Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
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Agradecemos calurosamente a todos los pacientes y sus familias por su participación en el estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Francesa Vaincre la Mucoviscidose; Asociación Francesa ABCF 2 y Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Todos los experimentos se realizaron siguiendo las directrices y regulaciones descritas por la Declaración de Helsinki y la ley Huriet-Serusclat sobre ética de la investigación humana.
1. Preparación de matraces y diferentes soportes
<ol><li>Preparar la amplificación, el aire-líquido y el medio de congelación como se describe en la Tabla 1.</li>
	<li>Prepare una solución madre de colágeno iv humano disolviendo 50 mg de colágeno en 100 ml de ácido ...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

El uso de células epiteliales nasales derivadas del paciente como sustitutos de las células epiteliales bronquiales humanas (HBE) para medir la actividad de CFTR en el contexto de la medicina personalizada se ha propuesto como propiedades de reproducción de células HNE en cultivo 9,11. La gran ventaja de la HNE sobre los cultivos de células HBE es que se muestrean de forma fácil y no invasiva. Las mediciones de corriente de cortocircuito en cultivos celular...

La fibrosis quística (FQ) es un trastorno autosómico recesivo resultante de mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) que conduce a la ausencia o disfunción de la proteína CFTR, un canal aniónico situado en la superficie apical de los epitelios 1,2. Los recientes avances en la terapia CFTR han mejorado el pronóstico de la enfermedad, y los últimos fármacos aprobados que combinan correctores CFTR y potenciadores CFTR condujeron a mejoras importantes en la función pulmonar y la calidad de vida de los pacientes con FQ portadores de la mutación p.Phe508del más frecuente (F508del)3,4. A pesar de este prometedor progreso terapéutico, alrededor del 10% de los pacientes con FQ no son elegibles ya que portan mutaciones que no son rescatables por estos moduladores CFTR. Para estos pacientes, existe la necesidad de probar otros medicamentos o combinaciones de medicamentos para encontrar la combinación más eficiente para mutaciones específicas, destacando la importancia de las terapias personalizadas.
Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo y permiten cuantificar el transporte cíclico de cloruro mediado por AMP (Cl−) como un índice de la función CFTR. Las células HNE producen un modelo preciso de las vías respiratorias humanas, pero su vida útil es limitada en cultivo. Gracias a la optimización de las técnicas de cultivo, las células HNE primarias derivadas del paciente pueden reprogramarse condicionalmente con inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCKi), amplificarse y diferenciarse en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido (ALI) en filtros microporosos 5,6. Existen numerosos protocolos de cultivo para el cultivo de HNE (disponibles comercialmente, sin suero, "caseros", cocultivos con células alimentadoras, etc.), y se ha descrito que la elección de los medios y las condiciones de cultivo afectan el crecimiento, la diferenciación de la población celular y la función epitelial 7,8. El protocolo aquí presenta un método de amplificación ROCKi simplificado, libre de alimentación, que permite obtener con éxito un gran número de células HNE que luego se diferencian en ALI para ensayos de función CFTR.
Hemos demostrado que, en células HNE diferenciadas, un tratamiento de 48 h con moduladores CFTR es suficiente para inducir la corrección electrofisiológica de la corriente Cl dependiente de CFTR y que la corrección observada in vitro puede estar correlacionada con la mejoría clínica del paciente9. Las células HNE, por lo tanto, representan un modelo apropiado no solo para la investigación fundamental de la FQ, sino también para estudios preclínicos con pruebas de modulador CFTR específicas del paciente. En este contexto de terapia personalizada, el objetivo del protocolo fue validar que las células HNE criopreservadas de pacientes con FQ, cultivadas en nuestras condiciones, eran un modelo apropiado para los estudios de corrección de CFTR, y se podían esperar resultados similares al comparar el transporte de Cl- dependiente de CFTR de células frescas y congeladas-descongeladas. El estudio también evaluó la eficacia de diferentes moduladores CFTR cuando se utilizan terapias duales y triples.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Las células epiteliales nasales humanas (HNE) son fáciles de recolectar mediante un cepillado nasal simple y no invasivo. Las células HNE primarias derivadas del paciente se pueden amplificar y diferenciar en un epitelio pseudoestratificado en condiciones de interfaz aire-líquido para cuantificar el transporte cíclico de cloruro (Cl-) mediado por AMP como un índice de la función reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Si los pasos críticos, como la calidad del cepillado nasal y la densidad celular tras la criopreservación, se pueden realizar de manera eficiente, las células HNE se pueden biobancar con éxito. Además, los estudios de corriente de cortocircuito demuestran que la congelación-descongelación no modifica significativamente las propiedades electrofisiológicas de las células HNE y la respuesta a los moduladores CFTR. En las condiciones de cultivo utilizadas en este estudio, cuando se congelan menos de 2 x 106 células por criovial, la tasa de fracaso es muy alta. Recomendamos congelar al menos 3 x 106 células por criovial. Demostramos que las terapias duales que combinan un corrector CFTR con un potenciador CFTR tienen una eficacia de corrección comparable para la actividad CFTR en células HNE F508del-homocigotas. La terapia triple VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentó significativamente la corrección de la actividad de CFTR en comparación con la terapia dual VX-809 + VX-770. La medida de la actividad de CFTR en células HNE es un biomarcador preclínico prometedor útil para guiar la terapia con moduladores de CFTR.

Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido muestran características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado evaluado por inmunotinción (Figura 1). Las células HNE se vuelven a diferenciar en una capa heterogénea de células epiteliales (inmunotinción positiva de queratina 8) que imitan la situación in vivo de un epitelio respiratorio pseudoestratificado compuesto por células caliciformes productoras de moco ciliadas (tinción positiv...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Aquí describimos el aislamiento, la amplificación y la diferenciación de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE) en la interfaz aire-líquido y un protocolo de biobanco que permite congelar con éxito y luego descongelar la HNE amplificada. El protocolo analiza las propiedades electrofisiológicas de las células HNE diferenciadas y la corrección de la secreción de cloruro relacionada con CFTR en diferentes tratamientos moduladores.

Células epiteliales nasales humanas primarias: biobancos en el contexto de la medicina de precisión

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Este protocolo destaca los pasos clave para amplificar, diferenciar y criopreservar las células epiteliales nasales primarias. En nuestras condiciones de cultivo, las células epiteliales nasales primarias imitan el epitelio pulmonar. Esto permite cultivos derivados de pacientes y estudios de medicina personalizada a partir de células frescas o biobancarias.Los cultivos epiteliales nasales derivados del paciente se pueden utilizar para evaluar la actividad de CFTR y ayudar con la terapia de fibrosis quística mediante la evaluación de la respuesta individual del paciente a las nuevas terapias. Demostrando el procedimiento estará Aurelie Hatton, una ingeniera de mi laboratorio. Para empezar, cultivar células epiteliales nasales o HNE, en 10 mililitros de medio de amplificación.Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en un matraz recubierto de colágeno de 75 centímetros cuadrados hasta que alcance una confluencia del 80 al 90%. Cambie el medio cada 48 a 72 horas. Más tarde, lave las células con 10 mililitros de DPBS libre de magnesio y calcio.Aspirar y desechar la solución salina. Antes de añadir dos mililitros de tripsina al 0,25% y devolver el matraz a la incubadora durante ocho a 12 minutos. Más tarde, golpee el matraz firmemente con una palma para ayudar al desprendimiento celular.Agregue 10 mililitros del medio de amplificación para detener la reacción enzimática. Enjuague vigorosamente el matraz con una pipeta de 10 mililitros para extraer y expulsar el medio de amplificación sobre la superficie del matraz para enjuagar y separar las células y recoger las células en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar la suspensión celular a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en cinco a 10 mililitros de medio de amplificación. Luego cuente las células en un hemocitómetro. Después del recuento celular, centrífuga las células a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y deseche el sobrenadante.Luego vuelva a suspender el pellet en el medio de congelación enriquecido para obtener de tres a cinco veces 10 a las seis células por mililitro y colóquelo en un vial criogénico. Congele lentamente las células reduciendo la temperatura en aproximadamente un grado Celsius por minuto en un recipiente criocongelante apropiado a menos 80 grados Celsius. Al día siguiente, mueva la muestra conservada a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno para su almacenamiento a largo plazo.Caliente el medio de amplificación recién preparado en un baño de agua a 37 grados centígrados. Retire los viales criogénicos del tanque de almacenamiento de nitrógeno y colóquelos rápidamente en el baño de agua, teniendo cuidado de no sumergir todo el vial en agua. Retire los viales criogénicos del baño de agua cuando solo quede una pequeña gota congelada.Limpie los viales con alcohol al 70% y colóquelos debajo del capó. Usando una pipeta de un mililitro, transfiera las células descongeladas a un tubo de 15 mililitros. Luego agregue un mililitro de medio de amplificación caliente de una manera superficial.Después de un minuto, agregue otro mililitro de medio de amplificación y espere un minuto. Agregue 10 mililitros de medio de amplificación y centrífuga a 500 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en un volumen de medio de amplificación necesario para lograr una densidad celular de una vez 10 a las seis celdas por mililitro. Después de sembrar las células en un matraz recubierto de colágeno de 25 centímetros cuadrados, que contiene un medio de amplificación, incuba las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Observe visualmente la expansión celular durante dos o tres días antes de realizar la amplificación celular como se demostró anteriormente.Sembrar las células a una densidad de 3,3 veces 10 a la quinta célula por filtro en filtros porosos recubiertos de colágeno de 0,33 centímetros cuadrados, complementados con 300 microlitros de medio de amplificación en el lado apical y 900 microlitros de medio líquido de aire en el lado basolateral. Después de tres días, aspire el medio apical y cultive las células en la interfaz aire-líquido durante tres a cuatro semanas en el medio aire-líquido para establecer un epitelio diferenciado. Cambie el medio basal cada 48 a 72 horas.Las células HNE frescas cultivadas en la interfaz aire-líquido mostraron características típicas del epitelio respiratorio polarizado y diferenciado. En las 78 muestras de células HNE, se compararon las tasas de éxito en el cepillado nasal sembrado inmediatamente y después de uno a siete días de transporte en un medio de lavado. El porcentaje medio inicial de cultivos exitosos fue del 82% y alcanzó el 87% en muestras sembradas entre cero y cinco días.El 83% de las muestras que se diferenciaron con éxito en condiciones frescas también tuvieron éxito en muestras criopreservadas. Del mismo modo, en muestras que no lograron diferenciarse en condiciones frescas, el 71% tampoco tuvo éxito en condiciones de congelación-descongelación. Además, el 50% de las muestras congeladas entre dos y tres veces 10 a las seis células por crio vial no crecieron cuando se descongelaron, alcanzando el 80% por debajo de dos veces 10 a las seis células.Para el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en células HNE tratadas con DMSO, no se observaron diferencias significativas entre HNE descongelada fresca o congelada. Tras el tratamiento, ambos tipos de células mostraron una corrección significativa con un aumento en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y una disminución en el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172. la respuesta correctiva de las terapias duales de función CFTR se evaluó en comparación con el cambio de corriente de cortocircuito de las células HNE tratadas con DMSO en respuesta a la forskolina y en respuesta al inhibidor de CFTR 172 mejoraron significativamente tanto por VX-809 más VX-770 como por VX-661 más VX-770.Se compararon tres terapias moduladoras de CFTR diferentes en HNE de seis pacientes homocigotos con F508del. Cuando se usa en combinación con un corrector y potenciador CFTR, tanto el vértice como un modulador CFTR, corrigen el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta a la forskolina y el cambio de corriente de cortocircuito en respuesta al inhibidor de CFTR 172 en una medida similar. Al congelar las células HNE, es importante tener al menos 3 millones de células por crio vial para aumentar las posibilidades de un buen resultado al descongelarse.Se ha demostrado que la actividad de CFTR en células HNE es un buen modelo predictivo para evaluar y ajustar las terapias personalizadas en la fibrosis quística.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Investigación

Biología

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

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Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

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Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

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