Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
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우리는 연구에 참여한 모든 환자와 그 가족에게 진심으로 감사드립니다. 이 작품은 프랑스 협회 Vaincre la Mucoviscidose의 보조금으로 지원되었습니다. 프랑스 협회 ABCF 2 및 버텍스 제약 혁신 상.

모든 실험은 헬싱키 선언과 인간 연구 윤리에 관한 Huriet-Serusclat 법에 의해 설명 된 지침과 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 플라스크 및 다른 매체의 준비
<ol><li>표 1에 기재된 바와 같이 증폭, 공기-액체 및 동결 매질을 준비한다.</li>
	<li>콜라겐 50 mg을 0.2% 빙초산 100 mL에 용해시켜 인간 콜라겐 IV의 원액을 제조하였다. 적어도 1 시간 동안 자기 교반기?...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

개인화된 의학의 맥락에서 CFTR 활성을 측정하기 위한 인간 기관지 상피(HBE) 세포의 대리자로서 환자 유래 비강 상피 세포의 사용은 HNE가 배양물 9,11에서 세포의 특성을 재생산함에 따라 제안되었다. HBE 세포 배양에 비해 HNE의 강력한 장점은 이들이 쉽고 비침습적으로 샘플링된다는 것이다. HNE 세포 배양물에서의 단락 전류 측정은 상피를 가로지르는 CFTR...

낭포성 섬유증 (CF)은 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 유전자의 돌연변이로 인해 CFTR 단백질의 부재 또는 기능 장애를 초래하는 상염색체 열성 장애로, 상피 1,2의 정점 표면에 위치한 음이온 채널입니다. CFTR 요법의 최근 발전은 질병의 예후를 개선했으며, CFTR 교정제와 CFTR 강화제를 결합한 마지막 승인 된 약물은 가장 빈번한 돌연변이 p.Phe508del 돌연변이 (F508del)3,4를 가진 CF 환자의 폐 기능과 삶의 질을 크게 향상 시켰습니다. 이러한 유망한 치료 진행에도 불구하고, CF 환자의 약 10 %는 이러한 CFTR 조절제에 의해 구출 할 수없는 돌연변이를 가지고 있기 때문에 부적격합니다. 이러한 환자의 경우, 특정 돌연변이에 대한 가장 효율적인 조합을 찾기 위해 다른 약물 또는 약물 조합을 테스트하여 개인화 된 치료법의 중요성을 강조 할 필요가 있습니다.
인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질에 의해 수집하기 쉽고 CFTR 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물 (Cl-) 수송의 정량화를 허용합니다. HNE 세포는 인간 기도의 정확한 모델을 산출하지만, 그들의 수명은 배양에서 제한된다. 배양 기술의 최적화 덕분에, 환자 유래 일차 HNE 세포는 미세다공성 필터5,6 상에서 Rho-associated kinase inhibitor (ROCKi)로 조건부로 재프로그래밍되고, 증폭되고, 공기-액체 계면 (ALI) 조건에서 의사-층화된 상피로 분화될 수 있다. HNE 배양을 위한 수많은 배양 프로토콜(시판, 무혈청, "수제", 피더-세포와의 공동 배양 등)이 존재하며, 배지 및 배양 조건의 선택은 성장, 세포 집단 분화 및 상피 기능에 영향을 미치기 위해 기술되었다 7,8. 여기서 프로토콜은 CFTR 기능 분석을 위해 ALI에서 분화되는 많은 수의 HNE 세포를 성공적으로 수득할 수 있는 단순화된 피더가 없는 ROCKi 증폭 방법을 제시합니다.
우리는 분화된 HNE 세포에서, CFTR 조절제를 사용한 48시간 처리가 CFTR 의존성 Cl- 전류의 전기생리학적 교정을 유도하기에 충분하고, 시험관내에서 관찰된 교정이 환자의 임상적 개선과 상관관계가 있을 수 있음을 입증하였다9. 따라서 HNE 세포는 기본적인 CF 연구뿐만 아니라 환자 별 CFTR 조절제 테스트를 통한 전임상 연구에 적합한 모델을 나타냅니다. 개인화 된 치료의 이러한 맥락에서, 프로토콜의 목표는 우리의 조건에서 자란 CF 환자의 냉동 보존 HNE 세포가 CFTR 교정 연구에 적합한 모델임을 검증하는 것이 었으며, 신선하고 냉동 해동 된 세포로부터의 CFTR 의존성 Cl- 수송을 비교할 때 유사한 결과가 예상 될 수 있습니다. 이 연구는 또한 이중 및 삼중 요법을 사용할 때 다른 CFTR 조절제의 효능을 평가했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

인간 비강 상피 (HNE) 세포는 간단하고 비 침습적 인 비강 칫솔질로 쉽게 수집 할 수 있습니다. 환자 유래 일차 HNE 세포는 공기-액체 계면 조건에서 의사층화된 상피로 증폭 및 분화되어 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 기능의 지표로서 순환 AMP 매개 염화물(Cl-) 수송을 정량화할 수 있다. 냉동 보존시 비강 양치의 품질 및 세포 밀도와 같은 중요한 단계가 효율적으로 수행되면 HNE 세포를 성공적으로 바이오 뱅크 할 수 있습니다. 또한, 단락 전류 연구는 동결 해동이 HNE 세포의 전기 생리 학적 특성과 CFTR 조절제에 대한 반응을 크게 변화시키지 않는다는 것을 보여줍니다. 본 연구에 사용된 배양 조건에서, 동결 당 2 x 10미만의 6 세포가 동결될 때, 실패율은 매우 높다. 우리는 냉동 당 적어도 3 x 106 세포를 동결하는 것이 좋습니다. 우리는 CFTR 교정기와 CFTR 강화제를 결합하는 이중 요법이 F508del-동형접합성 HNE 세포에서 CFTR 활성에 대해 필적할만한 보정 효능을 갖는다는 것을 보여준다. 삼중 요법 VX-445 + VX-661 + VX-770은 이중 요법 VX-809 + VX-770에 비해 CFTR 활성의 보정을 유의하게 증가시켰다. HNE 세포에서 CFTR 활성의 측정은 CFTR 조절제 요법을 안내하는데 유용한 유망한 전임상 바이오마커이다.

공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 면역염색에 의해 평가된 바와 같이 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타낸다(도 1). HNE 세포는 섬모(양성 알파-튜불린 염색) 및 비섬모 점액 생성 잔 세포(양성 Muc5Ac 면역염색)로 구성된 의사층화된 호흡기 상피의 생체내 상황을 모방하는 상피 세포의 이질층(양성 케라틴 8 면역염색)으로 재분화한다. 전체 상...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

여기서 우리는 공기-액체 계면에서 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포의 단리, 증폭 및 분화 및 증폭 된 HNE를 성공적으로 동결 및 해동 할 수있게 해주는 바이오 뱅킹 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 상이한 조절제 처리시 분화된 HNE 세포의 전기생리학적 특성 및 CFTR 관련 염화물 분비 보정을 분석한다.

일차 인간 비강 상피 세포 : 정밀 의학의 맥락에서 바이오 뱅킹

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

이 프로토콜은 일차 비강 상피 세포를 증폭, 분화 및 동결보존하기 위한 주요 단계를 강조합니다. 우리의 배양 조건에서, 원발성 비강 상피 세포는 폐 상피를 모방한다. 이를 통해 환자 유래 배양 및 신선한 또는 바이오 뱅크 세포에서 개인화 된 의학 연구가 가능합니다.환자 유래 비강 상피 배양물을 사용하여 CFTR 활성을 평가하고 새로운 치료법에 대한 환자의 개별 반응을 평가함으로써 낭포성 섬유증 치료를 도울 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어 인 Aurelie Hatton이 될 것입니다. 시작하려면 비강 상피 또는 HNE 세포를 10 밀리리터의 증폭 배지에서 성장시킵니다.섭씨 37도 및 5% 이산화탄소가 80 내지 90%컨플루언시에 도달할 때까지 75 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크에서 인큐베이션한다. 48~72시간마다 배지를 교체하십시오. 나중에 10 밀리리터의 마그네슘과 칼슘이없는 DPBS로 세포를 씻으십시오.염분을 흡인하고 버리십시오. 0.25 % 트립신 2 밀리리터를 첨가하고 플라스크를 8 ~ 12 분 동안 인큐베이터로 반환하기 전에. 나중에 플라스크를 손바닥으로 단단히 두드려 세포 분리를 돕습니다.효소 반응을 멈추기 위해 증폭 배지 10 밀리리터를 첨가한다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 플라스크를 격렬하게 헹구고 플라스크 표면 위로 증폭 배지를 뽑아 내고 배출하여 세포를 헹구고 분리하고 세포를 15 밀리리터 튜브에 수집하십시오. 세포 현탁액을 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.펠렛을 다섯 내지 10밀리리터의 증폭 배지에 재현탁시킨다. 그런 다음 혈구 측정기에서 세포를 계산하십시오. 세포 계수 후, 세포를 섭씨 네 도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.그 후 펠렛을 농축된 동결 배지에 재현탁시켜 밀리리터 당 여섯 개의 세포를 10회 내지 세 번 내지 다섯 번 수득하고 냉동 바이알에 놓는다. 영하 80도의 적절한 냉동 냉동 용기에서 분당 약 섭씨 한 도만큼 온도를 낮춤으로써 세포를 천천히 동결시킵니다. 다음 날, 보존된 샘플을 장기 보관을 위해 질소 저장 용기로 옮깁니다.갓 준비한 증폭 배지를 섭씨 37도로 설정된 수조에서 따뜻하게 합니다. 질소 저장 탱크에서 냉동 바이알을 제거하고 신속하게 수조에 넣고 바이알 전체를 물에 담그지 않도록주의하십시오. 작은 얼어 붙은 물방울 만 남을 때 수조에서 냉동 바이알을 제거하십시오.바이알을 70 % 알코올로 닦아 후드 아래에 놓습니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 해동 된 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 한 밀리리터의 따뜻한 증폭 배지를 드롭 와이즈 방식으로 첨가하십시오.잠시 후 증폭 배지 한 밀리리터를 더 넣고 잠시 기다립니다. 증폭 배지 10 밀리리터를 넣고 섭씨 네 도에서 두 분 동안 500 배 G에서 원심 분리하십시오. 상층액을 흡인하고 버립니다.펠렛을 밀리리터 당 1회 10 내지 여섯 개의 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 요구되는 증폭 배지의 부피에 재현탁시킨다. 세포를 증폭 배지를 함유하는 25 평방 센티미터의 콜라겐 코팅 플라스크 상에 시딩한 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션한다. 앞서 입증된 바와 같이 세포 증폭을 수행하기 전에 이삼일에 걸친 세포 확장을 육안으로 관찰한다.세포를 0.33 평방 센티미터 콜라겐 코팅 다공성 필터에 필터 당 3.3 배 10 내지 5 번째 세포의 밀도로 시드하고, 정점 측에서 300 마이크로리터의 증폭 배지와 기저측에서 900 마이크로리터의 공기 액체 배지로 보충한다. 사흘 후, 정점 배지를 흡인하고 세포를 공기-액체 배지에서 삼 내지 사주 동안 공기-액체 계면에서 배양하여 분화된 상피를 확립한다. 48 ~ 72 시간마다 기본 배지를 교체하십시오.공기-액체 계면에서 배양된 신선한 HNE 세포는 편광되고 분화된 호흡 상피의 전형적인 특징을 나타내었다. 78개의 HNE 세포 샘플에서, 성공률은 플러싱 배지에서 운반 즉시 및 운반 후 즉시 시딩된 비강 양치에서 비교되었다. 성공적인 배양의 초기 평균 비율은 82 %였으며 0에서 5 일 사이에 시드 된 샘플에서 87 %에 도달했습니다.신선한 조건에서 성공적으로 분화된 샘플의 83%는 또한 동결보존된 샘플에서 성공적이었다. 마찬가지로, 신선한 조건에서 분화하지 못한 샘플에서 71 %는 동결 해동 조건에서도 실패했습니다. 더욱이, 냉동 바이알 당 10 내지 6개의 세포 사이에서 두 내지 세 번 사이에 동결된 샘플의 50%는 해동될 때 성장하지 못하여, 6개의 세포에 대해 두 번 10회 미만으로 80%에 도달하였다.DMSO 처리된 HNE 세포에서 CFTR 억제제(172)에 반응하는 포스콜린 및 단락 전류 변화에 반응하는 단락 전류 변화에 대해, 신선 또는 냉동 해동된 HNE 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 치료 시, 두 세포 유형 모두 포스콜린에 대한 반응의 단락 전류 변화의 증가와 CFTR 억제제 172에 대한 반응의 단락 전류 변화의 감소와 함께 상당한 보정을 나타냈다. CFTR 기능 이중 요법의 시정 반응은 포스콜린에 대한 반응에서 DMSO 처리된 HNE 세포 단락 전류 변화와 비교하여 평가되었고, CFTR 억제제 172에 대한 반응으로 VX-809 플러스 VX-770 및 VX-661 플러스 VX-770 둘 다에 의해 유의하게 개선되었다.6명의 F508del 동형접합성 환자로부터의 HNE에서 세 가지 상이한 CFTR 조절제 요법을 비교하였다. CFTR 보정기 및 전위제, 정점 및 CFTR 변조기 둘 다와 함께 사용될 때, CFTR 억제제(172)에 반응하여 포스콜린 및 단락 전류 변화에 응답하여 단락 전류 변화를 유사한 정도로 보정한다. HNE 세포를 동결시킬 때, 해동 시 좋은 결과를 얻을 가능성을 높이기 위해 냉동 바이알 당 적어도 3백만 개의 세포를 보유하는 것이 중요하다.HNE 세포에서의 CFTR 활성은 낭포성 섬유증에서 개인화된 치료법을 평가하고 조정하는데 좋은 예측 모델인 것으로 나타났다.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Explants에서 들어라 기본 인간 기관지 상피 세포

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

연구

생물학

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

최적의 Lentivirus 생산 및 세포 배양 조건에 필요한 성공적으로 형질 도입 기본 인간 기관지 상피 세포

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

마우스에 트랜스 상피 이온 수송 계량 비 전위차

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...