Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Мы тепло благодарим всех пациентов и их семьи за участие в исследовании. Эта работа была поддержана грантами Французской ассоциации Vaincre la Mucoviscidose; Французская ассоциация ABCF 2 и Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами и правилами, описанными в Хельсинкской декларации и законе Хуриета-Серуслата об этике исследований человека.
1. Приготовление колб и различных сред
<ol><li>Подготовьте амплификацию, воздушно-?...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Было предложено использование носовых эпителиальных клеток, полученных от пациента, в качестве суррогатов эпителиальных клеток бронхов человека (HBE) для измерения активности CFTR в контексте персонализированной медицины, поскольку свойства клеток HNE воспроизводят в культуре</...

Муковисцидоз (CF) является аутосомно-рецессивным расстройством, возникающим в результате мутаций в гене регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR), приводящих к отсутствию или дисфункции белка CFTR, анионного канала, расположенного на апикальной поверхности эпителия 1,2. Последние достижения в терапии CFTR улучшили прогноз заболевания, а последние одобренные препараты, сочетающие корректоры CFTR и потенциаторы CFTR, привели к значительному улучшению функции легких и качества жизни пациентов с муковисцидозом, несущих наиболее частую мутацию p.Phe508del (F508del)3,4. Несмотря на этот многообещающий терапевтический прогресс, около 10% пациентов с муковисцидозом не имеют права на участие, поскольку они несут мутации, которые не могут быть спасены этими модуляторами CFTR. Для этих пациентов необходимо протестировать другие лекарства или комбинации лекарств, чтобы найти наиболее эффективную комбинацию для конкретных мутаций, подчеркивая важность персонализированной терапии.
Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собираются с помощью простой, неинвазивной чистки носа и позволяют количественно оценивать циклический транспорт хлорида (Cl−), опосредованный AMP, как индекс функции CFTR. Клетки HNE дают точную модель дыхательных путей человека, но их продолжительность жизни ограничена в культуре. Благодаря оптимизации методов культивирования полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть условно перепрограммированы ингибитором Rho-ассоциированной киназы (ROCKi), усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) на микропористых фильтрах 5,6. Существуют многочисленные протоколы культивирования для культуры HNE (коммерчески доступные, без сыворотки, «домашние», совместные культуры с фидерными клетками и т. Д.), И был описан выбор среды и условий культивирования, влияющих на рост, дифференцировку клеточной популяции и функцию эпителия 7,8. Протокол здесь представляет упрощенный, не содержащий фидера метод амплификации ROCKi, который позволяет успешно получить большое количество HNE-клеток, которые затем дифференцируются в ALI для анализа функции CFTR.
Мы продемонстрировали, что в дифференцированных клетках HNE 48-часовое лечение модуляторами CFTR является достаточным для индуцирования электрофизиологической коррекции CL-тока , зависящего от CFTR, и что коррекция, наблюдаемая in vitro , может коррелировать с клиническим улучшением пациента9. Таким образом, клетки HNE представляют собой подходящую модель не только для фундаментальных исследований муковисцидоза, но и для доклинических исследований с тестированием модулятора CFTR для конкретного пациента. В этом контексте персонализированной терапии цель протокола состояла в том, чтобы подтвердить, что криоконсервированные клетки HNE у пациентов с муковисцидозом, выращенные в наших условиях, были подходящей моделью для исследований коррекции CFTR, и аналогичные результаты можно было ожидать при сравнении CFTR-зависимого Cl-транспорта из свежих и замороженных размороженных клеток. В исследовании также оценивалась эффективность различных модуляторов CFTR при использовании двойной и тройной терапии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Клетки эпителия носа человека (HNE) легко собрать с помощью простой, неинвазивной чистки носа. Полученные от пациента первичные клетки HNE могут быть усилены и дифференцированы в псевдостратифицированный эпителий в условиях взаимодействия воздух-жидкость для количественной оценки циклического переноса хлорида (Cl-), опосредованного AMP, в качестве индекса функции регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Если критические шаги, такие как качество чистки носа и плотность клеток при криоконсервации, выполняются эффективно, клетки HNE могут быть успешно биобанкированы. Кроме того, исследования тока короткого замыкания показывают, что замораживание-оттаивание существенно не изменяет электрофизиологические свойства HNE-клеток и реакцию на модуляторы CFTR. В условиях культивирования, используемых в этом исследовании, когда замораживаются менее 2 х 106 клеток на криовиал, частота отказов очень высока. Мы рекомендуем замораживать не менее 3 х 106 клеток на криовиал. Показано, что двойные методы лечения, сочетающие корректор CFTR с потенциатором CFTR, имеют сопоставимую эффективность коррекции активности CFTR в F508del-гомозиготных клетках HNE. Тройная терапия VX-445 + VX-661 + VX-770 значительно увеличила коррекцию активности CFTR по сравнению с двойной терапией VX-809 + VX-770. Измерение активности CFTR в клетках HNE является многообещающим доклиническим биомаркером, полезным для руководства модуляторной терапией CFTR.

Свежие клетки HNE, культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, демонстрируют типичные особенности поляризованного и дифференцированного респираторного эпителия, оцениваемые иммуноокрашиванием (рисунок 1). Клетки HNE повторно дифференцируются в гетерогенный слой...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Здесь мы описываем выделение, усиление и дифференцировку первичных эпителиальных клеток носа человека (HNE) на границе раздела воздух-жидкость и протокол биобанкинга, позволяющий успешно замораживать, а затем размораживать усиленный HNE. Протокол анализирует электрофизиологические свойства дифференцированных клеток HNE и связанную с CFTR коррекцию секреции хлорида при различных модуляторных обработках.

Первичные эпителиальные клетки носа человека: биобанкинг в контексте прецизионной медицины

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Этот протокол выделяет ключевые шаги для амплификации, дифференцировки и криоконсервации первичных эпителиальных клеток носа. В условиях нашей культуры первичные эпителиальные клетки носа имитируют эпителий легких. Это позволяет проводить культуры, полученные из пациентов, и персонализированные медицинские исследования из свежих или биобанковских клеток.Полученные от пациента культуры эпителия носа могут быть использованы для оценки активности CFTR и помощи в терапии муковисцидоза путем оценки индивидуального ответа пациента на новые методы лечения. Продемонстрировать процедуру будет Аурели Хаттон, инженер из моей лаборатории. Для начала вырастите эпителиальные или HNE клетки носа, в 10 миллилитрах амплификационной среды.Инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в колбе площадью 75 квадратных сантиметров, покрытой коллагеном, пока она не достигнет 80-90% слияния. Меняйте среду каждые 48-72 часа. Позже промыть клетки 10 миллилитрами магния и кальция без DPBS.Аспирировать и отбросить физиологический раствор. Перед добавлением двух миллилитров 0,25% трипсина и возвратом колбы в инкубатор на восемь -12 минут. Позже плотно постучите по колбе ладонью, чтобы помочь отслоению клеток.Добавьте 10 миллилитров амплификационной среды, чтобы остановить ферментативную реакцию. Энергично промойте колбу, используя 10-миллилитровую пипетку, чтобы вытянуть и изгнать амплификационную среду над поверхностью колбы, чтобы промыть и отсоединить ячейки и собрать ячейки в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант.Повторно суспендировать гранулу в пяти-10 миллилитрах амплификационной среды. Затем подсчитайте клетки на гемоцитометре. После подсчета клеток центрифугируют клетки в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и отбрасывают супернатант.Затем повторно суспендируют гранулу в обогащенной морозильной среде для получения от трех до пяти раз по 10 до шести клеток на миллилитр и помещают в криокзлот. Медленно замораживайте клетки, снижая температуру примерно на один градус Цельсия в минуту в соответствующем криофризационном контейнере при минус 80 градусах Цельсия. На следующий день переместите сохраненный образец в контейнер для хранения азота для длительного хранения.Разогрейте свежеприготовленную амплификационную среду на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия. Извлеките криопузырики из резервуара для хранения азота и быстро поместите их на водяную баню, следя за тем, чтобы не погрузить весь флакон в воду. Снимите криопузырики с водяной бани, когда останется только небольшая замороженная капля.Протрите флаконы 70% спиртом и поместите их под капот. Используя одну миллилитровую пипетку, переместите размороженные ячейки в 15-миллилитровую трубку. Затем добавьте один миллилитр теплой амплификационной среды по каплям.Через одну минуту добавьте еще один миллилитр амплификационной среды и подождите минуту. Добавьте 10 миллилитров амплификационной среды и центрифугу в 500 раз G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Аспирировать и выбросить супернатант.Повторно суспендировать гранулу в объеме амплификационной среды, необходимой для достижения плотности ячейки от одного раза 10 до шести ячеек на миллилитр. После посева клеток на колбу площадью 25 квадратных сантиметров, покрытую коллагеном, содержащую амплификационную среду, инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Визуально наблюдайте за расширением клеток в течение двух-трех дней, прежде чем выполнять амплификацию клеток, как показано ранее.Засейте клетки с плотностью от 3,3 раза 10 до пятой ячейки на фильтр на 0,33 квадратных сантиметра покрытых коллагеном пористых фильтрах, дополненных 300 микролитрами амплификационной среды на апикальной стороне и 900 микролитрами воздушной жидкой среды на базолатеральной стороне. Через три дня аспирируйте аспиральную среду и культивируйте клетки на границе раздела воздух-жидкость в течение трех-четырех недель в воздушно-жидкой среде, чтобы создать дифференцированный эпителий. Меняйте базальную среду каждые 48-72 часа.Свежие клетки HNE, культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, демонстрировали типичные черты поляризованного и дифференцированного респираторного эпителия. В 78 образцах клеток HNE сравнивали показатели успеха при чистке носа сразу же и после одного-семи дней транспортировки в промывочной среде. Первоначальный средний процент успешных культур составлял 82% и достигал 87% в образцах, посеянных от нуля до пяти дней.83% образцов, которые успешно дифференцировались в свежих условиях, также были успешными в криоконсервированных образцах. Аналогичным образом, в образцах, которые не смогли дифференцироваться в свежих условиях, 71% также не были успешными в условиях замораживания-оттаивания. Более того, 50% образцов, замороженных от двух до трех раз по 10-шесть клеток на кри флакон, не выросли при размораживании, достигнув 80% для менее чем двух раз 10 до шести клеток.Для изменения тока короткого замыкания в ответ на форсколин и изменения тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172 в клетках, обработанных ДМСО, не наблюдалось существенной разницы между свежим или замороженным размороженным HNE. После лечения оба типа клеток демонстрировали значительную коррекцию с увеличением изменения тока короткого замыкания в ответ на форсколин и уменьшением изменения тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172. корректирующий ответ двойной терапии функцией CFTR оценивали по сравнению с изменениями тока короткого замыкания клеток HNE, обработанных ДМСО, в ответ на форсколин и в ответ на ингибитор CFTR 172 были значительно улучшены как VX-809 плюс VX-770, так и VX-661 плюс VX-770.Сравнивались три различных модулятора CFTR в HNE у шести гомозиготных пациентов F508del. При использовании в комбинации с корректором и потенциатором CFTR, как вершинными, так и CFTR-модуляторами, корректировали изменение тока короткого замыкания в ответ на форсколин и изменение тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172 в аналогичной степени. При замораживании клеток HNE важно иметь не менее 3 миллионов клеток на криокзлот, чтобы увеличить шансы на хороший результат при оттаивании.Было показано, что активность CFTR в клетках HNE является хорошей прогностической моделью для оценки и корректировки персонализированной терапии при муковисцидозе.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Хроматина Изоляция очистки РНК (чирпа)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Оптимальное Лентивирус производства и клеточной культуры условия, необходимые для успешного трансдукции Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Носовые разности потенциалов для количественного определения транс эпителиальных ионный транспорт в мышей

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Многоклеточная альвеолярная модель человека, состоящая из эпителиальных клеток и первичных иммунных клеток для оценки опасности

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...