Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

نشكر بحرارة جميع المرضى وعائلاتهم على المشاركة في الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية Vaincre la Mucoviscidose. الجمعية الفرنسية ABCF 2 وجوائز فيرتكس للابتكار في مجال الأدوية.

أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح الموضحة في إعلان هلسنكي وقانون هوريت-سيروسكلات بشأن أخلاقيات البحوث البشرية.
1. إعداد القوارير والوسائط المختلفة
<ol><li>قم بإعداد التضخيم والهواء السائل ووسط التجميد كما هو موضح في الجدول 1.</li>
	<li>تحضير مح...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

تم اقتراح استخدام الخلايا الظهارية الأنفية المشتقة من المريض كبدائل للخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (HBE) لقياس نشاط CFTR في سياق الطب الشخصي حيث تقوم HNE بإعادة إنتاج خصائص الخلايا في الثقافة 9,11. الميزة القوية ل HNE على مزارع خلايا HBE هي أنه يتم أخذ عينات ...

التليف الكيسي (CF) هو اضطراب صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) مما يؤدي إلى غياب أو خلل وظيفي في بروتين CFTR ، وهي قناة أنيون تقع على السطح القمي للظهارة 1,2. أدت التطورات الحديثة في علاج CFTR إلى تحسين تشخيص المرض ، وأدت آخر الأدوية المعتمدة التي تجمع بين مصححات CFTR ومحفزات CFTR إلى تحسينات كبيرة في وظائف الرئة ونوعية الحياة لمرضى CF الذين يحملون الطفرة الأكثر شيوعا p.Phe508del طفرة (F508del)3,4. على الرغم من هذا التقدم العلاجي الواعد ، فإن حوالي 10٪ من مرضى التليف الكيسي غير مؤهلين لأنهم يحملون طفرات لا يمكن إنقاذها بواسطة معدلات CFTR هذه. بالنسبة لهؤلاء المرضى ، هناك حاجة لاختبار أدوية أخرى أو مجموعات أدوية للعثور على التركيبة الأكثر كفاءة لطفرات محددة ، مما يسلط الضوء على أهمية العلاجات الشخصية.
من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية وتسمح بتحديد كمية انتقال الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl−) كمؤشر لوظيفة CFTR. تنتج خلايا HNE نموذجا دقيقا للمجرى الهوائي البشري ، لكن عمرها محدود في الثقافة. بفضل تحسين تقنيات الاستزراع، يمكن إعادة برمجة خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض بشكل مشروط باستخدام مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCKi)، وتضخيمها، وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة البينية السائلة الهوائية (ALI) على المرشحات المسامية الدقيقة 5,6. توجد العديد من بروتوكولات الاستزراع لزراعة HNE (متاحة تجاريا ، خالية من المصل ، "محلية الصنع" ، زراعة مشتركة مع الخلايا المغذية ، وما إلى ذلك) ، وقد تم وصف اختيار الوسائط وظروف الثقافة للتأثير على النمو ، وتمايز عدد الخلايا والوظيفة الظهارية 7,8. يقدم البروتوكول هنا طريقة تضخيم ROCKi مبسطة وخالية من وحدة التغذية تسمح بالحصول بنجاح على عدد كبير من خلايا HNE التي يتم تمييزها بعد ذلك في ALI لفحوصات وظيفة CFTR.
لقد أثبتنا أنه في خلايا HNE المتباينة ، يكفي العلاج لمدة 48 ساعة باستخدام معدلات CFTR للحث على التصحيح الكهروفسيولوجي لتيار Cl- الحالي المعتمد على CFTR وأن التصحيح الذي لوحظ في المختبر قد يكون مرتبطا بالتحسن السريري للمريض9. وبالتالي ، تمثل خلايا HNE نموذجا مناسبا ليس فقط لأبحاث CF الأساسية ولكن للدراسات قبل السريرية مع اختبار معدل CFTR الخاص بالمريض. في هذا السياق من العلاج الشخصي ، كان الهدف من البروتوكول هو التحقق من أن خلايا HNE المحفوظة بالتجميد من مرضى التليف الكيسي ، والتي نمت في ظروفنا ، كانت نموذجا مناسبا لدراسات تصحيح CFTR ، ويمكن توقع نتائج مماثلة عند مقارنة نقل Cl المعتمد على CFTR من الخلايا الطازجة والمجمدة المذابة. كما قيمت الدراسة فعالية مختلف معدلات CFTR عند استخدام العلاجات المزدوجة والثلاثية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية. يمكن تضخيم خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة الهوائية السائلة لتحديد كمية نقل الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl-) كمؤشر لوظيفة منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). إذا تم تنفيذ الخطوات الحاسمة مثل جودة تنظيف الأنف بالفرشاة وكثافة الخلايا عند الحفظ بالتبريد بكفاءة ، فيمكن إجراء خلايا HNE بنجاح في البنوك الحيوية. علاوة على ذلك، تظهر دراسات تيار الدائرة القصيرة أن ذوبان الجليد لا يعدل بشكل كبير الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE واستجابتها لمعدلات CFTR. في ظروف الثقافة المستخدمة في هذه الدراسة ، عندما يتم تجميد أقل من 2 × 106 خلايا لكل تبريد ، يكون معدل الفشل مرتفعا جدا. نوصي بتجميد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا لكل تبريد. لقد أظهرنا أن العلاجات المزدوجة التي تجمع بين مصحح CFTR و CFTR المقوي لها فعالية تصحيح مماثلة لنشاط CFTR في خلايا HNE F508del-homozygous. العلاج الثلاثي VX-445 + VX-661 + VX-770 زاد بشكل كبير من تصحيح نشاط CFTR مقارنة بالعلاج المزدوج VX-809 + VX-770. يعد مقياس نشاط CFTR في خلايا HNE مؤشرا حيويا واعدا قبل السريرية مفيدا لتوجيه العلاج بمغير CFTR.

تعرض خلايا HNE الطازجة المستزرعة في واجهة الهواء السائل ميزات نموذجية للظهارة التنفسية المستقطبة والمتباينة كما تم تقييمها بواسطة التلطيخ المناعي (الشكل 1). تعيد خلايا HNE التمايز إلى طبقة غير متجانسة من الخلايا الظهارية (تلطيخ مناعي إيجابي للكيراتين 8) تحاكي الوضع الحي ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

هنا نصف عزل وتضخيم وتمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في واجهة الهواء السائل وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يسمح بتجميد ومن ثم إذابة HNE المضخمة بنجاح. يحلل البروتوكول الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE المتباينة وتصحيح إفراز الكلوريد المرتبط ب CFTR على علاجات معدلة مختلفة.

الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية: البنوك الحيوية في سياق الطب الدقيق

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

يسلط هذا البروتوكول الضوء على الخطوات الرئيسية لتضخيم الخلايا الظهارية الأنفية الأولية وتمييزها والحفاظ عليها بالتبريد. في ظروف ثقافتنا، تحاكي الخلايا الظهارية الأنفية الأولية ظهارة الرئة. وهذا يسمح للثقافات المشتقة من المريض ودراسات الطب الشخصي من الخلايا الطازجة أو المخازن الحيوية.يمكن استخدام الثقافات الظهارية الأنفية المشتقة من المريض لتقييم نشاط CFTR والمساعدة في علاج التليف الكيسي من خلال تقييم استجابة المريض الفردية للعلاجات الجديدة. ستوضح الإجراء أوريلي هاتون ، وهي مهندسة من مختبري. للبدء ، تنمو الخلايا الظهارية الأنفية أو HNE ، في 10 ملليلتر من وسط التضخيم.احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون في قارورة مغلفة بالكولاجين 75 سم مربع حتى تصل إلى 80 إلى 90 ٪ التقاء. تغيير الوسط كل 48 إلى 72 ساعة. في وقت لاحق ، اغسل الخلايا ب 10 ملليلتر من المغنيسيوم و DPBS الخالي من الكالسيوم.استنشق وتجاهل المياه المالحة. قبل إضافة ملليلتر من 0.25٪ من التربسين وإعادة القارورة إلى الحاضنة لمدة ثماني إلى 12 دقيقة. في وقت لاحق ، اضغط على القارورة بإحكام براحة اليد للمساعدة في انفصال الخلايا.أضف 10 ملليلتر من وسط التضخيم لوقف التفاعل الإنزيمي. شطف القارورة بقوة باستخدام ماصة 10 ملليلتر لرسم وطرد وسط التضخيم على سطح القارورة لشطف وفصل الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة.أعد تعليق الكريات في خمسة إلى 10 ملليلتر من وسط التضخيم. ثم عد الخلايا على مقياس الدم. بعد عد الخلايا ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من supernatant.ثم أعد تعليق الكريات في وسط التجميد المخصب للحصول على ثلاث إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر ووضعها في قارورة التبريد. قم بتجميد الخلايا ببطء عن طريق خفض درجة الحرارة بمقدار درجة مئوية واحدة تقريبا في الدقيقة في حاوية تجميد مناسبة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في اليوم التالي ، انقل العينة المحفوظة إلى حاوية تخزين النيتروجين للتخزين على المدى الطويل.قم بتدفئة وسط التضخيم المحضر حديثا في حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية. قم بإزالة قوارير التبريد من خزان تخزين النيتروجين ووضعها بسرعة في الحمام المائي ، مع الحرص على عدم غمر القارورة بأكملها في الماء. قم بإزالة قوارير التبريد من الحمام المائي عندما تبقى قطرة صغيرة مجمدة فقط.امسح القوارير بالكحول بنسبة 70٪ وضعها تحت غطاء المحرك. باستخدام ماصة ملليلتر واحدة ، انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم أضف ملليلتر واحد من وسط التضخيم الدافئ بطريقة قطرة.بعد دقيقة واحدة ، أضف ملليلتر آخر من وسط التضخيم وانتظر لمدة دقيقة. أضف 10 ملليلتر من وسط التضخيم وأجهزة الطرد المركزي عند 500 مرة G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. شفط والتخلص من supernatant.أعد تعليق الكريات في حجم وسط التضخيم المطلوب لتحقيق كثافة خلية تبلغ 10 مرات إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. بعد بذر الخلايا على قارورة مغلفة بالكولاجين بمساحة 25 سنتيمترا مربعا ، تحتوي على وسط تضخيم ، احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. راقب بصريا تمدد الخلية على مدى يومين إلى ثلاثة أيام قبل إجراء تضخيم الخلية كما هو موضح سابقا.زرع الخلايا بكثافة 3.3 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مرشح على مرشحات مسامية مغلفة بالكولاجين بسعة 0.33 سنتيمتر مربع ، تستكمل ب 300 ميكرولتر من وسط التضخيم في الجانب القمي و 900 ميكرولتر من وسط سائل الهواء في الجانب القاعدي. بعد ثلاثة أيام ، قم بشفط الوسط القمي واستزراع الخلايا في واجهة الهواء السائل لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع في الوسط السائل الهوائي لإنشاء ظهارة متباينة. تغيير الوسط القاعدي كل 48 إلى 72 ساعة.أظهرت خلايا HNE الطازجة المستزرعة في واجهة الهواء السائل سمات نموذجية للظهارة التنفسية المستقطبة والمتباينة. في عينات خلايا HNE البالغ عددها 78 عينة ، تمت مقارنة معدلات النجاح في تنظيف الأنف بالفرشاة على الفور وبعد يوم إلى سبعة أيام من النقل في وسط التنظيف. كان المتوسط الأولي للنسبة المئوية للثقافات الناجحة 82٪ ووصل إلى 87٪ في العينات المبذرة بين صفر إلى خمسة أيام.83٪ من العينات التي تميزت بنجاح في ظروف جديدة كانت ناجحة أيضا في العينات المحفوظة بالتبريد. وبالمثل ، في العينات التي فشلت في التمييز في الظروف الجديدة ، لم ينجح 71٪ أيضا في ظروف ذوبان الجليد. علاوة على ذلك ، فشلت 50٪ من العينات المجمدة بين اثنين إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل قارورة تبريد في النمو عند إذابتها ، حيث وصلت إلى 80٪ لأقل من اثنين في 10 إلى الخلايا الست.بالنسبة للتغير في تيار الدائرة القصيرة استجابة للفورسكولين وتغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172 في خلايا HNE المعالجة ب DMSO ، لم يلاحظ أي فرق كبير بين HNE المذاب الطازج أو المجمد. عند العلاج ، أظهر كلا النوعين من الخلايا تصحيحا كبيرا مع زيادة في تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة للفورسكولين وانخفاض في تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172. تم تقييم الاستجابة التصحيحية للعلاجات المزدوجة لوظيفة CFTR مقارنة بتغير تيار الدائرة القصيرة لخلايا HNE المعالجة ب DMSO استجابة للفورسكولين واستجابة لمثبط CFTR 172 تم تحسينها بشكل كبير بواسطة كل من VX-809 بالإضافة إلى VX-770 و VX-661 بالإضافة إلى VX-770.تمت مقارنة ثلاثة علاجات مختلفة لمغير CFTR في HNE من ستة مرضى متماثلي الزيجوت F508del. عند استخدامه مع مصحح CFTR ومحفز ، كل من محولات الرأس و CFTR ، قام بتصحيح تغير تيار الدائرة القصيرة استجابة لتغير تيار الفورسكولين والدائرة القصيرة استجابة لمثبط CFTR 172 إلى حد مماثل. عند تجميد خلايا HNE ، من المهم أن يكون لديك ما لا يقل عن 3 ملايين خلية لكل قارورة تبريد لزيادة فرص الحصول على نتيجة جيدة عند الذوبان.وقد ثبت أن نشاط CFTR في خلايا HNE هو نموذج تنبؤي جيد لتقييم وضبط العلاجات الشخصية في التليف الكيسي.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

الآنف الفرق المحتملة التحديد الكمي للنقل عبر الظهارية أيون في الفئران

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...