Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

אנו מודים בחום לכל המטופלים ובני משפחותיהם על השתתפותם במחקר. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של האגודה הצרפתית Vaincre la Mucoviscidose; האגודה הצרפתית ABCF 2 ופרסי החדשנות של Vertex Pharmaceuticals.

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות שתוארו על ידי הצהרת הלסינקי וחוק Huriet-Serusclat על אתיקה של מחקר אנושי.
1. הכנת צלוחיות ומדיה שונה
<ol><li>הכן הגברה, אוויר-נוזל ואמצעי הקפאה כמתואר בטבלה 1.</li>
	<li>הכינו תמיסת מלאי של קולגן IV אנושי על ידי המסת 50 מ"ג קולגן ב-100 מ"ל...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

השימוש בתאי אפיתל האף שמקורם בחולה כפונדקאים לתאי אפיתל הסימפונות האנושיים (HBE) למדידת פעילות CFTR בהקשר של רפואה מותאמת אישית הוצע כמאפיינים של תאי שכפול HNE בתרבית 9,11. היתרון החזק של HNE על פני תרביות תאי HBE הוא שהן נדגמות בקלות ובאופן לא פולשני. מדידות זרם קצר ח...

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא הפרעה אוטוזומלית רצסיבית הנובעת ממוטציות בגן ויסות ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR) המובילות להיעדר או תפקוד לקוי של חלבון CFTR, תעלת אניון הממוקמת במשטח האפיקלי של אפיתליה 1,2. ההתקדמות האחרונה בטיפול ב- CFTR שיפרה את הפרוגנוזה של המחלה, והתרופות המאושרות האחרונות המשלבות מתקנים של CFTR ופוטנציאטורים של CFTR הובילו לשיפורים משמעותיים בתפקוד הריאות ובאיכות החיים של חולי CF הנושאים את המוטציה השכיחה ביותר p.Phe508del מוטציה (F508del)3,4. למרות ההתקדמות הטיפולית המבטיחה הזו, כ-10% מחולי ה-CF אינם כשירים מכיוון שהם נושאים מוטציות שאינן ניתנות להסרה על ידי מודולטורים אלה של CFTR. עבור חולים אלה, יש צורך לבדוק תרופות אחרות או שילובי תרופות כדי למצוא את השילוב היעיל ביותר עבור מוטציות ספציפיות, מה שמדגיש את החשיבות של טיפולים מותאמים אישית.
קל לאסוף תאי אפיתל אף אנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני ומאפשרים כימות של הובלת כלוריד מחזורית בתיווך AMP (Cl−) כמדד לתפקוד CFTR. תאי HNE מניבים מודל מדויק של דרכי הנשימה האנושיות, אך תוחלת החיים שלהם מוגבלת בתרבית. הודות לאופטימיזציה של טכניקות תרבית, תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה ניתנים לתכנות מחדש באופן מותנה עם מעכב קינאז הקשור ל-Rho (ROCKi), להגבירם ולהבדילם לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל (ALI) על מסננים מיקרו-נקבוביים 5,6. קיימים פרוטוקולי תרביות רבים לתרבית HNE (זמינים מסחרית, ללא סרום, "תוצרת בית", תרבית משותפת עם תאי הזנה וכו'), ובחירת תנאי המדיה והתרבית תוארו כמשפיעים על הגדילה, התמיינות אוכלוסיית התאים ותפקוד האפיתל 7,8. הפרוטוקול כאן מציג שיטת הגברה פשוטה, נטולת מזינים, ROCKi המאפשרת להשיג בהצלחה מספר רב של תאי HNE שמתמיינים לאחר מכן ב- ALI עבור מבחני תפקוד CFTR.
הראינו כי בתאי HNE ממוינים, טיפול של 48 שעות עם מודולטורים של CFTR מספיק כדי לגרום לתיקון אלקטרופיזיולוגי של זרם Cl- תלוי CFTR, וכי התיקון שנצפה במבחנה עשוי להיות בקורלציה עם השיפור הקליני של המטופל9. תאי HNE, אם כן, מייצגים מודל מתאים לא רק למחקרי CF בסיסיים אלא למחקרים פרה-קליניים עם בדיקות אפנון CFTR ספציפיות למטופל. בהקשר זה של טיפול מותאם אישית, מטרת הפרוטוקול הייתה לאמת שתאי HNE בהקפאה מחולי CF, שגדלו בתנאים שלנו, היו מודל מתאים למחקרי תיקון CFTR, וניתן היה לצפות לתוצאות דומות כאשר משווים את הובלת Cl התלויה ב- CFTR מתאים טריים ומופשרים קפואים. המחקר גם העריך את היעילות של אפנון CFTR שונים בעת שימוש בטיפולים כפולים ומשולשים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

קל לאסוף תאי אפיתל האף האנושיים (HNE) על ידי צחצוח אף פשוט ולא פולשני. ניתן להגביר ולהבדיל תאי HNE ראשוניים שמקורם בחולה לאפיתל פסאודו-מרובד בתנאי ממשק אוויר-נוזל כדי לכמת הובלה מחזורית של כלוריד בתיווך AMP (Cl-) כמדד לתפקוד מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR). אם שלבים קריטיים כגון איכות צחצוח האף וצפיפות התאים בעת שמירת ההקפאה מבוצעים ביעילות, תאי HNE יכולים להיות ביו-בנקאיים בהצלחה. יתר על כן, מחקרי זרם קצר-חשמלי מראים כי הפשרה בהקפאה אינה משנה באופן משמעותי את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ואת התגובה לאפנוני CFTR. בתנאי התרבית המשמשים במחקר זה, כאשר פחות מ-2 x 106 תאים מוקפאים לכל קריוביאל, שיעור הכשל גבוה מאוד. אנו ממליצים להקפיא לפחות 3 x 106 תאים לכל קריוביאל. אנו מראים שלטיפולים כפולים המשלבים מתקן CFTR עם פוטנציאטור CFTR יש יעילות תיקון דומה לפעילות CFTR בתאי HNE F508del-homozygous. טיפול משולש VX-445 + VX-661 + VX-770 הגדיל באופן משמעותי את התיקון של פעילות CFTR בהשוואה לטיפול כפול VX-809 + VX-770. המדד של פעילות CFTR בתאי HNE הוא סמן ביולוגי פרה-קליני מבטיח המשמש להנחיית טיפול במודולטור CFTR.

תאי HNE טריים בתרבית בממשק אוויר-נוזל מציגים תכונות אופייניות של אפיתל הנשימה המקוטב והמובחנות כפי שהוערכו על ידי חיסון(איור 1). תאי HNE מתמיינים מחדש לשכבה הטרוגנית של תאי אפיתל (חיסון קרטין חיובי 8) המחקים את המצב in vivo של אפיתל נשימתי מדומה-מרובד המורכב מכתם ציליאטי (צביע...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

כאן אנו מתארים את הבידוד, ההגברה וההתמיינות של תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE) בממשק האוויר-נוזלי ופרוטוקול ביו-בנקאי המאפשר להקפיא בהצלחה ולאחר מכן להפשיר HNE מוגבר. הפרוטוקול מנתח תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי HNE ממוינים ותיקון הפרשת כלוריד הקשור ל-CFTR בטיפולי אפנון שונים.

תאי אפיתל האף האנושיים העיקריים: ביובנקינג בהקשר של רפואה מדויקת

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

פרוטוקול זה מדגיש את שלבי המפתח להגברה, התמיינות והקפאה של תאי אפיתל האף הראשוניים. בתנאי התרבית שלנו, תאי אפיתל האף הראשוניים מחקים את אפיתל הריאה. זה מאפשר תרביות שמקורן בחולה ומחקרי רפואה מותאמת אישית מתאים טריים או ביו-בנקאיים.ניתן להשתמש בתרביות אפיתל האף שמקורן בחולה כדי להעריך את פעילות ה-CFTR ולסייע בטיפול בסיסטיק פיברוזיס על ידי הערכת התגובה האישית של המטופל לטיפולים חדשים. מי שידגים את ההליך יהיה אורלי האטון, מהנדס מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לגדל אפיתל האף או תאי HNE, ב 10 מיליליטרים של מדיום הגברה.דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני בבקבוקון מצופה קולגן בגודל 75 סנטימטרים רבועים עד שתגיע ל-80 עד 90% מפגש. החלף את המדיום כל 48 עד 72 שעות. מאוחר יותר, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטרים של מגנזיום ו DPBS ללא סידן.לשאוף ולהשליך את המלח. לפני הוספת שני מיליליטרים של 0.25% טריפסין והחזרת הבקבוקון לחממה למשך שמונה עד 12 דקות. מאוחר יותר, הקש על הבקבוקון בחוזקה עם כף יד כדי לסייע בניתוק התאים.הוסף 10 מיליליטרים של מדיום ההגברה כדי לעצור את התגובה האנזימטית. לשטוף במרץ את הבקבוקון באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר כדי למשוך ולגרש את מדיום ההגברה מעל משטח הבקבוק כדי לשטוף ולנתק תאים ולאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה של תרחיף התא ב-500 פעמים G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.להשעות מחדש את הכדור בחמישה עד 10 מיליליטרים של מדיום הגברה. לאחר מכן ספרו את התאים על המוציטומטר. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה של התאים ב-500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאטנט.לאחר מכן יש להשעות מחדש את הכדור במדיום ההקפאה המועשר כדי להשיג שלוש עד חמש פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר ולהניח בבקבוקון קריו. להקפיא באיטיות את התאים על ידי הפחתת הטמפרטורה בערך מעלה אחת צלזיוס לדקה במיכל קריופריזציה מתאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הדגימה המשומרת למיכל אחסון חנקן לאחסון לטווח ארוך.מחממים את מדיום ההגברה הטרי שהוכן באמבטיית מים שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס. מוציאים בקבוקוני קריו ממיכל אגירת החנקן ומניחים אותם במהירות באמבט המים, תוך הקפדה שלא להטביע את כל הבקבוקון במים. הסר את בקבוקוני הקריו מאמבטיית המים כאשר נותרה רק טיפה קפואה קטנה.נגבו את הבקבוקונים ב-70% אלכוהול והניחו אותם מתחת למכסה המנוע. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, מעבירים את התאים המופשרים לצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום הגברה חמה בצורה טיפתית.אחרי דקה אחת, מוסיפים עוד מיליליטר אחד של מדיום הגברה ומחכים דקה. הוסיפו 10 מיליליטרים של מדיום הגברה וצנטריפוגה ב-500 פעמים G למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשאוף ולהשליך את ה-supernatant.השעיה מחדש את הכדור בנפח של מדיום הגברה הנדרש כדי להשיג צפיפות תאים של פי 10 עד ששת התאים למיליליטר. לאחר זריעת התאים על בקבוק קולגן מצופה קולגן בגודל 25 סנטימטרים רבועים, המכילים מדיום הגברה, דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. יש לבחון באופן חזותי את התפשטות התא במשך יומיים עד שלושה לפני ביצוע הגברה של התאים, כפי שהודגם קודם לכן.זרעו את התאים בצפיפות של 3.3 כפול 10 לתאים החמישיים לכל מסנן על פילטר של 0.33 סנטימטרים רבועים של קולגן מצופה מסננים נקבוביים, בתוספת 300 מיקרוליטרים של מדיום הגברה בצד האפיקלי ו-900 מיקרוליטרים של מדיום נוזלי אוויר בצד הבזולטרלי. לאחר שלושה ימים, שאפו למדיום האפיקלי ותרבו את התאים בממשק אוויר-נוזל במשך שלושה עד ארבעה שבועות בתווך האוויר-נוזלי כדי ליצור אפיתל ממוין. שנה את המדיום הבסיסי כל 48 עד 72 שעות.תאי HNE טריים בתרבית בממשק אוויר-נוזל הציגו תכונות אופייניות של האפיתל הנשימתי המקוטב והמובחן. ב-78 דגימות תאי HNE, שיעורי ההצלחה הושוו בצחצוח האף שנזרע מיד ולאחר יום עד שבעה ימי הובלה במדיום שטיפה. האחוז הממוצע הראשוני של תרביות מוצלחות היה 82% והגיע ל-87% בדגימות שנזרעו בין אפס לחמישה ימים.83% מהדגימות שהתבלטו בהצלחה בתנאים חדשים הצליחו גם בדגימות בהקפאה. באופן דומה, בדגימות שלא הצליחו להתמיין בתנאים חדשים, 71% גם לא הצליחו בתנאי הפשרה בהקפאה. יתר על כן, 50% מהדגימות שהוקפאו בין פי שניים עד שלושה פעמים 10 עד ששת התאים לכל בקבוקון קריו לא הצליחו לגדול בעת ההפשרה, והגיעו ל -80% בפחות מפי שניים 10 לששת התאים.עבור שינוי בזרם קצר בתגובה לפורסקולין ושינוי בזרם קצר בתגובה למעכב CFTR 172 בתאי HNE שטופלו ב-DMSO, לא נצפה הבדל משמעותי בין HNE מופשר טרי או קפוא. עם הטיפול, שני סוגי התאים הראו תיקון משמעותי עם עלייה בשינוי זרם קצר בתגובה לפורסקולין וירידה בשינוי זרם קצר חשמלי בתגובה למעכב CFTR 172. התגובה המתקנת של טיפולים כפולים בתפקוד CFTR הוערכו בהשוואה לתאי HNE שטופלו ב-DMSO שינוי זרם קצר חשמלי בתגובה לפורסקולין ובתגובה למעכב CFTR 172 שופרו באופן משמעותי הן על ידי VX-809 והן על ידי VX-770, והן על ידי VX-661 בתוספת VX-770.הושוו שלושה טיפולים שונים במודולטור CFTR ב-HNE משישה חולים הומוזיגוטיים מסוג F508del. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם מתקן CFTR ופוטנציאטור, הן קודקוד והן אפנן CFTR, תיקנו את שינוי זרם המעגל הקצר בתגובה לשינוי בזרם פורסקולין וקצר חשמלי בתגובה למעכב CFTR 172 במידה דומה. בעת הקפאת תאי HNE, חשוב שיהיו לפחות 3 מיליון תאים לכל בקבוקון קריו כדי להגדיל את הסיכויים לתוצאה טובה בעת ההפשרה.פעילות CFTR בתאי HNE הוכחה כמודל ניבוי טוב להערכה והתאמה של טיפולים מותאמים אישית בסיסטיק פיברוזיס.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

האף הפרש הפוטנציאלים לכמת תחבורה טרנס-אפיתל יון בעכברים

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...