Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

We bedanken alle patiënten en hun families hartelijk voor hun deelname aan het onderzoek. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Franse vereniging Vaincre la Mucoviscidose; Franse vereniging ABCF 2 en Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften beschreven door de Verklaring van Helsinki en de Huriet-Serusclat wet op de ethiek van het menselijk onderzoek.
1. Bereiding van kolven en verschillende media
<ol><li>Bereid versterking, luchtvloeistof en vriesmedium zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Bereid een stockoplossing van menselijk collageen IV door 50 mg collageen op te lossen in 100 ml 0,2% ijsazijn. Meng gedurende ten...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Het gebruik van patiënt-afgeleide nasale epitheelcellen als surrogaten voor menselijke bronchiale epitheelcellen (HBE) om CFTR-activiteit te meten in de context van gepersonaliseerde geneeskunde is voorgesteld als HNE de eigenschappen van cellen in cultuur reproduceren 9,11. Het sterke voordeel van HNE ten opzichte van HBE-celculturen is dat ze gemakkelijk en niet-invasief kunnen worden bemonsterd. Kortsluitstroommetingen in HNE-celculturen maken beoordeling mog...

Cystic Fibrosis (CF) is een autosomaal recessieve aandoening als gevolg van mutaties in het Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gen dat leidt tot de afwezigheid of disfunctie van het CFTR-eiwit, een anionkanaal gelegen aan het apicale oppervlak van epithelia 1,2. Recente ontwikkelingen in CFTR-therapie hebben de prognose van de ziekte verbeterd en de laatste goedgekeurde geneesmiddelen die CFTR-correctoren en CFTR-potentiators combineren, hebben geleid tot grote verbeteringen in de longfunctie en kwaliteit van leven voor CF-patiënten met de meest voorkomende mutatie p.Phe508del-mutatie (F508del)3,4. Ondanks deze veelbelovende therapeutische vooruitgang komt ongeveer 10% van de CF-patiënten niet in aanmerking omdat ze mutaties dragen die niet te redden zijn door deze CFTR-modulatoren. Voor deze patiënten is het nodig om andere geneesmiddelen of medicijncombinaties te testen om de meest efficiënte combinatie voor specifieke mutaties te vinden, wat het belang van gepersonaliseerde therapieën benadrukt.
Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudige, niet-invasieve neusborsteling en maken kwantificering van cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl−) transport als een index van CFTR-functie mogelijk. HNE-cellen leveren een nauwkeurig model van de menselijke luchtwegen, maar hun levensduur is beperkt in cultuur. Dankzij de optimalisatie van kweektechnieken kunnen patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen voorwaardelijk worden geherprogrammeerd met Rho-geassocieerde kinaseremmer (ROCKi), versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interface (ALI) omstandigheden op microporeuze filters 5,6. Er bestaan tal van kweekprotocollen voor HNE-cultuur (in de handel verkrijgbaar, serumvrij, "zelfgemaakt", co-kweek met feedercellen, enz.), en de keuze van media en kweekomstandigheden is beschreven om de groei, celpopulatiedifferentiatie en epitheliale functie te beïnvloeden 7,8. Het protocol presenteert hier een vereenvoudigde, feedervrije ROCKi-amplificatiemethode die het mogelijk maakt om met succes een groot aantal HNE-cellen te verkrijgen die vervolgens worden gedifferentieerd bij ALI voor CFTR-functietests.
We hebben aangetoond dat in gedifferentieerde HNE-cellen een behandeling van 48 uur met CFTR-modulatoren voldoende is om elektrofysiologische correctie van CFTR-afhankelijke Cl-stroom te induceren en dat de in vitro waargenomen correctie gecorreleerd kan zijn met de klinische verbetering van de patiënt9. HNE-cellen vormen daarom een geschikt model, niet alleen voor fundamenteel CF-onderzoek, maar ook voor preklinische studies met patiëntspecifieke CFTR-modulatortests. In deze context van gepersonaliseerde therapie was het doel van het protocol om te valideren dat gecryopreserveerde HNE-cellen van CF-patiënten, gekweekt in onze omstandigheden, een geschikt model waren voor CFTR-correctiestudies, en vergelijkbare resultaten konden worden verwacht bij het vergelijken van CFTR-afhankelijk Cl-transport van verse en bevroren ontdooide cellen. De studie beoordeelde ook de werkzaamheid van verschillende CFTR-modulatoren bij het gebruik van dubbele en drievoudige therapieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Menselijke nasale epitheelcellen (HNE) zijn gemakkelijk te verzamelen door eenvoudig, niet-invasief neusborstelen. Patiënt-afgeleide primaire HNE-cellen kunnen worden versterkt en gedifferentieerd tot een pseudo-gestratificeerd epitheel in lucht-vloeistof interfaceomstandigheden om cyclisch AMP-gemedieerd chloride (Cl-) transport te kwantificeren als een index van cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) functie. Als kritieke stappen zoals de kwaliteit van nasaal borstelen en celdichtheid bij cryopreservatie efficiënt worden uitgevoerd, kunnen HNE-cellen met succes worden gebiobankeerd. Bovendien tonen kortsluitstroomstudies aan dat vries-ontdooien de elektrofysiologische eigenschappen en respons van HNE-cellen op CFTR-modulatoren niet significant wijzigt. In de kweekomstandigheden die in deze studie worden gebruikt, wanneer minder dan 2 x 106 cellen per cryoviaal worden ingevroren, is het faalpercentage zeer hoog. We raden aan om minimaal 3 x 106 cellen per cryoviaal in te vriezen. We tonen aan dat dubbele therapieën die een CFTR-corrector combineren met een CFTR-potentiator een vergelijkbare correctie-werkzaamheid hebben voor CFTR-activiteit in F508del-homozygote HNE-cellen. Drievoudige therapie VX-445 + VX-661 + VX-770 verhoogde significant de correctie van CFTR-activiteit in vergelijking met duale therapie VX-809 + VX-770. De meting van CFTR-activiteit in HNE-cellen is een veelbelovende preklinische biomarker die nuttig is om CFTR-modulatortherapie te begeleiden.

Verse HNE-cellen gekweekt op de lucht-vloeistof interface vertonen typische kenmerken van het gepolariseerde en gedifferentieerde respiratoire epitheel zoals beoordeeld door immunostaining (figuur 1). HNE-cellen differentiëren opnieuw in een heterogene laag epitheelcellen (positieve keratine 8 immunostaining) die de in vivo situatie nabootsen van een pseudo-gestratificeerd respiratoir epitheel bestaande uit trilhaarcellen (positieve alfa-tubulinekleuring) en niet-trilhaarproduceren...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Dit protocol belicht de belangrijkste stappen voor het versterken, differentiëren en cryopreserveren van primaire neusepitheelcellen. In onze kweekomstandigheden bootsen primaire neusepitheelcellen het longepitheel na. Dit maakt patiënt afgeleide culturen en gepersonaliseerde geneeskundestudies van verse of biobankcellen mogelijk.De patiënt-afgeleide nasale epitheliale culturen kunnen worden gebruikt om CFTR-activiteit te evalueren en te helpen bij cystische fibrosetherapie door de individuele reactie van de patiënt op nieuwe therapieën te evalueren. Aurelie Hatton, een ingenieur uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, kweek nasale epitheliale of HNE-cellen, in 10 milliliter versterkingsmedium.Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een met collageen beklede kolf van 75 vierkante centimeter totdat deze 80 tot 90% confluency bereikt. Vervang het medium elke 48 tot 72 uur. Was de cellen later met 10 milliliter magnesium- en calciumvrije DPBS.Aspirateer en gooi de zoutoplossing weg. Voordat twee milliliter van 0,25% trypsine wordt toegevoegd en de kolf gedurende acht tot 12 minuten in de incubator wordt teruggebracht. Tik later stevig op de kolf met een handpalm om de cel los te maken.Voeg 10 milliliter van het versterkingsmedium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Spoel de kolf krachtig af met een pipet van 10 milliliter om het versterkingsmedium op te zuigen en over het kolfoppervlak te drijven om cellen te spoelen en los te maken en de cellen in een buis van 15 milliliter te verzamelen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 500 maal G en gooi het supernatant weg.Suspensie de pellet opnieuw in vijf tot 10 milliliter versterkingsmedium. Tel vervolgens de cellen op een hemocytometer. Centrifugeer na het tellen van de cellen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 500 keer G en gooi het supernatant weg.Suspensuspensie vervolgens de pellet opnieuw in het verrijkte vriesmedium om drie tot vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter te verkrijgen en in een cryoflacon te plaatsen. Vries de cellen langzaam in door de temperatuur met ongeveer één graad Celsius per minuut te verlagen in een geschikte cryovriescontainer bij min 80 graden Celsius. Verplaats het geconserveerde monster de volgende dag naar een stikstofopslagcontainer voor langdurige opslag.Verwarm het vers bereide versterkingsmedium in een waterbad op 37 graden Celsius. Verwijder cryoflacons uit de stikstofopslagtank en plaats ze snel in het waterbad, waarbij u ervoor zorgt dat de hele injectieflacon niet in water wordt ondergedompeld. Verwijder de cryoflacons uit het waterbad wanneer er nog maar een klein bevroren druppeltje overblijft.Veeg de injectieflacons af met 70% alcohol en leg ze onder de motorkap. Breng met een pipet van één milliliter de ontdooide cellen over in een buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens een milliliter warm versterkingsmedium toe op een druppelsgewijze manier.Voeg na een minuut nog een milliliter versterkingsmedium toe en wacht een minuut. Voeg 10 milliliter versterkingsmedium toe en centrifugeer gedurende twee minuten bij vier graden Celsius bij 500 maal G. Aspirateer en gooi het supernatant weg.Suspensie van de pellet opnieuw in een volume versterkingsmedium dat nodig is om een celdichtheid van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter te bereiken. Na het zaaien van de cellen op een 25 vierkante centimeter collageen gecoate kolf, met versterkingsmedium, incuberen de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Observeer visueel celuitbreiding gedurende twee tot drie dagen voordat celversterking wordt uitgevoerd, zoals eerder aangetoond.Zaai de cellen met een dichtheid van 3,3 maal 10 tot de vijfde cellen per filter op 0,33 vierkante centimeter collageen gecoate poreuze filters, aangevuld met 300 microliter versterkingsmedium aan de apicale kant en 900 microliter lucht vloeibaar medium aan de basolaterale zijde. Na drie dagen aspiraleer je het apicale medium en kweek je de cellen op het lucht-vloeistof-grensvlak gedurende drie tot vier weken in het lucht-vloeistofmedium om een gedifferentieerd epitheel tot stand te brengen. Vervang het basale medium elke 48 tot 72 uur.Verse HNE-cellen gekweekt op het lucht-vloeistof interface vertoonden een typisch kenmerk van het gepolariseerde en gedifferentieerde respiratoire epitheel. In de 78 HNE-celmonsters werden de slagingspercentages vergeleken bij nasale borstelzaadjes die onmiddellijk en na één tot zeven dagen transport in een spoelmedium werden gezaaid. Het initiële gemiddelde percentage van succesvolle culturen was 82% en bereikte 87% in monsters gezaaid tussen nul en vijf dagen.83% van de monsters die succesvol differentieerden in verse omstandigheden waren ook succesvol in gecryopreserveerde monsters. Evenzo was 71% in monsters die geen onderscheid maakten in verse omstandigheden ook niet succesvol in vries-dooiomstandigheden. Bovendien groeide 50% van de monsters bevroren tussen twee tot drie keer 10 tot de zes cellen per cryoflacon niet wanneer ze werden ontdooid, waardoor 80% werd bereikt voor minder dan twee keer 10 voor de zes cellen.Voor kortsluitstroomverandering in reactie op forskoline en kortsluitstroomverandering in reactie op CFTR-remmer 172 in met DMSO behandelde HNE-cellen werd geen significant verschil waargenomen tussen vers of bevroren ontdooid HNE. Na behandeling vertoonden beide celtypen een significante correctie met een toename van de kortsluitstroomverandering als reactie op forskoline en een afname van de kortsluitstroomverandering als reactie op CFTR-remmer 172. de corrigerende respons van cftr-functie duale therapieën werden beoordeeld in vergelijking met dmso behandelde HNE-cellen kortsluitstroomverandering in respons op forskoline en in reactie op CFTR-remmer 172 waren significant verbeterd door zowel VX-809 plus VX-770, en VX-661 plus VX-770.Drie verschillende CFTR-modulatortherapieën in HNE van zes F508del homozygote patiënten werden vergeleken. Bij gebruik in combinatie met een CFTR-corrector en potentiator, zowel vertex- als een CFTR-modulator, corrigeerden kortsluitstroomverandering in reactie op forskoline en kortsluitstroomverandering in reactie op CFTR-remmer 172 in vergelijkbare mate. Bij het invriezen van HNE-cellen is het belangrijk om ten minste 3 miljoen cellen per cryoflacon te hebben om de kans op een goed resultaat bij het ontdooien te vergroten.CFTR-activiteit in HNE-cellen is een goed voorspellend model gebleken om gepersonaliseerde therapieën bij cystische fibrose te evalueren en aan te passen.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Meercellige human alveolaire model samengesteld uit epitheelcellen en primaire immuuncellen voor hazard assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...