Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Vi takker varmt alle patienter og deres familier for deltagelse i undersøgelsen. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den franske forening Vaincre la Mucoviscidose; Den franske sammenslutning ABCF 2 og Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Alle eksperimenter blev udført efter de retningslinjer og regler, der er beskrevet i Helsinki-erklæringen og Huriet-Serusclat-loven om menneskelig forskningsetik.
1. Fremstilling af kolber og forskellige medier
<ol><li>Der forberedes forstærkning, luft-væske og frysemedium som beskrevet i tabel 1.</li>
	<li>Forbered en stamopløsning af humant kollagen IV ved at opløse 50 mg kollagen i 100 ml 0,2% iseddikesyre. Bland på en magnetisk omrører i mindst 1...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Anvendelsen af patientafledte nasale epitelceller som surrogater for humane bronchialepitelceller (HBE) til måling af CFTR-aktivitet i forbindelse med personlig medicin er blevet foreslået, da HNE reproducerer cellernes egenskaber i kultur 9,11. Den stærke fordel ved HNE i forhold til HBE-cellekulturer er, at de let og ikke-invasivt udtages. Kortslutningsstrømmålinger i HNE-cellekulturer muliggør vurdering af CFTR-afhængig Cl-transport over epit...

Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv lidelse som følge af mutationer i cystisk fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gen, der fører til fravær eller dysfunktion af CFTR-proteinet, en anionkanal placeret på den apikale overflade af epitel 1,2. Nylige fremskridt inden for CFTR-terapi har forbedret prognosen for sygdommen, og de sidste godkendte lægemidler, der kombinerer CFTR-korrektorer og CFTR-potentiatorer, førte til store forbedringer i lungefunktion og livskvalitet for CF-patienter, der bærer den hyppigste mutation p.Phe508del mutation (F508del)3,4. På trods af denne lovende terapeutiske udvikling er omkring 10% af CF-patienterne ikke kvalificerede, da de bærer mutationer, der ikke kan reddes af disse CFTR-modulatorer. For disse patienter er der behov for at teste andre lægemidler eller lægemiddelkombinationer for at finde den mest effektive kombination for specifikke mutationer, hvilket understreger vigtigheden af personlige terapier.
Humane nasale epitelceller (HNE) er lette at indsamle ved simpel, ikke-invasiv næsebørstning og tillader kvantificering af cyklisk AMP-medieret chlorid (Cl-) transport som et indeks for CFTR-funktion. HNE-celler giver en nøjagtig model af menneskelig luftvej, men deres levetid er begrænset i kultur. Takket være optimeringen af dyrkningsteknikker kan patientafledte primære HNE-celler betinget omprogrammeres med Rho-associeret kinasehæmmer (ROCKi), forstærkes og differentieres til et pseudostratificeret epitel i luft-væske-grænseflade (ALI) betingelser på mikroporøse filtre 5,6. Der findes talrige kulturprotokoller for HNE-kultur (kommercielt tilgængelig, serumfri, "hjemmelavet", co-kultur med feederceller osv.), Og valg af medie- og kulturbetingelser er blevet beskrevet for at påvirke vækst, cellepopulationsdifferentiering og epitelfunktion 7,8. Protokollen her præsenterer en forenklet, feederfri, ROCKi-forstærkningsmetode, der gør det muligt med succes at opnå et stort antal HNE-celler, der derefter differentieres ved ALI til CFTR-funktionsassays.
Vi har påvist, at i differentierede HNE-celler er en 48 timers behandling med CFTR-modulatorer tilstrækkelig til at fremkalde elektrofysiologisk korrektion af CFTR-afhængig Cl-strøm , og at korrektionen observeret in vitro kan korreleres med patientens kliniske forbedring9. HNE-celler udgør derfor en passende model, ikke kun for grundlæggende CF-forskning, men for prækliniske undersøgelser med patientspecifik CFTR-modulatortestning. I denne forbindelse med personlig terapi var målet med protokollen at validere, at kryokonserverede HNE-celler fra CF-patienter, dyrket under vores forhold, var en passende model til CFTR-korrektionsundersøgelser, og lignende resultater kunne forventes, når man sammenlignede CFTR-afhængig Cl-transport fra friske og frosne optøede celler. Undersøgelsen vurderede også forskellige CFTR-modulatorers effektivitet ved anvendelse af dobbelt og tredobbelt terapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Humane nasalepitelceller (HNE) er lette at indsamle ved simpel, ikke-invasiv næsebørstning. Patientafledte primære HNE-celler kan amplificeres og differentieres til et pseudostratificeret epitel i luft-væske-grænsefladebetingelser for at kvantificere cyklisk AMP-medieret chloridtransport (Cl-) som et indeks for cystisk fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) funktion. Hvis kritiske trin såsom kvaliteten af næsebørstning og celletæthed ved kryopræservering udføres effektivt, kan HNE-celler med succes biobankes. Desuden viser kortslutningsstrømundersøgelser, at fryseoptøning ikke signifikant ændrer HNE-cellernes elektrofysiologiske egenskaber og respons på CFTR-modulatorer. I de dyrkningsbetingelser, der anvendes i denne undersøgelse, når mindre end 2 x 106 celler fryses pr. Kryovial, er fejlfrekvensen meget høj. Vi anbefaler at fryse mindst 3 x 106 celler pr. Kryovial. Vi viser, at dobbelte terapier, der kombinerer en CFTR-korrektor med en CFTR-potentiator, har en sammenlignelig korrektionseffekt for CFTR-aktivitet i F508del-homozygote HNE-celler. Tredobbelt terapi VX-445 + VX-661 + VX-770 øgede signifikant korrektion af CFTR-aktivitet sammenlignet med dobbeltterapi VX-809 + VX-770. Målingen af CFTR-aktivitet i HNE-celler er en lovende præklinisk biomarkør, der er nyttig til at guide CFTR-modulatorbehandling.

Friske HNE-celler dyrket ved luft-væske-grænsefladen viser typiske træk ved det polariserede og differentierede respiratoriske epitel som vurderet ved immunstaining (figur 1). HNE-celler redifferentierer sig til et heterogent lag af epitelceller (positiv keratin 8-immunfarvning), der efterligner in vivo-situationen for et pseudostratificeret respiratorisk epitel sammensat af cilieret (positiv alfa-tubulinfarvning) og ikke-cilierede slimproducerende bægerceller (positiv Muc5Ac-im...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Her beskriver vi isolering, forstærkning og differentiering af primære humane nasale epitelceller (HNE) ved luft-væske-grænsefladen og en biobankprotokol, der gør det muligt at fryse og derefter optø forstærket HNE. Protokollen analyserer elektrofysiologiske egenskaber af differentierede HNE-celler og CFTR-relateret chloridsekretionskorrektion ved forskellige modulatorbehandlinger.

Primære humane nasale epitelceller: Biobanking i forbindelse med præcisionsmedicin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Denne protokol fremhæver de vigtigste trin til forstærkning, differentiering og kryopræservering af primære nasale epitelceller. I vores kulturbetingelser efterligner primære nasale epitelceller lungeepitelet. Dette tillader patientafledte kulturer og personlige medicinundersøgelser fra friske eller biobankede celler.De patientafledte nasale epitelkulturer kan bruges til at evaluere CFTR-aktivitet og hjælpe med cystisk fibrosebehandling ved at evaluere patientens individuelle respons på nye terapier. Aurelie Hatton, en ingeniør fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med vokse nasal epitel eller HNE celler, i 10 ml amplifikationsmedium.Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en 75 kvadratcentimeter kollagenbelagt kolbe, indtil den når 80 til 90% sammenløb. Skift medium hver 48. til 72. time. Senere vaskes cellerne med 10 ml magnesium og calciumfri DPBS.Aspirer og kassér saltvandet. Før der tilsættes to milliliter 0,25% trypsin og returneres kolben til inkubatoren i otte til 12 minutter. Senere skal du trykke kolben fast med en håndflade for at hjælpe celleløsning.Tilsæt 10 ml amplifikationsmediet for at stoppe den enzymatiske reaktion. Kolben skylles kraftigt med en pipette på 10 ml for at trække amplifikationsmediet op og uddrive det over kolbens overflade for at skylle og løsne celler og opsamle cellerne i et rør på 15 ml. Centrifugering af cellesuspensionen ved 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten.Ophæng pillen igen i fem til 10 ml forstærkningsmedium. Tæl derefter cellerne på et hæmocytometer. Efter celletælling centrifugeres cellerne ved 500 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius og kasseres supernatanten.Derefter suspenderes pelleten igen i det berigede frysemedium for at opnå tre til fem gange 10 til de seks celler pr. Milliliter og anbringes i et kryohætteglas. Nedfrysning af cellerne langsomt ved at reducere temperaturen med ca. en grad Celsius i minuttet i en passende kryobrezingbeholder ved minus 80 grader Celsius. Den næste dag flyttes den konserverede prøve til en nitrogenopbevaringsbeholder til langtidsopbevaring.Varm det frisklavede forstærkningsmedium i et vandbad indstillet til 37 grader Celsius. Fjern kryohætteglas fra nitrogenopbevaringstanken og læg dem hurtigt i vandbadet, og pas på ikke at nedsænke hele hætteglasset i vand. Fjern kryohætteglassene fra vandbadet, når der kun er en lille frossen dråbe tilbage.Tør hætteglassene af med 70% alkohol og læg dem under emhætten. Brug en pipette på 1 milliliter til at overføre de optøede celler til et 15 ml rør. Tilsæt derefter en milliliter varmt forstærkningsmedium på en dråbevis måde.Efter et minut tilsættes en anden milliliter forstærkningsmedium og vent et minut. Tilsæt 10 ml forstærkningsmedium og centrifuge ved 500 gange G i to minutter ved fire grader Celsius. Aspirer og kassér supernatanten.Re-suspendere pelleten i et volumen af amplifikationsmedium, der kræves for at opnå en celletæthed på en gang 10 til de seks celler pr. Milliliter. Efter såning af cellerne på en 25 kvadratcentimeter kollagenbelagt kolbe, der indeholder amplifikationsmedium, inkuberes cellerne ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Visuelt observere celleudvidelse over to til tre dage, før du udfører celleamplifikation som påvist tidligere.Frø cellerne med en densitet på 3,3 gange 10 til de femte celler pr. filter på 0,33 kvadratcentimeter kollagenbelagte porøse filtre, suppleret med 300 mikroliter forstærkningsmedium på den apikale side og 900 mikroliter luftflydende medium på basolateralsiden. Efter tre dage aspirerer det apikale medium og dyrker cellerne ved luft-væske-grænsefladen i tre til fire uger i luft-flydende medium for at etablere et differentieret epitel. Skift basalmediet hver 48. til 72. time.Friske HNE-celler dyrket ved luft-væske-grænsefladen viste et typisk træk ved det polariserede og differentierede respiratoriske epitel. I de 78 HNE-celleprøver blev succesraten sammenlignet i næsebørstning podet straks og efter en til syv dages transport i et skyllemedium. Den oprindelige gennemsnitlige procentdel af succesfulde kulturer var 82% og nåede 87% i prøver podet mellem nul og fem dage.83% af de prøver, der differentierede med succes under friske forhold, var også vellykkede i kryokonserverede prøver. Tilsvarende var 71 % i prøver, der ikke kunne differentiere under friske forhold, heller ikke lykkedes med fryse-optøning. Desuden undlod 50% af prøverne frosset mellem to og tre gange 10 til de seks celler pr. Kryo hætteglas at vokse, når de blev optøet, og nåede 80% for under to gange 10 til de seks celler.For kortslutningsstrømændring som reaktion på forskolin og kortslutningsstrømændring som reaktion på CFTR-hæmmer 172 i DMSO-behandlede HNE-celler blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem frisk eller frosset optøet HNE. Ved behandling viste begge celletyper signifikant korrektion med en stigning i kortslutningsstrømændring som reaktion på forskolin og et fald i kortslutningsstrømændring som reaktion på CFTR-hæmmer 172. det korrigerende respons af CFTR-funktion dobbeltterapier blev vurderet sammenlignet med DMSO-behandlede HNE-celler kortslutningsstrømændring som reaktion på forskolin og som reaktion på CFTR-hæmmer 172 blev signifikant forbedret af både VX-809 plus VX-770 og VX-661 plus VX-770.Tre forskellige CFTR-modulatorterapier i HNE fra seks F508del homozygote patienter blev sammenlignet. Når det anvendes i kombination med en CFTR-korrektor og potentiator, både toppunkt og en CFTR-modulatorer, korrigerede kortslutningsstrømændring som reaktion på forskolin og kortslutningsstrømændring som reaktion på CFTR-hæmmer 172 i tilsvarende omfang. Ved frysning af HNE-celler er det vigtigt at have mindst 3 millioner celler pr. Kryohætteglas for at øge chancerne for et godt resultat ved optøning.CFTR-aktivitet i HNE-celler har vist sig at være en god prædiktiv model til at evaluere og justere personlige terapier i cystisk fibrose.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirus Produktion og Cell Culture nødvendige betingelser for at Succesfuld transducere Primary humane bronchieepithelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentielle forskel at kvantificere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Multicellulær human alveolær model sammensat af epitelceller og primære immunceller til farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...