Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Vi tackar varmt alla patienter och deras familjer för deltagande i studien. Detta arbete stöddes av bidrag från den franska föreningen Vaincre la Mucoviscidose; Franska föreningen ABCF 2 och Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Alla experiment utfördes enligt de riktlinjer och föreskrifter som beskrivs i Helsingforsdeklarationen och Huriet-Serusclat-lagen om etik för mänsklig forskning.
1. Beredning av kolvar och olika medier
<ol><li>Förbered förstärkning, luftvätska och frysmedium enligt beskrivningen i tabell 1.</li>
	<li>Bered en stamlösning av humant kollagen IV genom att lösa upp 50 mg kollagen i 100 ml 0,2% isättika. Blanda på en magnetisk omrörare i minst 1 timm...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Användningen av patient-härledda nasala epitelceller som surrogater för humana bronkialepitelceller (HBE) för att mäta CFTR-aktivitet i samband med personlig medicin har föreslagits eftersom HNE reproducerar cellernas egenskaper i odling 9,11. Den starka fördelen med HNE jämfört med HBE-cellkulturer är att de enkelt och icke-invasivt provtas. Kortslutningsströmmätningar i HNE-cellkulturer möjliggör bedömning av CFTR-beroende Cl-transport...

Cystisk fibros (CF) är en autosomal recessiv störning som härrör från mutationer i genen Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) som leder till frånvaro eller dysfunktion av CFTR-proteinet, en anjonkanal belägen vid den apikala ytan av epitel 1,2. De senaste framstegen inom CFTR-terapi har förbättrat prognosen för sjukdomen, och de sista godkända läkemedlen som kombinerar CFTR-korrigerare och CFTR-potentiatorer ledde till stora förbättringar av lungfunktion och livskvalitet för CF-patienter som bär den vanligaste mutationen p.Phe508del-mutation (F508del)3,4. Trots dessa lovande terapeutiska framsteg är cirka 10% av CF-patienterna inte berättigade eftersom de bär mutationer som inte kan räddas av dessa CFTR-modulatorer. För dessa patienter finns det ett behov av att testa andra läkemedel eller läkemedelskombinationer för att hitta den mest effektiva kombinationen för specifika mutationer, vilket belyser vikten av personliga terapier.
Humana nasala epitelceller (HNE) är lätta att samla in genom enkel, icke-invasiv näsborstning och möjliggör kvantifiering av cyklisk AMP-medierad kloridtransport (Cl−) som ett index för CFTR-funktionen. HNE-celler ger en exakt modell av mänsklig luftväg, men deras livslängd är begränsad i odling. Tack vare optimeringen av odlingstekniker kan patient-härledda primära HNE-celler omprogrammeras villkorligt med Rho-associerad kinashämmare (ROCKi), förstärkas och differentieras till ett pseudo-stratifierat epitel i luft-vätskegränssnitt (ALI) -förhållanden på mikroporösa filter 5,6. Det finns många odlingsprotokoll för HNE-odling (kommersiellt tillgängliga, serumfria, "hemlagade", samodling med matarceller etc.), och val av media och odlingsförhållanden har beskrivits för att påverka tillväxt, cellpopulationsdifferentiering och epitelfunktion 7,8. Protokollet presenterar här en förenklad, matarfri, ROCKi-förstärkningsmetod som gör det möjligt att framgångsrikt erhålla ett stort antal HNE-celler som sedan differentieras vid ALI för CFTR-funktionsanalyser.
Vi har visat att i differentierade HNE-celler är en 48-timmars behandling med CFTR-modulatorer tillräcklig för att inducera elektrofysiologisk korrigering av CFTR-beroende Cl-ström och att den observerade korrigeringen in vitro kan korreleras med patientens kliniska förbättring9. HNE-celler representerar därför en lämplig modell inte bara för grundläggande CF-forskning utan för prekliniska studier med patientspecifik CFTR-modulatortestning. I detta sammanhang av personlig terapi var målet med protokollet att validera att kryokonserverade HNE-celler från CF-patienter, odlade under våra förhållanden, var en lämplig modell för CFTR-korrigeringsstudier, och liknande resultat kunde förväntas när man jämför CFTR-beroende Cl-transport från färska och frysta tinade celler. Studien utvärderade också olika CFTR-modulatorers effekt vid användning av dubbla och tredubbla terapier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

Mänskliga nasala epitelceller (HNE) är lätta att samla in genom enkel, icke-invasiv näsborstning. Patient-härledda primära HNE-celler kan förstärkas och differentieras till ett pseudo-stratifierat epitel i luft-vätskegränssnittsförhållanden för att kvantifiera cyklisk AMP-medierad kloridtransport (Cl-) som ett index för cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) -funktion. Om kritiska steg som kvalitet på näsborstning och celltäthet vid kryokonservering utförs effektivt kan HNE-celler framgångsrikt biobankas. Dessutom visar kortslutningsströmstudier att frysning-upptining inte signifikant modifierar HNE-cellernas elektrofysiologiska egenskaper och svar på CFTR-modulatorer. Under odlingsförhållandena som används i denna studie, när mindre än 2 x 106 celler fryses per kryovulium, är felfrekvensen mycket hög. Vi rekommenderar att du fryser minst 3 x 106 celler per kryovial. Vi visar att dubbla terapier som kombinerar en CFTR-korrigerare med en CFTR-potentiator har en jämförbar korrigeringseffekt för CFTR-aktivitet i F508del-homozygota HNE-celler. Trippelterapi VX-445 + VX-661 + VX-770 ökade signifikant korrigeringen av CFTR-aktivitet jämfört med dubbelterapi VX-809 + VX-770. Måttet på CFTR-aktivitet i HNE-celler är en lovande preklinisk biomarkör som är användbar för att vägleda CFTR-modulatorterapi.

Färska HNE-celler odlade vid luft-vätskegränssnittet visar typiska egenskaper hos det polariserade och differentierade andningsepitelet som bedöms genom immunfärgning (figur 1). HNE-celler återdifferentierar till ett heterogent skikt av epitelceller (positiv keratin 8-immunfärgning) som efterliknar in vivo-situationen för ett pseudostratifierat andningsepitel bestående av cilierad (positiv alfa-tubulinfärgning) och icke-cilierade slemproducerande bägare celler (positiv Mu...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Här beskriver vi isolering, förstärkning och differentiering av primära humana nasala epitelceller (HNE) vid luft-vätskegränssnittet och ett biobankprotokoll som gör det möjligt att framgångsrikt frysa och sedan tina förstärkt HNE. Protokollet analyserar elektrofysiologiska egenskaper hos differentierade HNE-celler och CFTR-relaterad kloridsekretionskorrigering vid olika modulatorbehandlingar.

Primära mänskliga nasala epitelceller: Biobanking i samband med precisionsmedicin

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Detta protokoll belyser de viktigaste stegen för att förstärka, differentiera och kryokonservera primära näsepitelceller. Under våra odlingsförhållanden efterliknar primära nasala epitelceller lungepitelet. Detta möjliggör patient härledda kulturer och personliga medicinstudier från färska eller biobankade celler.De patient-härledda nasala epitelkulturerna kan användas för att utvärdera CFTR-aktivitet och hjälpa till med cystisk fibrosbehandling genom att utvärdera patientens individuella svar på nya terapier. Demonstrerar proceduren kommer att vara Aurelie Hatton, en ingenjör från mitt laboratorium. För att börja, odla nasal epitel- eller HNE-celler, i 10 ml förstärkningsmedium.Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i en 75 kvadratcentimeter kollagenbelagd kolv tills den når 80 till 90% sammanflöde. Byt medium var 48: e till 72: e timme. Tvätta senare cellerna med 10 ml magnesium och kalciumfri DPBS.Aspirera och kassera saltlösningen. Innan du tillsätter två ml 0,25% trypsin och återför kolven till inkubatorn i åtta till 12 minuter. Senare knackar du på kolven ordentligt med en handflata för att hjälpa cellavskiljning.Tillsätt 10 ml av förstärkningsmediet för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Skölj kraftigt kolven med en 10 ml pipett för att dra upp och driva ut förstärkningsmediet över kolvytan för att skölja och lossa celler och samla cellerna i ett 15 ml rör. Centrifugera cellsuspensionen vid 500 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten.Suspendera pelleten i fem till 10 ml förstärkningsmedium. Räkna sedan cellerna på en hemocytometer. Efter cellräkning, centrifugera cellerna vid 500 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten.Suspendera sedan pelleten i det berikade frysmediet för att erhålla tre till fem gånger 10 till de sex cellerna per milliliter och placera i en kryoflaska. Frys långsamt cellerna genom att sänka temperaturen med ungefär en grad Celsius per minut i en lämplig kryofrysningsbehållare vid minus 80 grader Celsius. Nästa dag flyttar du det konserverade provet till en kväveförvaringsbehållare för långtidsförvaring.Värm det nyberedda förstärkningsmediet i ett vattenbad inställt på 37 grader Celsius. Ta bort kryoflaskor från kvävelagringstanken och placera dem snabbt i vattenbadet, var noga med att inte sänka ner hela injektionsflaskan i vatten. Ta bort kryoflaskorna från vattenbadet när endast en liten frusen droppe återstår.Torka av flaskorna med 70% alkohol och placera dem under huven. Använd en milliliter pipett och överför de tinade cellerna till ett 15 ml rör. Tillsätt sedan en milliliter varmt förstärkningsmedium på ett droppvis sätt.Efter en minut, tillsätt ytterligare en milliliter förstärkningsmedium och vänta en minut. Tillsätt 10 ml förstärkningsmedium och centrifugera vid 500 gånger G i två minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera och kassera supernatanten.Suspendera pelleten i en volym förstärkningsmedium som krävs för att uppnå en celltäthet på en gånger 10 till de sex cellerna per milliliter. Efter sådd av cellerna på en 25 kvadratcentimeter kollagenbelagd kolv, innehållande förstärkningsmedium, inkubera cellerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Observera visuellt cellexpansion under två till tre dagar innan cellförstärkning utförs, vilket visats tidigare.Frö cellerna med en densitet av 3,3 gånger 10 till den femte cellen per filter på 0,33 kvadratcentimeter kollagenbelagda porösa filter, kompletterade med 300 mikroliter förstärkningsmedium vid apikal sida och 900 mikroliter luftvätskemedium vid basolateralsidan. Efter tre dagar, aspirera det apikala mediet och odla cellerna vid luft-vätskegränssnittet i tre till fyra veckor i luft-vätskemediet för att upprätta ett differentierat epitel. Byt basalmediet var 48: e till 72: e timme.Färska HNE-celler odlade vid luft-vätskegränssnittet visade en typisk egenskap hos det polariserade och differentierade andningsepitelet. I de 78 HNE-cellproverna jämfördes framgångsgraden vid näsborstning som såddes omedelbart och efter en till sju dagars transport i ett spolmedium. Den ursprungliga genomsnittliga andelen framgångsrika kulturer var 82% och nådde 87% i prover sådda mellan noll och fem dagar.83% av de prover som differentierades framgångsrikt under färska förhållanden lyckades också i kryokonserverade prover. På samma sätt, i prover som inte lyckades differentiera under färska förhållanden, misslyckades 71% också under frys-tina förhållanden. Dessutom misslyckades 50% av proverna frysta mellan två till tre gånger 10 till de sex cellerna per kryoflaska att växa när de tinades och nådde 80% för under två gånger 10 till de sex cellerna.För kortslutningsströmförändring som svar på forskolin och kortslutningsströmförändring som svar på CFTR-hämmare 172 i DMSO-behandlade HNE-celler observerades ingen signifikant skillnad mellan färsk eller fryst tinad HNE. Vid behandling visade båda celltyperna signifikant korrigering med en ökning av kortslutningsströmförändringen som svar på forskolin och en minskning av kortslutningsströmförändringen som svar på CFTR-hämmare 172. det korrigerande svaret för CFTR-funktionen dubbla terapier utvärderades jämfört med DMSO-behandlade HNE-celler kortslutningsströmförändring som svar på forskolin och som svar på CFTR-hämmare 172 förbättrades signifikant av både VX-809 plus VX-770 och VX-661 plus VX-770.Tre olika CFTR-modulatorterapier i HNE från sex F508del homozygota patienter jämfördes. När den används i kombination med en CFTR-korrigerare och potentiator, både vertex- och en CFTR-modulatorer, korrigerade kortslutningsströmförändring som svar på forskolin och kortslutningsströmförändring som svar på CFTR-hämmare 172 i liknande utsträckning. Vid frysning av HNE-celler är det viktigt att ha minst 3 miljoner celler per kryoflaska för att öka chanserna för ett bra resultat vid upptining.CFTR-aktivitet i HNE-celler har visat sig vara en bra prediktiv modell för att utvärdera och justera personliga terapier vid cystisk fibros.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primär mänskliga Bronkial epitelceller vuxit från explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

Kromatin Isolering av RNA Rening (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirus Produktion och cellodlingsbetingelser behövs för att framgångsrikt omvandla primära humana Bronkial epitelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Flercelliga Human Alveolar modell sammansatt av epitelceller och primära immunceller för hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...