Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
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私たちは、研究に参加してくれたすべての患者とその家族に暖かく感謝します。この研究は、フランス・ヴァンクレ・ラ・ムコビシドース協会からの助成金によって支援されました。フランス協会ABCF 2およびVertex Pharmaceuticals Innovation Awards。

すべての実験は、ヘルシンキ宣言と人間の研究倫理に関するHuriet-Serusclat法によって記述されたガイドラインと規制に従って行われました。
1. フラスコおよび異種培地の調製
<ol><li>表1に記載したように増幅、空気 - 液体、および凍結媒体を調製する。</li>
	<li>コラーゲン50mgを0.2%氷酢酸100mLに溶解してヒトコラーゲンIVの原液を調製する。マグネ?...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

個別化医療の文脈でCFTR活性を測定するためのヒト気管支上皮(HBE)細胞の代理として患者由来の鼻上皮細胞を使用することが、HNEが培養物9、11における細胞の特性を再現することとして提案されている。HBE細胞培養に対するHNEの強力な利点は、それらが簡単かつ非侵襲的にサンプリングされることです。HNE細胞培養における短絡電流測定は、上皮を?...

嚢胞性線維症(CF)は、上皮1,2の頂端表面に位置するアニオンチャネルであるCFTRタンパク質の不在または機能不全をもたらす嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)遺伝子の変異に起因する常染色体劣性障害である。CFTR療法における最近の進歩は、疾患の予後を改善し、CFTR矯正剤とCFTR増強剤を組み合わせた最後の承認薬は、最も頻繁な変異p.Phe508del変異(F508del)を有するCF患者の肺機能および生活の質の大幅な改善をもたらした3,4。この有望な治療の進歩にもかかわらず、CF患者の約10%は、これらのCFTRモジュレーターによって救出できない変異を有するため、不適格である。これらの患者にとって、特定の変異について最も効率的な組み合わせを見つけるために、他の薬物または薬物の組み合わせをテストする必要があり、個別化療法の重要性を強調しています。
ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易であり、CFTR機能の指標としてのサイクリックAMP媒介塩化物(Cl−)輸送の定量を可能にする。HNE細胞はヒト気道の正確なモデルをもたらすが、その寿命は培養において限られている。培養技術の最適化のおかげで、患者由来の初代HNE細胞をRho関連キナーゼ阻害剤(ROCKi)で条件付きで再プログラムし、増幅し、微多孔性フィルター5,6上の気液界面(ALI)条件下で擬似層状上皮に分化させることができる5,6。HNE培養のための多数の培養プロトコールが存在し(市販、無血清、「自家製」、「フィーダー細胞との共培養など)、培地および培養条件の選択は、増殖、細胞集団の分化および上皮機能に影響を与えることが記載されている7、8。ここでのプロトコルは、CFTR機能アッセイのためにALIで分化される多数のHNE細胞を首尾よく得ることを可能にする、単純化されたフィーダーフリーのROCKi増幅法を提示する。
我々は、分化したHNE細胞において、CFTRモジュレーターによる48時間治療がCFTR依存性Cl- 電流の電気生理学的補正を誘導するのに十分であり、 インビトロで 観察される補正が患者の臨床的改善と相関し得ることを実証した9。したがって、HNE細胞は、基礎的なCF研究だけでなく、患者固有のCFTRモジュレーター試験を伴う前臨床試験にも適切なモデルである。個別化治療のこの文脈において、プロトコールの目標は、我々の条件で増殖したCF患者由来の凍結保存HNE細胞がCFTR補正研究のための適切なモデルであり、新鮮および凍結融解細胞からのCFTR依存性Cl- 輸送を比較する場合、同様の結果が期待できることを検証することであった。この研究はまた、二重療法および三重療法を使用する場合の異なるCFTRモジュレーターの有効性を評価した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

ヒト鼻上皮(HNE)細胞は、簡単で非侵襲的な鼻ブラッシングによって収集が容易である。患者由来の初代HNE細胞を増幅し、気液界面条件下で擬似層状上皮に分化させて、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)機能の指標として環状AMP媒介塩化物(Cl-)輸送を定量化することができる。鼻ブラッシングの質や凍結保存時の細胞密度などの重要なステップを効率的に行えば、HNE細胞をバイオバンク化することに成功することができます。さらに、短絡電流研究は、凍結融解がHNE細胞の電気生理学的特性およびCFTR変調器に対する応答を有意に変化させないことを実証している。本試験で用いた培養条件では、クライオバイアルあたり2 x106 細胞未満が凍結されると、故障率が非常に高い。クライオバイアルあたり少なくとも3 x106 セルを凍結することをお勧めします。我々は、CFTR補正器とCFTR増強剤を組み合わせた二重療法が、F508delホモ接合型HNE細胞におけるCFTR活性に対して同等の補正有効性を有することを示す。トリプルセラピーVX-445 + VX-661 + VX-770は、二重療法VX-809 + VX-770と比較してCFTR活性の補正を有意に増加させた。HNE細胞におけるCFTR活性の測定は、CFTRモジュレーター療法を導くのに有用な有望な前臨床バイオマーカーである。

気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、免疫染色によって評価されるように、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示す(図1)。HNE細胞は、繊毛化(陽性α-チューブリン染色)および非繊毛粘液産生杯細胞(陽性Muc5Ac免疫染色)からなる擬似重層化呼吸器上皮の in vivo 状況を模倣する上皮細胞の不均一な層(陽性ケラチン8免疫染色)に再分化する。全体的な上皮...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

ここでは、空気-液体界面での初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞の単離、増幅、分化、および増幅HNEの凍結と融解に成功することを可能にするバイオバンキングプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化したHNE細胞の電気生理学的特性と、異なるモジュレーター処理時のCFTR関連の塩化物分泌補正を分析します。

初代ヒト鼻上皮細胞:精密医療の文脈におけるバイオバンキング

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

このプロトコルは、初代鼻上皮細胞を増幅、分化、および凍結保存するための重要なステップを強調しています。我々の培養条件では、初代鼻上皮細胞が肺上皮を模倣する。これにより、新鮮な細胞またはバイオバンク細胞からの患者由来の培養および個別化医療研究が可能になります。患者由来の鼻上皮培養物は、CFTR活性を評価し、新しい治療法に対する患者の個々の応答を評価することによって嚢胞性線維症治療を支援するために使用することができる。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアであるAurelie Hattonです。開始するには、鼻上皮またはHNE細胞を、10ミリリットルの増幅培地中で増殖させる。75平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコで摂氏37度と二酸化炭素5%で、80〜90%のコンフルエントに達するまでインキュベートする。培地を48~72時間ごとに交換してください。その後、10ミリリットルのマグネシウムおよびカルシウムを含まないDPBSで細胞を洗浄する。生理食塩水を吸引して捨てる。2ミリリットルの0.25%トリプシンを加える前に、フラスコをインキュベーターに8〜12分間戻した。後で、細胞の剥離を助けるために手のひらでフラスコをしっかりと叩きます。10ミリリットルの増幅培地を加え、酵素反応を停止させた。10ミリリットルのピペットを用いてフラスコを激しくすすぎ、フラスコ表面上に増幅培地を引き上げて排出し、細胞をすすぎ、剥離し、細胞を15ミリリットルのチューブに集める。細胞懸濁液を500倍Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを5〜10ミリリットルの増幅培地に再懸濁する。その後、血球計数器で細胞を数えます。細胞計数後、細胞を摂氏4度で5分間、500倍Gで遠心分離し、上清を捨てる。次いで、ペレットを濃縮凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに入れて1ミリリットルあたり10〜6個の細胞を3〜5回得た。マイナス80°Cの適切なクライオフリーズ容器内で、毎分約1°Cの温度を下げて細胞をゆっくりと凍結します。翌日、保存した試料を窒素保存容器に移し、長期保存する。新しく調製した増幅培地を摂氏37度に設定した水浴中で温める。窒素貯蔵タンクからクライオバイアルを取り出し、バイアル全体を水に浸さないように注意しながら、それらを水浴に素早く置きます。小さな凍った液滴だけが残っているときに、クライオバイアルを水浴から取り出します。バイアルを70%のアルコールで拭き取り、ボンネットの下に置きます。1ミリリットルのピペットを用いて、解凍した細胞を15ミリリットルのチューブに移す。次いで、1ミリリットルの温かい増幅媒体を滴下して加える。1分後、さらに1ミリリットルの増幅培地を加え、1分間待ちます。10ミリリットルの増幅培地を加え、500倍Gで摂氏4度で2分間遠心分離する。上清を吸引して捨てる。1ミリリットル当たり6個の細胞に対して10倍の細胞密度を達成するために必要な容量の増幅培地にペレットを再懸濁する。増幅培地を入れた25平方センチメートルのコラーゲンコーティングフラスコに細胞を播種した後、細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。先に実証したように細胞増幅を行う前に、2〜3日間にわたって細胞増殖を目視で観察する。0.33平方センチメートルのコラーゲンコーティング多孔質フィルター上に、フィルターあたり10〜5番目の細胞を3.3倍の密度で細胞を播種し、頂端側に300マイクロリットルの増幅培地、側底側に900マイクロリットルの空気液体培地を補充する。3日後、頂端培地を吸引し、気液培地中で3~4週間、気液界面で細胞を培養し、分化上皮を樹立する。48〜72時間ごとに基礎培地を交換してください。気液界面で培養された新鮮なHNE細胞は、分極および分化した呼吸器上皮の典型的な特徴を示した。78個のHNE細胞サンプルにおいて、フラッシング培地中での輸送の直後および1〜7日後に播種した鼻ブラッシングにおける成功率を比較した。成功した培養物の初期平均パーセンテージは82%であり、0〜5日間に播種されたサンプルでは87%に達した。新鮮な条件下での分化に成功したサンプルの83%は、凍結保存されたサンプルでも成功しました。同様に、新鮮な条件下での鑑別に失敗したサンプルでは、71%が凍結融解条件下でも失敗しました。また、クライオバイアルあたり10~6個の細胞を2~3回の間で凍結したサンプルの50%は融解時に増殖に失敗し、6個の細胞に対して10~10個の2回以下では80%に達した。DMSO処理HNE細胞におけるフォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化については、新鮮または凍結融解HNEの間に有意差は認められなかった。治療後、両方の細胞型は、フォルスコリンに応答した短絡電流変化の増加およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化の減少を伴う有意な補正を示した。CFTR機能二重療法の矯正応答は、DMSO処理されたHNE細胞と比較して、フォルスコリンに応答し、CFTR阻害剤172に応答して短絡電流変化がVX−809+VX−770、およびVX−661+VX−770の両方によって有意に改善されたと評価された。6人のF508delホモ接合型患者からのHNEにおける3つの異なるCFTRモジュレーター療法が比較された。CFTR補正器とポテンショネータとを組み合わせて使用する場合、頂点およびCFTR変調器の両方を、フォルスコリンに応答した短絡電流変化およびCFTR阻害剤172に応答した短絡電流変化を同程度に補正する。HNE細胞を凍結する場合、解凍時に良好な結果が得られる可能性を高めるためには、クライオバイアルあたり少なくとも300万個の細胞を有することが重要です。HNE細胞におけるCFTR活性は、嚢胞性線維症における個別化療法を評価および調整するための良好な予測モデルであることが示されている。

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

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RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

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Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

エア·液界面での人間の鼻上皮細胞の培養

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

正常に伝達する初代ヒト気管支上皮細胞に必要な最適なレンチウイルスの生産および細胞培養条件

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

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The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...