Name: isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure
Uploaded: 2022-05-27T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Bu araştırma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden gelen hibelerle desteklenmiştir (Hibe No. ALLRP 570780-2021) ve McMaster Üniversitesi.

NOT: Uluslararası toprak örneklerini ve/veya A. fumigatus sporlarını ve miseliyi kullanan herhangi bir adım, seviye 2 organizmalar (BSCII) için bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmayı gerektirir.
1. Mayanın topraktan izolasyonu
<ol><li>Antibakteriyel ve antifungal çözeltilerin hazırlanması<ol>
<li>50 g / L'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için% 70 etanol içinde kloramfenikol tozunu askıya alın. Şırınga filtrasyonu ile sterilize edin ve 4...

<ol>
	<li>Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., J&#553;dryczka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biodiversity+and+their+role+in+soil+health.">Fungal biodiversity and their role in soil health.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).</li><li>Tedersoo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity+and+geography+of+soil+fungi.">Global diversity and geography of soil fungi.</a> Science. 346 (6213), 1256688 (2014).</li><li>Egidi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+few+Ascomycota+taxa+dominate+soil+fungal+communities+worldwide.">A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li><li>Yurkov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeasts+of+the+soil+-+obscure+but+precious.">Yeasts of the soil - obscure but precious.</a> Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).</li><li>Botha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+and+ecology+of+yeasts+in+soil.">The importance and ecology of yeasts in soil.</a> Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).</li><li>Connell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+soil+yeasts+isolated+from+South+Victoria+Land,+Antarctica.">Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica.</a> Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).</li><li>Vishniac, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivariate+analysis+of+soil+yeasts+isolated+from+a+latitudinal+gradient.">A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient.</a> Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).</li><li>Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).</li><li>Samarasinghe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+culturable+soil+yeast+diversity.">Global patterns in culturable soil yeast diversity.</a> iScience. 24 (10), 103098 (2021).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+DNA+barcoding.">Fungal DNA barcoding.</a> Genome. 59 (11), 913-932 (2016).</li><li>Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fantastic+yeasts+and+where+to+find+them:+the+discovery+of+a+predominantly+clonal+Cryptococcus+deneoformans+population+in+Saudi+Arabian+soils.">Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).</li><li>Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relationships+among+strains+of+culturable+yeasts+in+agricultural+soils+in+Cameroon.">Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Carini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relic+DNA+is+abundant+in+soil+and+obscures+estimates+of+soil+microbial+diversity.">Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity.</a> Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).</li><li>Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+species+concepts+in+the+genomics+era.">Fungal species concepts in the genomics era.</a> Genome. 63 (9), 459-468 (2020).</li><li>Brakhage, A. A., Langfelder, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menacing+mold:+The+molecular+biology+of+Aspergillus+fumigatus.">Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus.</a> Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).</li><li>Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+multi-national+prevalence+of+fungal+diseases-Estimate+precision.">Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision.</a> Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).</li><li>Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+section+Fumigati:+Antifungal+susceptibility+patterns+and+sequence-based+identification.">Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).</li><li>Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+year+later:+The+effect+of+changing+azole-treated+bulbs+for+organic+tulips+bulbs+in+hospital+environment+on+the+azole-resistant+Aspergillus+fumigatus+rate.">One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate.</a> Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).</li><li>Chowdhary, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+and+emergence+of+environmental+multiple-triazole-resistant+Aspergillus+fumigatus+strains+carrying+the+TR34/L98H+mutations+in+the+cyp51A+gene+in+India.">Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India.</a> PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspergillus+fumigatus-what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen.">Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen.</a> PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).</li><li>Sewell, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+azole+resistance+across+the+global+population+of+Aspergillus+fumigatus.">Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus.</a> mBio. 10 (3), 00392 (2019).</li><li>Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+population+genetic+analysis+of+Aspergillus+fumigatus.">Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus.</a> mSphere. 2 (1), 00019 (2017).</li><li>Heo, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+in+vitro+ausceptibility+patterns+of+Aspergillus+to+triazoles+and+correlation+with+aspergillosis+outcome+in+a+tertiary+care+cancer+center,+1999-2015.">Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015.</a> Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).</li><li>de Valk, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+novel+panel+of+nine+short+tandem+repeats+for+exact+and+high-resolution+fingerprinting+of+Aspergillus+fumigatus+isolates.">Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).</li><li>Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+yeast+diversity+in+soils+under+different+management+regimes.">Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes.</a> Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).</li><li>Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+effects+of+fungicide+residues+on+the+wine-producing+process.">Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process.</a> Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).</li><li>Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mutations+in+the+&#914;-tubulin+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of mutations in the &#914;-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).</li><li>Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+spontaneous+origins+of+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans.">Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).</li><li>Paoletti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+sexuality+in+the+opportunistic+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus.">Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).</li><li>De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+highly+discriminatory+molecular+fingerprinting+assays+for+analysis+of+multiple+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+patients+with+invasive+aspergillosis.">Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).</li><li>Bates, D., M&#228;chler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+linear+mixed-effects+models+using+lme4.">Fitting linear mixed-effects models using lme4.</a> Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).</li><li>Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+&#174;+Command+Line+Applications+User+Manual.">BLAST &#174; Command Line Applications User Manual.</a> National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).</li><li>Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+unique+genetic+diversity+in+Aspergillus+fumigatus+isolates+from+Cameroon.">Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon.</a> Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).</li><li>Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+and+dispersal+of+Aspergillus+fumigatus+in+Arctic+soils.">Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils.</a> Genes. 13 (1), 19 (2021).</li><li>Snelders, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+environmental+origin+of+resistance+of+Aspergillus+fumigatus+to+medical+triazoles.">Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).</li><li>Wang, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mechanisms+and+genetic+relatedness+of+the+human+pathogenic+fungus+Aspergillus+fumigatus+exhibiting+resistance+to+medical+azoles+in+the+environment+of+Taiwan.">mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan.</a> Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).</li></ol>

Mayaların ve A. fumigatus'un topraktan izole edilmesi için geliştirilen protokol, yüksek verimli toprak işleme ve mantar izolasyonu için hızlı ve verimli bir yöntemdir. Protokol, numune başına sadece az miktarda toprak (0.1-0.2 g) gerektirir ve bu da benzer çabayla daha fazla alanın örneklenmesini sağlar. Hızlı geri dönüş süresi, sonuçların kısa bir zaman dilimi içinde elde edilebilmesini sağlar ve gerekirse sorun giderme ve denemelerin tekrarlanması için zaman tanır. Bu protokol, st...

Toprak ekosistemlerindeki mantarlar organik madde ayrışması, besin döngüsü ve toprak gübrelemesinde önemli roller oynamaktadır1. Hem kültürden bağımsız (yani, yüksek verimli dizileme) hem de kültüre bağımlı yaklaşımlar, toprak mantarlarının incelenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3. Yüksek verimli metabarkod dizilemesi ile üretilen büyük miktarda veri, topluluk yapısı ve çeşitliliğindeki geniş ölçekli kalıpları aydınlatmak için yararlı olsa da, kültüre bağımlı yaklaşım, mantar topluluklarının taksonomik ve fonksiyonel yapıları hakkında oldukça tamamlayıcı bilgilerin yanı sıra, saf mantar kültürlerinin mevcudiyeti nedeniyle aşağı akış çeşitliliği ve fonksiyonel analizler yoluyla bireysel organizmaların daha spesifik profilleri hakkında da oldukça tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir.
Toprağın gramı başına binlerce hücreyi nadiren aşmasına rağmen, geniş ölçüde tek hücreli mantarlar olarak tanımlanan mayalar, diğer toprak sakinleri için temel ayrıştırıcılar ve besin kaynaklarıdır 4,5. Aslında, mayalar kıtasal Antarktika 6,7 gibi soğuk biyosferlerde baskın toprak mantarları olabilir. Toprak aynı zamanda insanlarda ve diğer memelilerde ciddi fırsatçı enfeksiyonlara neden olan tıbbi olarak ilgili mayaların birincil rezervuarıdır8. Morfolojik benzerliklere rağmen, maya türleri filogenetik olarak çeşitlidir ve mantar krallığı9 içindeki iki ana filumda, Ascomycota ve Basidiomycota'da filamentli mantarlar arasında görülür. Mayalar, mantar barkodlama geninde, nükleer ribozomal RNA gen kümesi10'un iç transkribe edilmiş ara parçası (ITS) bölgesinde tanımlayıcı bir DNA imzasından yoksundur, bu da onları metagenomik araştırmalarda diğer mantarlardan ayırt edilemez hale getirir ve bu nedenle maya türlerini izole etmek için kültüre bağımlı yöntemlerin kullanılmasını gerektirir.
Aşağıdaki protokol, dokuz ülkenin toprak mayası topluluklarını karakterize etmek ve toprak mayası çeşitliliğindeki küresel eğilimleri ve kalıpları belirlemekiçin uygulanmıştır 9,11,12. Metagenomik yaklaşımlar, mayalar 2,3 gibi hedeflenen organizma gruplarını incelerken sınırlı bir şekilde kullanılmaktadır. Filogenetik çeşitliliği nedeniyle, mayalar sadece DNA dizisine dayanan diğer mantarlardan ayırt edilemez. Bu nedenle, maya popülasyonlarını incelemek, kültüre bağımlı izolasyonun sürekli kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, kültürleme genellikle önemli ölçüde daha fazla zaman alıcıdır ve deneyleri gerçekleştirmek için daha fazla personel gerektirir. Bu nedenle, protokol sınırlı personelle daha hızlı işlem için optimize edilmiş ve kolaylaştırılmıştır. Kültürlemenin temel avantajı, tanımlanan maya türlerinin ölü değil canlı mayalar olması ve bu nedenle topraklarda bulunan geçici hücrelerden ziyade gerçek toprak sakinleri olma ihtimalinin daha yüksek olmasıdır. Topraktaki mantar DNA'sının yaklaşık% 40'ının ya diğer ortamlardan, hücre dışı kirleticiler olduğu ya da artık bozulmamış hücrelerden geldiği ve mantar zenginliğini% 55'e kadar abartmak için yüksek verimli dizileme yaklaşımlarına neden olduğu tahmin edilmektedir13. Kültüre bağlı izolasyon, aşağı akış analizlerinde kullanılacak saf kültürün güvence altına alınmasının ek yararı ile maya türlerinin kimliğini kolayca doğrulayabilir. Gerçekten de, 44 varsayılan yeni maya türünün saf kültürleri, taksonomik ve fonksiyonel özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek için bir dizi yöntemin kullanılmasına izin veren bu toprak izolasyon protokolü kullanılarak tanımlanmıştır14.
Aşağıdaki protokol, A. fumigatus gibi toprakta bulunan küfleri izole etmek için de kullanılabilir. Aspergillus fumigatus, toprakta geniş, küresel bir dağılıma sahip termofilik ve saprofitik bir küftür15. Çok sayıda klinik ve klinik olmayan ortamdan izole edilmiştir. Klinik olmayan örnekleme genellikle hava, organik döküntü (kompost, testere tozu, lale soğanı atığı) ve toprağı (tarımsal, bahçe ve doğal topraklar) içerir16,17,18,19. Aspergillus fumigatus, dünya çapında 8 milyondan fazla insanı etkileyen, toplu olarak aspergilloz olarak adlandırılan bir dizi enfeksiyona neden olan insan fırsatçı bir patojendir16,20. Dünya çapında yaklaşık 300.000 kişi, aspergillozun en şiddetli şekli olan invaziv aspergillozdan muzdariptir16. Hasta popülasyonu, enfeksiyon yeri ve antifungal tedavinin etkinliği gibi faktörlere bağlı olarak mortalite oranı %90 gibi yüksek olabilmektedir. Son birkaç on yılda, antifungal tedavilere karşı direnç artmış ve bu direnç genotiplerini izlemek için hem klinik hem de çevresel popülasyonlarda küresel sürveyans çabaları gerektirmiştir21,22,23. 50 ° C'ye kadar olan sıcaklıklarda büyüme kabiliyeti göz önüne alındığında, bu sıcaklık, kültüre bağlı yöntemler kullanılarak topraktan A. fumigatus izolatlarını seçmek için kullanılabilir. Aspergillus fumigatus izolatları genellikle dokuz yüksek polimorfik kısa tandem tekrar (STR) lokusunda genotiplendirilir ve suşlar24 arasında yüksek ayırt edici güce sahip olduğu gösterilmiştir. Bu STR genotipleri, ilaca dirençli genler de dahil olmak üzere A. fumigatus genotiplerinin dünya çapında yayılmasını izlemek için daha önce araştırılan diğer popülasyonlarla karşılaştırılabilir.
Aşağıda, mayaların ve A. fumigatus'un toprak örneklerinden kültüre bağlı bir şekilde hızlı bir şekilde izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Numune başına elde edilen toprak miktarına bağlı olarak, toprak örnekleri iki protokol arasında paylaşılabilir. Maya ve A. fumigatus'u topraktan izole eden benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol elde edilen izolatın başına 10 kat daha az toprak kullanır. A. fumigatus'u topraktan izole etmeye çalışan çalışmalar, izolat başına 1 ila 2 g toprak gerektirirken, bu protokol sadece 0.1-0.2 g toprak18,19,25 gerektirir. Bu protokol, yüksek verimli tasarımını kolaylaştıran daha küçük plastikler ve kaplar kullanır. Bu nedenle, inkübatörler ve makaralı variller gibi ekipmanlar için daha az alan kullanılarak daha fazla sayıda numune işlenebilir. Toprak örnekleri, 7 gün gibi kısa bir sürede izolatlar elde etmek için tamamen işlenebilir. Bu protokol, kişi başına günde 150-200 numunenin işlenmesine izin verecek şekilde optimize edilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benomyl powder&#160;</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B161380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol powder&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: C0378-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: D9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analysis Software</td>
			<td>NCBI&#39;s Osiris</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>NCBI GenBank&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS sequence database</td>
			<td>UNITE&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://unite.ut.ee/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: P5905-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable cell spreaders&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 13 mL culture tubes&#160;</td>
			<td>Sarstedt Inc</td>
			<td>62.515.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden plain-tipped applicator sticks&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SKU: Y1625-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of culturable yeasts and molds from soils to investigate fungal population structure

Toprak, inanılmaz miktarda mikrobiyal yaşama ev sahipliği yapar ve her gram milyarlarca bakteriyel, arkeal ve mantar hücresi içerir. Genel olarak mayalar olarak tanımlanan küfler ve tek hücreli mantarlar gibi çok hücreli mantarlar, toprak ekosistemlerinde organik malzemenin ayrıştırıcıları ve diğer toprak sakinleri için besin kaynakları olarak önemli roller üstlenirler. Topraktaki mantar türü çeşitliliği, yağış ve sıcaklık gibi çok sayıda iklim faktörünün yanı sıra organik madde, pH ve nem gibi toprak özelliklerine bağlıdır. Özellikle Asya, Afrika, Güney Amerika ve Orta Amerika bölgelerinde yeterli çevresel örneklemenin olmaması, toprak mantar topluluklarının karakterizasyonunu ve yeni türlerin keşfedilmesini engellemektedir. 
Altı kıtada dokuz ülkedeki toprak mantar topluluklarını ~ 4.000 toprak örneği ve mayaların ve küflerin izolasyonu için laboratuvarda geliştirilen bir protokol kullanarak karakterize ettik. Bu protokol, mayalar ve tıbbi olarak ilgili küf Aspergillus fumigatus için ayrı seçici zenginleştirme ile başlar, sıvı ortamda, bakteri büyümesini inhibe ederken. Elde edilen koloniler daha sonra katı ortama aktarılır ve saf kültürler elde etmek için daha fazla işlenir, ardından aşağı akış genetik karakterizasyonu yapılır. Maya türü kimliği, nükleer ribozomal RNA gen kümesinin iç transkribe edilmiş aralayıcı (ITS) bölgesinin sıralanması yoluyla belirlenirken, A. fumigatus'un küresel popülasyon yapısı mikrosatellit belirteç analizi ile araştırılmaktadır. 
Protokol, Kamerun, Kanada, Çin, Kosta Rika, İzlanda, Peru, Yeni Zelanda ve Suudi Arabistan'daki toprak mayası ve A. fumigatus popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için başarıyla uygulandı. Bu bulgular, toprak mayası çeşitliliğindeki küresel modellerin yanı sıra A. fumigatus'un küresel popülasyon yapısı ve antifungal direnç profilleri hakkında çok ihtiyaç duyulan içgörüleri ortaya koydu. Bu yazıda hem mayaların hem de A. fumigatus'un uluslararası toprak örneklerinden izole edilmesi yöntemi sunulmaktadır.

Topraktan maya izolasyonu Yukarıdaki maya izolasyon protokolü, dokuz ülkede 53 lokasyondan kaynaklanan toprak örneklerinden elde edilen kültür mayalarına uygulanmıştır 9,12. Toplamda, 3.826 toprak örneğinden 1.473 maya suşu izole edildi. Dokuz menşe ülkenin farklı iklim koşulları göz önüne alındığında, her ülke için en iyi inkübasyon sıcaklığı, yıllık ortalama sıcaklığına göre belirlenmiştir (Tab...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure at JoVE.com

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Protokolümüz, farklı iklim bölgelerinden elde edilen toprak örneklerini kullanarak topraktaki maya ve küf çeşitliliğini araştırmaktadır. Bu, çevresel maya çeşitliliği hakkında bilgi sağlar ve patojenik türlerin izlenmesine yardımcı olur. Protokol, topraktan maya ve küf toplamak için uygun maliyetli ve hızlı bir yöntem sunar.Toprak örnekleri, yedi gün gibi kısa bir sürede izolatlar elde etmek için tamamen işlenebilir. Kültür tüplerini etiketlemek ve medyayı bir gün önceden hazırlamak gibi iyi organize edilmiş deney düzeneği, deney sırasında bunalmış hissetmekten kaçınmanın anahtarıdır. Bir dizi steril 13 mililitrelik kültür tüpü hazırlayarak başlayın.Bunları toprak numunesi kimliği ile etiketleyerek, her tüpte kloramfenikol ve benomil ile desteklenmiş beş mililitre Maya Ekstraktı-Pepton-Dekstroz suyu eklemek için serolojik bir pipet kullanın. İkinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, steril bir ahşap düzlem ucu aplikatörü kullanarak yaklaşık 0,1 gram toprağı uygun kültür tüpüne aktarın. Tüpü ilk durağa kadar güvenli bir şekilde kapatın, inkübasyon sırasında hava değişimine izin verirken dökülmeyi önleyin.Daha sonra, kültür tüplerini maya büyümesini en üst düzeye çıkarmak için optimum kabul edilen bir sıcaklıkta 24 saat boyunca bir makaralı tamburda inkübe edin. Daha sonra, süpernatantı katı ortama aktarmadan önce kloramfenikol ve benomil takviyeli maya ekstraktı pepton-dekstroz agar plakalarını toprak numune kimliği ile etiketleyin. Kültür tüplerini makaralı tamburdan çıkarın.Daha sonra, ikinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, altta yerleşmiş olabilecek toprak parçacıklarını ve hücreleri süspansiyona geri çekmek için tüpü kısaca vorteksleyin. Daha sonra, süpernatantın 100 mikrolitresini bir mikropipet kullanarak bir plakaya aktarın. Sıvıyı agar yüzeyine iyice ve eşit bir şekilde yaymak için steril bir yeniden kullanılabilir hücre yayıcı kullanın.İki ila üç günlük yeterli inkübasyon süresine izin verdikten sonra, plakaları ikinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içindeki herhangi bir maya büyümesi açısından inceleyin. Bakteri ve küf kolonilerinden kolayca ayırt edilebilen kremsi, yuvarlak, mat benzeri mayalar arayın. Steril ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanarak her plakadan bir maya benzeri koloni seçin.Seçilen her koloniyi, kloramfenikol ve benomil ile desteklenmiş taze bir maya özü peptone-dekstro agar plakalarına ve tek koloniler için çizgiye aktarın. Üç ayrı çizgi uygulayın ve her çizgi için yeni bir aplikatör çubuğu kullanın. Daha sonra, bir koloni polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için bir plaka üzerinde geliştirilen taze hücreleri kullanın.Mantar barkod genini yükseltmek için dahili transkriptlenmiş ara parçalar ITS1 ve ITS4 primerleri kullanın. Maya suşlarının elde edilen dahili transkriptlenmiş aralayıcı dizisini, tür kimliğini oluşturmak için Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi GenBank ve UNITE gibi halka açık veritabanlarında depolanan iki diziyi karşılaştırın. Bir mililitre Sabouraud dekstroz suyu içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toprak ekleyin ve iki ila dört gün boyunca 50 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Miseliyi toprakla aşılanmış et suyundan malt özü agar plakalarına aktarmak için, önce görünür misel büyümesine sahip toprak inokülumlarını tanımlayın, Sabouraud dekstroz suyunu hava sınırına ekleyin. Daha sonra miseliyi bir malt özü agar plakasının merkezine aktarmak için sterilize edilmiş ahşap düz uçlu aplikatör çubukları kullanın ve bu malt özü agar plakasını üç gün boyunca 37 santigrat derece ayarlanmış kuluçkaya yatırın. Misel seçimi için, Aspergillus fumigatus morfolojik özellikleri ile, karakteristik yeşil sallanan benzeri büyümeye sahip küf kolonilerini tanımlayın.İkinci seviye organizmalar için bir biyogüvenlik kabini içinde, sterilize edilmiş ahşap düzlem ucu aplikatör çubukları veya bir aşılama döngüsü kullanarak yüzeyi bir kez kazıyarak konidia veya miselya toplayın ve tek koloniler için agar üzerine çizerek bir malt özü agar plakasının merkezine aktarın. Plakaları iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Steril bir uygulama çubuğu veya aşılama döngüsü kullanarak, koloniyi bir kez çizerek malt ekstrakt agar üzerine üretilen tek bir koloninin alt kültürü.Hasat edilen sporları plakanın ortasına yayın. Kültür depolaması için Aspergillus fumigatus sporlarını veya miseliyi hasat etmek için steril% 30 gliserol çözeltisi hazırlayın. Agar plakalarının 37 santigrat derecede iki günlük inkübasyonundan sonra, bir pipet kullanarak% 30 gliserol çözeltisinin bir mililitresini aspire edin ve Aspergillus fumigatus kolonisine dağıtın.Aspergillus fumigatus suşlarının fenotipik tanımlanması için, 990 mikrolitre suya eklemek üzere misel ve spor stoklarının 10 mikrolitresini aspire edin. Bu seyreltilmiş spor süspansiyonunu vorteks edin ve süspansiyonun 10 mikrolitresini standart bir mikroskop sürgüsüne dağıtın. Daha sonra 400X büyütmede bileşik bir mikroskop kullanarak süspansiyonu görüntüleyin ve konidioforları bulun.Gözlenen konidiofor morfolojisini Aspergillus fumigatus conidiophore morfolojisi ile karşılaştırın. Dokuz mikro uydu lokusunun her biri için doğru parça boyutunu belirlemek için, parça analizi yapabilen bir yazılım kullanın. Kılcal elektroforezden elde edilen ham verileri alın ve parçalanmış analiz yazılımını kullanarak en büyük zirveye göre parça boyutlarını puanlayın.Ardından, Af293 referans suşunun yinelenen sayılarının parça boyutlarını kullanan dokuz düşük kullanımın her biri için parça boyutlarını yinelenen sayılara dönüştürün. Dokuz ülkede 53 yerden toplanan 3.826 toprak örneğinden 1.473 maya suşu izole edildi. Her ülke için en iyi inkübasyon sıcaklığı, yıllık ortalama sıcaklığına göre belirlendi.Her ülke için nadir görülen analizde, Shannon çeşitlilik indeksi toprak mayası çeşitliliğinin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır. Ortaya çıkan nadir eğriler, doygunluk asimptotuna yaklaştı ve ek örneklemenin daha fazla maya çeşitliliği sağlamasının muhtemel olmadığını gösterdi. Plakalardaki misel büyümesi, Aspergillus fumigatus'a özgü yeşil sallanan morfolojiyi oluşturdu.Diğer termotoleranslı mantar türleri aynı toprak örneğinde bulunabilir ve Aspergillus fumigatus'u aynı plakada veya kendi başlarına yetiştirebilir. Işık mikroskobu kullanılarak görüntülenen ve tanımlanan Aspergillus fumigatus conidiophore yapısı, konidioforların çubuk morfolojisinde bir topa sahip olduğunu ve konidioforların tek serili olduğunu, burada konidia zincirlerine bağlı fiyalitlerin doğrudan küresel veziküle bağlandığını ortaya koymuştur. Biseriat tarafından üretilen bir kromatogram, Aspergillus fumigatus dinükleotid, trinükleotid ve tetranükleotid kısa tandem tekrarları lokuslarının fragman uzunluklarını görselleştiren üç kanalı ortaya çıkardı.R komut dosyası plot_poppr_msn veya imsn kullanılarak yüksek kaliteli minimum yayılan bir ağ oluşturulabilir. Temel bileşenlerin ayrımcı bir analizi, suşlar arasındaki genetik ilişkileri görselleştirmek için başka bir yöntemdir. Büyüme ortamına benomil ve kloramfenikol eklenmesi, sırasıyla küf ve bakteri üremesini önler ve maya seçimini destekler.Kloramfenikol ayrıca ortamdaki fermantasyonu azaltır ve kuluçka tüplerinde gaz birikmesini azaltır. Toprak örnekleri üzerinde metagenomik yapmak, kültürel çeşitlilik hakkında ek bilgi sağlayacaktır. A.fumigatus suşlarının duyarlı testleri, direnç genotiplerinin varlığını tanımlayacaktır.Bu protokol diğer maya ve kalıp sistemlerine çok az değişiklikle uygulanabilir. Kültürel toprak mayası çeşitliliğinin ve öngörücülerinin küresel ölçekte araştırılmasını kolaylaştırdı.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Fare Tails Genomik DNA izolasyonu

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Bir bakımı<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Nüfus Kafes

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Antik Biyolojik Topluluklar barındırmıştır İç Araştırma Dondurulmuş Çekirdek dış bölümünden Eksojen Malzeme Kaldırma

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...