Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
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Ringraziamo calorosamente tutti i pazienti e le loro famiglie per la partecipazione allo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Associazione francese Vaincre la Mucoviscidose; Associazione francese ABCF 2 e Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti descritti dalla Dichiarazione di Helsinki e dalla legge Huriet-Serusclat sull'etica della ricerca umana.
1. Preparazione di palloni e mezzi diversi
<ol><li>Preparare l'amplificazione, l'aria-liquido e il mezzo di congelamento come descritto nella Tabella 1.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre di collagene umano IV sciogliendo 50 mg di collagene in 100 ml di acido acetico gl...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

L'uso di cellule epiteliali nasali derivate dal paziente come surrogati di cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) per misurare l'attività CFTR nel contesto della medicina personalizzata è stato proposto come HNE riprodurre le proprietà delle cellule in coltura 9,11. Il forte vantaggio dell'HNE rispetto alle colture cellulari HBE è che vengono campionate facilmente e in modo non invasivo. Le misurazioni della corrente di cortocircuito nelle colture cellular...

La fibrosi cistica (CF) è una malattia autosomica recessiva derivante da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) che portano all'assenza o alla disfunzione della proteina CFTR, un canale anionico situato sulla superficie apicale dell'epitelio 1,2. I recenti progressi nella terapia CFTR hanno migliorato la prognosi della malattia e gli ultimi farmaci approvati che combinano correttori CFTR e potenziatori CFTR hanno portato a importanti miglioramenti nella funzione polmonare e nella qualità della vita per i pazienti CF portatori della mutazione più frequente p.Phe508del mutazione (F508del)3,4. Nonostante questo promettente progresso terapeutico, circa il 10% dei pazienti con FC non è idoneo in quanto porta mutazioni che non sono salvabili da questi modulatori CFTR. Per questi pazienti, c'è la necessità di testare altri farmaci o combinazioni di farmaci per trovare la combinazione più efficiente per mutazioni specifiche, evidenziando l'importanza di terapie personalizzate.
Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva e consentono la quantificazione del trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl−) come indice della funzione CFTR. Le cellule HNE producono un modello accurato delle vie aeree umane, ma la loro durata è limitata in coltura. Grazie all'ottimizzazione delle tecniche di coltura, le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere riprogrammate condizionatamente con inibitore della chinasi rho-associata (ROCKi), amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido (ALI) su filtri microporosi 5,6. Esistono numerosi protocolli di coltura per la coltura HNE (disponibili in commercio, senza siero, "fatti in casa", co-colture con cellule feeder, ecc.), E la scelta dei mezzi e delle condizioni di coltura sono state descritte per influenzare la crescita, la differenziazione della popolazione cellulare e la funzione epiteliale 7,8. Il protocollo qui presenta un metodo di amplificazione ROCKi semplificato, privo di alimentatore, che consente di ottenere con successo un gran numero di cellule HNE che vengono poi differenziate in ALI per i saggi di funzione CFTR.
Abbiamo dimostrato che, nelle cellule HNE differenziate, un trattamento di 48 ore con modulatori CFTR è sufficiente per indurre la correzione elettrofisiologica della corrente Cl-dipendente da CFTR e che la correzione osservata in vitro può essere correlata al miglioramento clinico del paziente9. Le cellule HNE, quindi, rappresentano un modello appropriato non solo per la ricerca fondamentale sulla FC, ma anche per gli studi pre-clinici con test del modulatore CFTR specifico per il paziente. In questo contesto di terapia personalizzata, l'obiettivo del protocollo era quello di convalidare che le cellule HNE crioconservate di pazienti CF, cresciute nelle nostre condizioni, fossero un modello appropriato per gli studi di correzione CFTR e risultati simili potevano essere attesi quando si confrontava il trasporto di Cl- CFTR dipendente da cellule fresche e congelate-scongelate. Lo studio ha anche valutato l'efficacia di diversi modulatori CFTR quando si utilizzano terapie doppie e triple.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Le cellule epiteliali nasali umane (HNE) sono facili da raccogliere con una spazzolatura nasale semplice e non invasiva. Le cellule HNE primarie derivate dal paziente possono essere amplificate e differenziate in un epitelio pseudo-stratificato in condizioni di interfaccia aria-liquido per quantificare il trasporto ciclico di cloruro mediato da AMP (Cl-) come indice della funzione CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) della fibrosi cistica. Se passaggi critici come la qualità della spazzolatura nasale e la densità cellulare dopo la crioconservazione vengono eseguiti in modo efficiente, le cellule HNE possono essere biobancate con successo. Inoltre, studi di corrente di cortocircuito dimostrano che lo scongelamento da congelamento non modifica significativamente le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE e la risposta ai modulatori CFTR. Nelle condizioni di coltura utilizzate in questo studio, quando meno di 2 x 106 cellule sono congelate per crioviale, il tasso di fallimento è molto alto. Si consiglia di congelare almeno 3 x 106 cellule per crioviale. Mostriamo che le terapie duali che combinano un correttore CFTR con un potenziatore CFTR hanno un'efficacia di correzione comparabile per l'attività CFTR nelle cellule HNE F508del-omozigoti. La tripla terapia VX-445 + VX-661 + VX-770 ha aumentato significativamente la correzione dell'attività CFTR rispetto alla doppia terapia VX-809 + VX-770. La misura dell'attività del CFTR nelle cellule HNE è un promettente biomarcatore pre-clinico utile per guidare la terapia con modulatori CFTR.

Le cellule HNE fresche coltivate all'interfaccia aria-liquido mostrano le caratteristiche tipiche dell'epitelio respiratorio polarizzato e differenziato valutate mediante immunocolorazione (Figura 1). Le cellule HNE si ri-differenziano in uno strato eterogeneo di cellule epiteliali (immunocolorazione positiva cheratina 8) che imitano la situazione in vivo di un epitelio respiratorio pseudo-stratificato composto da cellule caliciate (colorazione alfa-tubulina positiva) e cellule cali...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Qui descriviamo l'isolamento, l'amplificazione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali umane primarie (HNE) all'interfaccia aria-liquido e un protocollo di biobanking che consente di congelare e quindi scongelare con successo l'HNE amplificato. Il protocollo analizza le proprietà elettrofisiologiche delle cellule HNE differenziate e la correzione della secrezione di cloruro correlata al CFTR su diversi trattamenti modulatori.

Cellule epiteliali nasali umane primarie: biobanking nel contesto della medicina di precisione

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Questo protocollo evidenzia i passaggi chiave per amplificare, differenziare e crioconservare le cellule epiteliali nasali primarie. Nelle nostre condizioni di coltura, le cellule epiteliali nasali primarie imitano l'epitelio polmonare. Ciò consente colture derivate dal paziente e studi di medicina personalizzata da cellule fresche o biobancariche.Le colture epiteliali nasali derivate dal paziente possono essere utilizzate per valutare l'attività della CFTR e aiutare con la terapia della fibrosi cistica valutando la risposta individuale del paziente alle nuove terapie. A dimostrare la procedura sarà Aurelie Hatton, un ingegnere del mio laboratorio. Per iniziare, far crescere cellule epiteliali nasali o HNE, in 10 millilitri di mezzo di amplificazione.Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in un pallone rivestito di collagene di 75 centimetri quadrati fino a raggiungere l'80-90% di confluenza. Cambia il mezzo ogni 48-72 ore. Successivamente, lavare le cellule con 10 millilitri di DPBS senza magnesio e calcio.Aspirare e scartare la soluzione salina. Prima di aggiungere due millilitri di 0,25% di tripsina e restituire il pallone all'incubatrice per otto-12 minuti. Successivamente, picchiettare saldamente il pallone con un palmo per aiutare il distacco delle cellule.Aggiungere 10 millilitri del mezzo di amplificazione per fermare la reazione enzimatica. Risciacquare vigorosamente il matraccio usando una pipetta da 10 millilitri per aspirare ed espellere il mezzo di amplificazione sulla superficie del pallone per risciacquare e staccare le cellule e raccogliere le cellule in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante.Sospendere nuovamente il pellet in cinque-10 millilitri di mezzo di amplificazione. Quindi contare le cellule su un emocitometro. Dopo il conteggio delle cellule, centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante.Quindi sospendere nuovamente il pellet nel mezzo di congelamento arricchito per ottenere da tre a cinque volte 10 alle sei cellule per millilitro e metterlo in una fiala criometrica. Congelare lentamente le cellule riducendo la temperatura di circa un grado Celsius al minuto in un contenitore di criocongelamento appropriato a meno 80 gradi Celsius. Il giorno successivo, spostare il campione conservato in un contenitore di stoccaggio dell'azoto per la conservazione a lungo termine.Riscaldare il mezzo di amplificazione appena preparato a bagnomaria impostato a 37 gradi Celsius. Rimuovere le fiale criologiche dal serbatoio di stoccaggio dell'azoto e posizionarle rapidamente a bagnomaria, facendo attenzione a non immergere l'intera fiala in acqua. Rimuovere le fiale criologiche dal bagno d'acqua quando rimane solo una piccola goccia congelata.Pulire le fiale con alcool al 70% e posizionarle sotto il cofano. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire le celle scongelate in un tubo da 15 millilitri. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo di amplificazione caldo in modo a goccia.Dopo un minuto, aggiungere un altro millilitro di mezzo di amplificazione e attendere un minuto. Aggiungere 10 millilitri di mezzo di amplificazione e centrifugare a 500 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare e scartare il surnatante.Sospendere nuovamente il pellet in un volume di mezzo di amplificazione necessario per ottenere una densità di cella di una volta 10 alle sei celle per millilitro. Dopo aver seminato le cellule su un pallone rivestito di collagene di 25 centimetri quadrati, contenente mezzo di amplificazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Osservare visivamente l'espansione cellulare per due o tre giorni prima di eseguire l'amplificazione cellulare, come dimostrato in precedenza.Semina le cellule ad una densità di 3,3 volte 10 alla quinta cellula per filtro su filtri porosi rivestiti di collagene di 0,33 centimetri quadrati, integrati con 300 microlitri di mezzo di amplificazione sul lato apicale e 900 microlitri di mezzo liquido d'aria sul lato basolaterale. Dopo tre giorni, aspirare il mezzo apicale e coltivare le cellule all'interfaccia aria-liquido per tre o quattro settimane nel mezzo aria-liquido per stabilire un epitelio differenziato. Cambiare il mezzo basale ogni 48-72 ore.Le cellule HNE fresche coltivate all'interfaccia aria-liquido mostravano una caratteristica tipica dell'epitelio respiratorio polarizzato e differenziato. Nei 78 campioni di cellule HNE, i tassi di successo sono stati confrontati nella spazzolatura nasale seminata immediatamente e dopo uno o sette giorni di trasporto in un mezzo di lavaggio. La percentuale media iniziale di colture di successo era dell'82% e ha raggiunto l'87% nei campioni seminati tra zero e cinque giorni.L'83% dei campioni che si sono differenziati con successo in condizioni fresche hanno avuto successo anche in campioni crioconservati. Allo stesso modo, nei campioni che non sono riusciti a differenziarsi in condizioni fresche, il 71% non ha avuto successo anche in condizioni di congelamento-scongelamento. Inoltre, il 50% dei campioni congelati tra due o tre volte 10 alle sei cellule per fiala criogenica non è riuscito a crescere quando scongelato, raggiungendo l'80% per meno di due volte 10 alle sei cellule.Per la variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e la variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172 nelle cellule HNE trattate con DMSO, non è stata osservata alcuna differenza significativa tra HNE scongelato fresco o congelato. Al momento del trattamento, entrambi i tipi di cellule hanno mostrato una correzione significativa con un aumento della variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e una diminuzione della variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172. la risposta correttiva delle doppie terapie con funzione CFTR è stata valutata rispetto alla variazione di corrente di cortocircuito delle cellule HNE trattate con DMSO in risposta a forskolina e in risposta all'inibitore CFTR 172 sono state significativamente migliorate sia da VX-809 più VX-770 che da VX-661 più VX-770.Sono state confrontate tre diverse terapie modulatrici CFTR in HNE da sei pazienti omozigoti F508del. Se usato in combinazione con un correttore CFTR e un potenziatore, sia un vertice che un modulatore CFTR, ha corretto la variazione della corrente di cortocircuito in risposta alla forskolina e la variazione della corrente di cortocircuito in risposta all'inibitore CFTR 172 in misura simile. Quando si congelano le cellule HNE, è importante avere almeno 3 milioni di cellule per fiala crio per aumentare le possibilità di un buon risultato dopo lo scongelamento.L'attività cftr nelle cellule HNE ha dimostrato di essere un buon modello predittivo per valutare e regolare le terapie personalizzate nella fibrosi cistica.

Research

JoVE Journal

Biology

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