Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Vi takker alle pasienter og deres familier for deltakelse i studien. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra den franske foreningen Vaincre la Mucoviscidose; French Association ABCF 2 og Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Alle eksperimenter ble utført etter retningslinjene og forskriftene beskrevet av Helsinkideklarasjonen og Huriet-Serusclat-loven om menneskelig forskningsetikk.
1. Forberedelse av kolber og forskjellige medier
<ol><li>Forbered forsterkning, luftvæske og frysemedium som beskrevet i tabell 1.</li>
	<li>Forbered en lagerløsning av human kollagen IV ved å oppløse 50 mg kollagen i 100 ml 0,2% issyre. Bland på en magnetisk rører i minst 1 time, og filtrer s...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Bruk av pasientavledede neseepitelceller som surrogater for humane bronkiale epitelceller (HBE) for å måle CFTR-aktivitet i sammenheng med persontilpasset medisin er foreslått som HNE reproduserer cellenes egenskaper i kultur 9,11. Den sterke fordelen med HNE over HBE cellekulturer er at de er lett og ikke-invasivt samplet. Kortslutningsstrømmålinger i HNE-cellekulturer muliggjør vurdering av CFTR-avhengig Cl-transport på tvers av epitelet, som ...

Cystisk fibrose (CF) er en autosomal resessiv lidelse som følge av mutasjoner i Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) genet som fører til fravær eller dysfunksjon av CFTR-proteinet, en anionkanal som ligger på den apikale overflaten av epithelia 1,2. Nylige fremskritt innen CFTR-behandling har forbedret prognosen for sykdommen, og de siste godkjente legemidlene som kombinerer CFTR-korrigerere og CFTR-potensiatorer førte til store forbedringer i lungefunksjon og livskvalitet for CF-pasienter som bærer den hyppigste mutasjonen p.Phe508del mutasjon (F508del)3,4. Til tross for denne lovende terapeutiske fremgangen, er rundt 10% av CF-pasientene ikke kvalifisert da de bærer mutasjoner som ikke kan reddes av disse CFTR-modulatorene. For disse pasientene er det behov for å teste andre legemidler eller legemiddelkombinasjoner for å finne den mest effektive kombinasjonen for spesifikke mutasjoner, og fremhever viktigheten av personlige terapier.
Humane neseepitelceller (HNE) er enkle å samle inn ved enkel, ikke-invasiv nesepussing og tillater kvantifisering av syklisk AMP-mediert klorid (Cl−) transport som en indeks for CFTR-funksjon. HNE-celler gir en nøyaktig modell av menneskelig luftvei, men levetiden er begrenset i kulturen. Takket være optimaliseringen av kulturteknikker kan pasientavledede primære HNE-celler omprogrammeres betinget med Rho-assosiert kinasehemmer (ROCKi), forsterket og differensiert til et pseudo-stratifisert epitel i luftvæskegrensesnitt (ALI) forhold på mikroporøs filtre 5,6. Tallrike kulturprotokoller for HNE-kultur eksisterer (kommersielt tilgjengelig, serumfri, "hjemmelaget", samkultur med materceller, etc.), og valg av medie- og kulturforhold har blitt beskrevet for å påvirke vekst, cellepopulasjonsdifferensiering og epitelfunksjon 7,8. Protokollen her presenterer en forenklet, materfri ROCKi-forsterkningsmetode som gjør det mulig å skaffe et stort antall HNE-celler som deretter differensieres hos ALI for CFTR-funksjonsanalyser.
Vi har vist at i differensierte HNE-celler er en 48 timers behandling med CFTR-modulatorer tilstrekkelig til å indusere elektrofysiologisk korreksjon av CFTR-avhengig Cl-strøm og at korreksjonen observert in vitro kan korreleres med pasientens kliniske forbedring9. HNE-celler representerer derfor en passende modell ikke bare for grunnleggende CF-forskning, men for prekliniske studier med pasientspesifikk CFTR-modulatortesting. I denne sammenhengen med personlig terapi var målet med protokollen å validere at kryopreserverte HNE-celler fra CF-pasienter, dyrket under våre forhold, var en passende modell for CFTR-korreksjonsstudier, og lignende resultater kunne forventes ved sammenligning av CFTR-avhengige Cl-transport fra friske og frosne celler. Studien vurderte også ulike CFTR-modulatorers effekt ved bruk av dobbelt- og trippelbehandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Humane neseepitelceller (HNE) er enkle å samle opp ved enkel, ikke-invasiv nesepussing. Pasientavledede primære HNE-celler kan forsterkes og differensieres til et pseudo-stratifisert epitel i luft-væske grensesnittforhold for å kvantifisere syklisk AMP-mediert klorid (Cl-) transport som en indeks av Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) funksjon. Hvis kritiske trinn som kvalitet på nesepussing og celletetthet ved kryopreservering utføres effektivt, kan HNE-celler lykkes med å biobankes. Videre viser kortslutningsstrømstudier at frysetining ikke endrer HNE-cellenes elektrofysiologiske egenskaper og respons på CFTR-modulatorer betydelig. I kulturforholdene som brukes i denne studien, når mindre enn 2 x 106 celler er frosset per kryolege, er feilfrekvensen svært høy. Vi anbefaler å fryse minst 3 x 106 celler per kryo toårig. Vi viser at doble terapier som kombinerer en CFTR-korrigerer med en CFTR-potensiering, har en sammenlignbar korreksjonseffekt for CFTR-aktivitet i F508del-homozygote HNE-celler. Trippelterapi VX-445 + VX-661 + VX-770 betydelig økt korreksjon av CFTR-aktivitet sammenlignet med dobbel terapi VX-809 + VX-770. Målet på CFTR-aktivitet i HNE-celler er en lovende preklinisk biomarkør som er nyttig for å veilede CFTR-modulatorbehandling.

Friske HNE-celler som dyrkes ved luftvæskegrensesnittet viser typiske trekk ved det polariserte og differensierte respiratoriske epitelet som vurderes ved immunstaining (figur 1). HNE-celler re-differensierer til et heterogent lag av epitelceller (positiv keratin 8 immunostaining) som etterligner in vivo-situasjonen til et pseudo-stratifisert respiratorisk epitel sammensatt av ciliated (positiv alfa-tubulinfarging) og ikke-ciliated slimproduserende begerceller (positiv Muc5Ac immun...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Her beskriver vi isolasjon, forsterkning og differensiering av primære humane neseepitelceller (HNE) ved luftvæskegrensesnittet og en biobankprotokoll som gjør det mulig å fryse og deretter tine forsterket HNE. Protokollen analyserer elektrofysiologiske egenskaper til differensierte HNE-celler og CFTR-relatert kloridsekresjonskorreksjon ved ulike modulatorbehandlinger.

Primære humane neseepitelceller: Biobanking i sammenheng med presisjonsmedisin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Denne protokollen fremhever de viktigste trinnene for å forsterke, differensiere og kryopreservere primære neseepitelceller. Under våre kulturforhold etterligner primære neseepitelceller lungeepitelet. Dette gjør det mulig for pasientavledede kulturer og personlige medisinstudier fra friske eller biobankede celler.De pasientavledede neseepitelkulturene kan brukes til å evaluere CFTR-aktivitet og hjelpe til med cystisk fibrosebehandling ved å evaluere pasientens individuelle respons på nye terapier. Aurelie Hatton, en ingeniør fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Til å begynne med, vokse neseepitele eller HNE-celler, i 10 milliliter forsterkningsmedium.Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en 75 kvadratcentimeter kollagenbelagt kolbe til den når 80 til 90% samløp. Bytt medium hver 48 til 72 timer. Senere vasker du cellene med 10 milliliter magnesium og kalsiumfri DPBS.Aspirer og kast saltvannet. Før du legger til to milliliter på 0,25% trypsin og returnerer kolben til inkubatoren i åtte til 12 minutter. Senere trykker du kolben fast med en håndflate for å hjelpe celleavløsning.Tilsett 10 milliliter av forsterkningsmediet for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Skyll kolben kraftig med en pipette på 10 milliliter for å trekke opp og utvise forsterkningsmediet over kolbeoverflaten for å skylle og løsne celler og samle cellene i et 15 milliliterrør. Sentrifuger cellefjæringen ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten.Re-suspendere pellet i fem til 10 milliliter forsterkning medium. Tell deretter cellene på et hemocytometer. Etter celletelling, sentrifuger cellene ved 500 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten.Deretter suspenderer du pelletsen i det berikede frysemediet for å oppnå tre til fem ganger 10 til de seks cellene per milliliter og plasseres i et cryo-hetteglass. Frys cellene langsomt ved å redusere temperaturen med omtrent en grad Celsius per minutt i en passende kryolysebeholder ved minus 80 grader Celsius. Neste dag flytter du den bevarte prøven til en nitrogenlagringsbeholder for langtidslagring.Varm det nylagde forsterkningsmediet i et vannbad satt til 37 grader Celsius. Fjern kryo hetteglass fra nitrogenlagringstanken og plasser dem raskt i vannbadet, pass på at du ikke senker hele hetteglasset i vann. Fjern kryo hetteglassene fra vannbadet når bare en liten frossen dråpe forblir.Tørk av hetteglassene med 70% alkohol og legg dem under hetten. Bruk en en milliliter pipette, overfør de tinte cellene til et 15 milliliterrør. Tilsett deretter en milliliter varm forsterkningsmedium på en dråpevis måte.Etter ett minutt, legg til en annen milliliter forsterkningsmedium og vent i et minutt. Tilsett 10 milliliter forsterkningsmedium og sentrifuger ved 500 ganger G i to minutter ved fire grader Celsius. Aspirer og kast supernatanten.Re-suspendere pellet i et volum av forsterkningsmedium som kreves for å oppnå en celletetthet på en gang 10 til de seks cellene per milliliter. Etter å ha sådd cellene på en 25 kvadratcentimeter kollagenbelagt kolbe, som inneholder forsterkningsmedium, inkuberer du cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Observer celleutvidelse visuelt over to til tre dager før du utfører celleforsterkning som vist tidligere.Frø cellene med en tetthet på 3,3 ganger 10 til femte celler per filter på 0,33 kvadratcentimeter kollagenbelagte porøse filtre, supplert med 300 mikroliter forsterkningsmedium på den apikale siden og 900 mikroliter luftvæskemedium på basolateralsiden. Etter tre dager aspirerer du det apikale mediet og kulturen cellene ved luftvæskegrensesnittet i tre til fire uker i luftvæskemediet for å etablere et differensiert epitel. Bytt basalmedium hver 48 til 72 timer.Friske HNE-celler dyrket ved luftvæskegrensesnittet viste en typisk del av det polariserte og differensierte respiratoriske epitelet. I de 78 HNE celleprøvene ble suksessratene sammenlignet i nesebørstefrø umiddelbart og etter en til syv dagers transport i et spylemedium. Den første gjennomsnittlige prosentandelen av vellykkede kulturer var 82%og nådde 87% i prøver sådd mellom null til fem dager.83% av prøvene som differensierte vellykket under friske forhold, lyktes også i kryopreserverte prøver. Tilsvarende, i prøver som ikke klarte å skille under friske forhold, var 71% også mislykket i fryse-tine forhold. Videre klarte ikke 50% av prøvene frosset mellom to til tre ganger 10 til de seks cellene per cryo hetteglass å vokse når de ble tint, og nådde 80% i under to ganger 10 til de seks cellene.For kortslutningsstrømendring som respons på forskolin og kortslutningsstrømendring som svar på CFTR-hemmer 172 i DMSO-behandlede HNE-celler, ble det ikke observert noen signifikant forskjell mellom fersk eller frossen tint HNE. Ved behandling viste begge celletypene betydelig korreksjon med en økning i kortslutningsstrømendring som respons på forskolin og en reduksjon i kortslutningsstrømendring som svar på CFTR-hemmer 172. korrigerende respons av CFTR-funksjon doble terapier ble vurdert sammenlignet med DMSO behandlet HNE celler kortslutning strøm endring som svar på forskolin og som svar på CFTR inhibitor 172 ble betydelig forbedret av både VX-809 pluss VX-770, og VX-661 pluss VX-770.Tre forskjellige CFTR-modulatorbehandlinger i HNE fra seks F508del homozygote pasienter ble sammenlignet. Når det brukes i kombinasjon med en CFTR-korrigerer og potensiering, korrigerte både toppunkt og CFTR-modulatorer kortslutningsstrømendring som svar på forskolin og kortslutningsstrømendring som svar på CFTR-hemmer 172 i tilsvarende grad. Ved frysing av HNE-celler er det viktig å ha minst 3 millioner celler per kryo hetteglass for å øke sjansene for et godt resultat ved opptining.CFTR-aktivitet i HNE-celler har vist seg å være en god prediktiv modell for å evaluere og justere personlige terapier i cystisk fibrose.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Purification (kvitre)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal Lentivirus Produksjon og cellekultur betingelser nødvendig for å kunne omsette Primær Menneskelig Bronkial epitelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potensiell forskjell å kvantifisere Trans-epitelial Ion Transport i mus

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Flercellet human alveolærmodell bestående av epitelceller og primære immunceller for farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...