåll av en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Befolkning Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Borttagning av exogena material från den yttre delen av frysta kärnor för att undersöka forntida biologiska samhällen hyste Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolering och karakterisering av mikrovesiklar från perifert blod

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...