Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
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Wir danken allen Patienten und ihren Familien herzlich für die Teilnahme an der Studie. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des französischen Verbandes Vaincre la Mucoviscidose unterstützt; Französischer Verband ABCF 2 und Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Alle Experimente wurden nach den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki und dem Huriet-Serusclat-Gesetz über die Ethik der Humanforschung beschrieben sind.
1. Vorbereitung von Kolben und verschiedenen Medien
<ol><li>Bereiten Sie Verstärkungs-, Luft-Flüssigkeits- und Gefriermedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von menschlichem Kollagen IV vor, indem Sie 50 mg Kollagen in ...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Die Verwendung von von Patienten abgeleiteten Nasenepithelzellen als Surrogate für menschliche Bronchialepithelzellen (HBE) zur Messung der CFTR-Aktivität im Rahmen der personalisierten Medizin wurde vorgeschlagen, da HNE die Eigenschaften von Zellen in Kulturreproduziert 9,11. Der starke Vorteil von HNE gegenüber HBE-Zellkulturen besteht darin, dass sie leicht und nicht-invasiv beprobt werden können. Kurzschlussstrommessungen in HNE-Zellkulturen ermöglichen...

Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die aus Mutationen im CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) resultiert, die zum Fehlen oder zur Funktionsstörung des CFTR-Proteins führen, einem Anionenkanal an der apikalen Oberfläche von Epithel 1,2. Jüngste Fortschritte in der CFTR-Therapie haben die Prognose der Krankheit verbessert, und die letzten zugelassenen Medikamente, die CFTR-Korrektoren und CFTR-Potentiatoren kombinieren, führten zu erheblichen Verbesserungen der Lungenfunktion und Lebensqualität bei CF-Patienten mit der häufigsten Mutation p.Phe508del-Mutation (F508del)3,4. Trotz dieses vielversprechenden therapeutischen Fortschritts sind rund 10% der CF-Patienten nicht geeignet, da sie Mutationen tragen, die durch diese CFTR-Modulatoren nicht gerettet werden können. Für diese Patienten besteht die Notwendigkeit, andere Medikamente oder Arzneimittelkombinationen zu testen, um die effizienteste Kombination für bestimmte Mutationen zu finden, was die Bedeutung personalisierter Therapien unterstreicht.
Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln und ermöglichen die Quantifizierung des zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransports (Cl−) als Index der CFTR-Funktion. HNE-Zellen liefern ein genaues Modell der menschlichen Atemwege, aber ihre Lebensdauer ist in der Kultur begrenzt. Dank der Optimierung der Kulturtechniken können patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen bedingt mit dem Rho-assoziierten Kinase-Inhibitor (ROCKi) umprogrammiert, amplifiziert und unter ALI-Bedingungen (Air-Liquid Interface) auf mikroporösen Filtern zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziertwerden 5,6. Es gibt zahlreiche Kulturprotokolle für die HNE-Kultur (kommerziell erhältlich, serumfrei, "hausgemacht", Kokultur mit Feederzellen usw.), und es wurde beschrieben, dass die Wahl der Medien und die Kulturbedingungen das Wachstum, die Zellpopulationsdifferenzierung und die Epithelfunktion beeinflussen 7,8. Das Protokoll stellt hier eine vereinfachte, feederfreie ROCKi-Amplifikationsmethode vor, die es ermöglicht, eine große Anzahl von HNE-Zellen erfolgreich zu erhalten, die dann bei ALI für CFTR-Funktionsassays differenziert werden.
Wir haben gezeigt, dass in differenzierten HNE-Zellen eine 48-stündige Behandlung mit CFTR-Modulatoren ausreicht, um eine elektrophysiologische Korrektur des CFTR-abhängigen Cl-Stroms zu induzieren, und dass die in vitro beobachtete Korrektur mit der klinischen Verbesserung des Patienten korreliertsein kann 9. HNE-Zellen stellen daher ein geeignetes Modell nicht nur für die CF-Grundlagenforschung, sondern auch für präklinische Studien mit patientenspezifischen CFTR-Modulatortests dar. In diesem Zusammenhang mit der personalisierten Therapie bestand das Ziel des Protokolls darin, zu validieren, dass kryokonservierte HNE-Zellen von CF-Patienten, die unter unseren Bedingungen gezüchtet wurden, ein geeignetes Modell für CFTR-Korrekturstudien waren, und ähnliche Ergebnisse konnten beim Vergleich des CFTR-abhängigen Cl-Transports aus frischen und gefrorenen aufgetauten Zellen erwartet werden. Die Studie bewertete auch die Wirksamkeit verschiedener CFTR-Modulatoren bei der Verwendung von dualen und dreifachen Therapien.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Menschliche Nasenepithelzellen (HNE) lassen sich leicht durch einfaches, nicht-invasives Nasenbürsten sammeln. Patientenabgeleitete primäre HNE-Zellen können unter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenbedingungen amplifiziert und zu einem pseudostratifizierten Epithel differenziert werden, um den zyklischen AMP-vermittelten Chloridtransport (Cl-) als Index der CFTR-Funktion (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) zu quantifizieren. Wenn kritische Schritte wie die Qualität des Nasenbürstens und die Zelldichte bei der Kryokonservierung effizient durchgeführt werden, können HNE-Zellen erfolgreich biobankiert werden. Darüber hinaus zeigen Kurzschlussstromstudien, dass das Einfrieren und Auftauen die elektrophysiologischen Eigenschaften und die Reaktion von HNE-Zellen auf CFTR-Modulatoren nicht signifikant verändert. Unter den in dieser Studie verwendeten Kulturbedingungen, wenn weniger als 2 x 106 Zellen pro Kryo eingefroren sind, ist die Ausfallrate sehr hoch. Wir empfehlen, mindestens 3 x 106 Zellen pro Kryo einzufrieren. Wir zeigen, dass duale Therapien, die einen CFTR-Korrektor mit einem CFTR-Potentiator kombinieren, eine vergleichbare Korrekturwirksamkeit für die CFTR-Aktivität in F508del-homozygoten HNE-Zellen aufweisen. Die Dreifachtherapie VX-445 + VX-661 + VX-770 erhöhte signifikant die Korrektur der CFTR-Aktivität im Vergleich zur Dualtherapie VX-809 + VX-770. Das Maß der CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ist ein vielversprechender präklinischer Biomarker, der nützlich ist, um die CFTR-Modulatortherapie zu steuern.

Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert werden, weisen typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels auf, wie sie durch Immunfärbung beurteilt werden (Abbildung 1). HNE-Zellen redifferenzieren sich in eine heterogene Schicht von Epithelzellen (positive Keratin-8-Immunfärbung), die die In-vivo-Situation eines pseudostratifizierten respiratorischen Epithels nachahmen, das aus flimmerbeinten (positive Alpha-Tubulin...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Hier beschreiben wir die Isolierung, Amplifikation und Differenzierung von primären humanen Nasenepithelzellen (HNE) an der Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle und ein Biobanking-Protokoll, das es ermöglicht, erfolgreich einzufrieren und dann verstärktes HNE aufzutauen. Das Protokoll analysiert die elektrophysiologischen Eigenschaften differenzierter HNE-Zellen und die CFTR-bezogene Chloridsekretionskorrektur bei verschiedenen Modulatorbehandlungen.

Primäre humane Nasennebenhöhlen: Biobanking im Kontext der Präzisionsmedizin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Dieses Protokoll hebt die wichtigsten Schritte zur Amplifikation, Differenzierung und Kryokonservierung primärer nasales Epithelzellen hervor. Unter unseren Kulturbedingungen ahmen primäre Nasenepithelzellen das Lungenepithel nach. Dies ermöglicht patientenabgeleitete Kulturen und personalisierte Medizinstudien aus frischen oder biobankierten Zellen.Die vom Patienten abgeleiteten nasalen Epithelkulturen können verwendet werden, um die CFTR-Aktivität zu bewerten und bei der Mukoviszidose-Therapie zu helfen, indem die individuelle Reaktion des Patienten auf neue Therapien bewertet wird. Das Verfahren wird Aurelie Hatton, eine Ingenieurin aus meinem Labor, demonstrieren. Züchten Sie zunächst nasale Epithel- oder HNE-Zellen in 10 Millilitern Amplifikationsmedium.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem 75 Quadratzentimeter großen kollagenbeschichteten Kolben, bis er 80 bis 90% Konfluenz erreicht. Wechseln Sie das Medium alle 48 bis 72 Stunden. Später waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern Magnesium und kalziumfreiem DPBS.Saugen Sie die Kochsalzlösung ab und entsorgen Sie sie. Bevor Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin zugeben und den Kolben für acht bis 12 Minuten in den Inkubator zurückbringen. Klopfen Sie später mit einer Handfläche fest auf den Kolben, um die Zellablösung zu unterstützen.Fügen Sie 10 Milliliter des Amplifikationsmediums hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Spülen Sie den Kolben kräftig mit einer 10-Milliliter-Pipette ab, um das Verstärkungsmedium über die Kolbenoberfläche zu ziehen und auszustoßen, um Zellen zu spülen und zu lösen und die Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.Suspendiert das Pellet in fünf bis 10 Milliliter Verstärkungsmedium erneut. Zählen Sie dann die Zellen auf einem Hämozytometer. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.Dann suspendieren Sie das Pellet wieder in das angereicherte Gefriermedium, um drei- bis fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten, und legen Sie es in eine Kryo-Durchstechflasche. Langsam frieren Sie die Zellen ein, indem Sie die Temperatur in einem geeigneten Kryogefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius um etwa ein Grad Celsius pro Minute senken. Am nächsten Tag bringen Sie die konservierte Probe zur Langzeitlagerung in einen Stickstofflagerbehälter.Das frisch zubereitete Verstärkungsmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmen. Entfernen Sie Kryo-Fläschchen aus dem Stickstoffspeichertank und legen Sie sie schnell in das Wasserbad, wobei Sie darauf achten, die gesamte Durchstechflasche nicht in Wasser zu tauchen. Entfernen Sie die Kryo-Fläschchen aus dem Wasserbad, wenn nur noch ein kleiner gefrorener Tröpfchen übrig ist.Wischen Sie die Fläschchen mit 70% Alkohol ab und legen Sie sie unter die Haube. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Rohr. Dann fügen Sie einen Milliliter warmes Verstärkungsmedium tropfenweise hinzu.Fügen Sie nach einer Minute einen weiteren Milliliter Verstärkungsmedium hinzu und warten Sie eine Minute. Fügen Sie 10 Milliliter Verstärkungsmedium hinzu und zentrifugieren Sie bei 500 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.Resuspendiert das Pellet in einem Volumen von Verstärkungsmedium, das erforderlich ist, um eine Zelldichte von eins mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Nach dem Aussäen der Zellen auf einen 25 Quadratzentimeter großen, mit Kollagen beschichteten Kolben, der Amplifikationsmedium enthält, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Beobachten Sie die Zellexpansion visuell über zwei bis drei Tage, bevor Sie eine Zellamplifikation durchführen, wie bereits gezeigt.Säen Sie die Zellen in einer Dichte von 3,3 mal 10 bis fünf Zellen pro Filter auf 0,33 Quadratzentimeter kollagenbeschichteten porösen Filtern, ergänzt mit 300 Mikrolitern Amplifikationsmedium auf der apikalen Seite und 900 Mikrolitern Luftflüssigkeitsmedium auf der basolateralen Seite. Nach drei Tagen aspirieren Sie das apikale Medium und kultivieren Sie die Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für drei bis vier Wochen im Luft-Flüssig-Medium, um ein differenziertes Epithel zu etablieren. Wechseln Sie das Basalmedium alle 48 bis 72 Stunden.Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wurden, zeigten typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels. In den 78 HNE-Zellproben wurden die Erfolgsraten beim Nasenbürsten sofort und nach ein bis sieben Tagen Transport in einem Spülmedium verglichen. Der anfängliche durchschnittliche Prozentsatz der erfolgreichen Kulturen betrug 82% und erreichte 87% in Proben, die zwischen null und fünf Tagen ausgesät wurden.83% der Proben, die sich unter frischen Bedingungen erfolgreich differenzierten, waren auch in kryokonservierten Proben erfolgreich. In ähnlicher Weise waren bei Proben, die sich unter frischen Bedingungen nicht differenzieren konnten, 71% auch bei Frost-Tau-Bedingungen erfolglos. Darüber hinaus wuchsen 50% der Proben, die zwischen zwei und drei Mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Kryo-Durchstechflasche gefroren waren, nicht, wenn sie aufgetaut wurden, und erreichten 80% für unter zwei mal 10 zu den sechs Zellen.Für die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 in DMSO-behandelten HNE-Zellen wurde kein signifikanter Unterschied zwischen frischem oder gefrorenem aufgetautem HNE beobachtet. Bei der Behandlung zeigten beide Zelltypen eine signifikante Korrektur mit einer Zunahme der Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und einer Abnahme der Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172. Das korrigierende Ansprechen von CFTR-Funktionsdualtherapien wurde im Vergleich zu DMSO-behandelten HNE-Zellen untersucht, die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 wurde sowohl durch VX-809 plus VX-770 als auch durch VX-661 plus VX-770 signifikant verbessert.Drei verschiedene CFTR-Modulator-Therapien in HNE von sechs F508del-homozygoten Patienten wurden verglichen. Bei Verwendung in Kombination mit einem CFTR-Korrektor und -Potentiator, sowohl Vertex- als auch CFTR-Modulatoren, korrigierte die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 in ähnlichem Maße. Beim Einfrieren von HNE-Zellen ist es wichtig, mindestens 3 Millionen Zellen pro Kryo-Durchstechflasche zu haben, um die Chancen auf ein gutes Ergebnis beim Auftauen zu erhöhen.Es hat sich gezeigt, dass die CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ein gutes Vorhersagemodell ist, um personalisierte Therapien bei Mukoviszidose zu bewerten und anzupassen.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Forschung

Biologie

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasale Potentialdifferenz, Trans-epithelialen Ionentransport bei Mäusen zu quantifizieren

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Multizelluläres humanes Alveolarmodell bestehend aus Epithelzellen und primären Immunzellen zur Gefahrenbeurteilung

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...