Name: primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Çalışmaya katıldıkları için tüm hastalara ve ailelerine içtenlikle teşekkür ederiz. Bu çalışma Fransız Derneği Vaincre la Mucoviscidose'den gelen hibelerle desteklendi; Fransız Birliği ABCF 2 ve Vertex İlaç İnovasyon Ödülleri.

Tüm deneyler, Helsinki Deklarasyonu ve insan araştırma etiği ile ilgili Huriet-Serusclat yasası tarafından açıklanan kılavuz ilkeler ve düzenlemeler uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. Şişelerin ve farklı ortamların hazırlanması
<ol><li>Amplifikasyon, hava-sıvı ve dondurma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>50 mg kolajenin% 0.2 buzul asetik asidin 100 mL'sinde çözündürülerek bir insan kollajen IV stok...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Kişiselleştirilmiş tıp bağlamında CFTR aktivitesini ölçmek için insan bronşiyal epitel (HBE) hücreleri için vekil olarak hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin kullanılması, HNE üreme hücrelerinin kültür 9,11'deki özellikleri olarak önerilmiştir. HNE'nin HBE hücre kültürlerine göre güçlü avantajı, kolayca ve invaziv olmayan bir şekilde örneklenmeleridir. HNE hücre kültürlerinde kısa devre akım ölçümleri, epitel boyunca C...

Kistik Fibrozis (KF), Epitel 1,2'nin apikal yüzeyinde bulunan bir anyon kanalı olan CFTR proteininin yokluğuna veya işlev bozukluğuna yol açan Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) genindeki mutasyonlardan kaynaklanan otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. CFTR tedavisindeki son gelişmeler hastalığın prognozunu iyileştirmiş ve CFTR düzelticileri ile CFTR güçlendiricilerini birleştiren son onaylanmış ilaçlar, en sık görülen p.Phe508del mutasyonu (F508del)3,4 mutasyonunu taşıyan KF hastalarında akciğer fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde önemli iyileşmelere yol açmıştır. Bu umut verici terapötik ilerlemeye rağmen, KF hastalarının yaklaşık% 10'u, bu CFTR modülatörleri tarafından kurtarılamayan mutasyonlar taşıdıkları için uygun değildir. Bu hastalar için, spesifik mutasyonlar için en etkili kombinasyonu bulmak için diğer ilaçları veya ilaç kombinasyonlarını test etmeye ihtiyaç vardır ve kişiselleştirilmiş tedavilerin önemini vurgulamaktadır.
İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır ve CFTR fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl−) transportunun nicelleştirilmesine izin verir. HNE hücreleri, insan hava yolunun doğru bir modelini verir, ancak ömürleri kültürde sınırlıdır. Kültür tekniklerinin optimizasyonu sayesinde, hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) ile şartlı olarak yeniden programlanabilir, çoğaltılabilir ve mikro gözenekli filtrelerüzerindeki hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında psödo-tabakalaşmış bir epitel haline getirilebilir 5,6. HNE kültürü için çok sayıda kültür protokolü mevcuttur (ticari olarak temin edilebilir, serumsuz, "ev yapımı", besleyici hücrelerle ortak kültür, vb.) ve büyümeyi, hücre popülasyonu farklılaşmasını ve epitel fonksiyonunu etkileyecek şekilde medya ve kültür koşullarının seçimi tanımlanmıştır 7,8. Buradaki protokol, CFTR fonksiyon tahlilleri için ALI'de farklılaştırılan çok sayıda HNE hücresinin başarılı bir şekilde elde edilmesini sağlayan basitleştirilmiş, besleyicisiz, ROCKi amplifikasyon yöntemi sunar.
Diferansiye HNE hücrelerinde, CFTR modülatörleri ile 48 saatlik bir tedavinin, CFTR'ye bağımlı Cl- akımının elektrofizyolojik düzeltmesini indüklemek için yeterli olduğunu ve in vitro olarak gözlenen düzeltmenin hastanın klinik iyileşmesi ile ilişkili olabileceğini gösterdik9. Bu nedenle HNE hücreleri, sadece temel KF araştırmaları için değil, hastaya özgü KFTR modülatör testi ile klinik öncesi çalışmalar için de uygun bir modeli temsil etmektedir. Bu kişiselleştirilmiş tedavi bağlamında, protokolün amacı, koşullarımızda yetiştirilen KF hastalarından kriyokorunmuş HNE hücrelerinin CFTR düzeltme çalışmaları için uygun bir model olduğunu doğrulamaktı ve taze ve dondurulmuş çözülmüş hücrelerden CFTR'ye bağımlı Cl-transportunu karşılaştırırken benzer sonuçlar beklenebilirdi. Çalışma ayrıca ikili ve üçlü tedaviler kullanırken farklı CFTR modülatörlerinin etkinliğini de değerlendirdi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

İnsan nazal epitel (HNE) hücrelerinin basit, invaziv olmayan nazal fırçalama ile toplanması kolaydır. Hasta kaynaklı primer HNE hücreleri, Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) fonksiyonunun bir indeksi olarak siklik AMP aracılı Klorür (Cl-) taşınımını ölçmek için hava-sıvı arayüz koşullarında psödo-tabakalı bir epitel haline getirilebilir ve farklılaştırılabilir. Burun fırçalama kalitesi ve kriyoprezervasyonda hücre yoğunluğu gibi kritik adımlar verimli bir şekilde gerçekleştirilirse, HNE hücreleri başarılı bir şekilde biyobankaya yatırılabilir. Ayrıca, kısa devre akım çalışmaları, donarak çözülmenin HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve CFTR modülatörlerine tepkisini önemli ölçüde değiştirmediğini göstermektedir. Bu çalışmada kullanılan kültür koşullarında, kriyov başına 2 x 106'dan az hücre dondurulduğunda, başarısızlık oranı çok yüksektir. Kriyov başına en az 3 x 106 hücre dondurmanızı öneririz. Bir CFTR düzelticisini bir CFTR güçlendiricisi ile birleştiren ikili tedavilerin, F508del-homozigot HNE hücrelerinde CFTR aktivitesi için karşılaştırılabilir bir düzeltme etkinliğine sahip olduğunu gösteriyoruz. Üçlü terapi VX-445 + VX-661 + VX-770, ikili terapi VX-809 + VX-770'e kıyasla CFTR aktivitesinin düzeltilmesini önemli ölçüde arttırmıştır. HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin ölçülmesi, CFTR modülatör tedavisine rehberlik etmek için yararlı olan umut verici bir klinik öncesi biyobelirteçtir.

Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, immün boyama ile değerlendirildiği gibi polarize ve diferansiye solunum epitelinin tipik özelliklerini göstermektedir (Şekil 1). HNE hücreleri, siliyer (pozitif alfa-tübülin boyaması) ve siliye olmayan mukus üreten goblet hücrelerinden (pozitif Muc5Ac immün boyama) oluşan psödo-tabakalaşmış bir solunum epitelinin in vivo durumunu taklit eden heterojen bir epitel hücresi tabakasına (pozitif keratin 8 imm?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine at JoVE.com

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Burada, hava-sıvı arayüzünde primer insan nazal epitel (HNE) hücrelerinin izolasyonu, amplifikasyonu ve farklılaşması ve güçlendirilmiş HNE'nin başarılı bir şekilde dondurulmasına ve daha sonra çözülmesine izin veren bir biyobankacılık protokolü açıklanmaktadır. Protokol, farklılaşmış HNE hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerini ve farklı modülatör tedavileri üzerine CFTR ile ilişkili klorür sekresyon düzeltmesini analiz eder.

Primer İnsan Burun Epitel Hücreleri: Hassas Tıp Bağlamında Biyobankacılık

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Bu protokol, primer nazal epitel hücrelerinin çoğaltılması, farklılaştırılması ve kriyopreservasyonunun temel adımlarını vurgulamaktadır. Kültür koşullarımızda primer nazal epitel hücreleri akciğer epitelini taklit eder. Bu, hasta kaynaklı kültürlere ve taze veya biyobankalı hücrelerden kişiselleştirilmiş tıp çalışmalarına izin verir.Hasta kaynaklı nazal epitel kültürleri, KFTR aktivitesini değerlendirmek ve hastanın yeni tedavilere bireysel yanıtını değerlendirerek kistik fibroz tedavisine yardımcı olmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir mühendis olan Aurelie Hatton olacak. Başlamak için, 10 mililitre amplifikasyon ortamında nazal epitel veya HNE hücrelerini büyütün.75 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişede% 80 ila% 90 akıcılığa ulaşana kadar 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin. Daha sonra, hücreleri 10 mililitre magnezyum ve kalsiyum içermeyen DPBS ile yıkayın.Tuzlu suyu aspire edin ve atın. İki mililitre% 0.25 tripsin eklemeden ve şişeyi sekiz ila 12 dakika boyunca inkübatöre geri döndürmeden önce. Daha sonra, hücrenin ayrılmasına yardımcı olmak için şişeye bir avuç içi ile sıkıca dokunun.Enzimatik reaksiyonu durdurmak için amplifikasyon ortamının 10 mililitresini ekleyin. Hücreleri durulamak ve ayırmak ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplamak için amplifikasyon ortamını şişe yüzeyine çekmek ve dışarı atmak için şişeyi 10 mililitrelik bir pipet kullanarak kuvvetlice durulayın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.Peleti beş ila 10 mililitre amplifikasyon ortamında tekrar askıya alın. Sonra bir hemositometredeki hücreleri sayın. Hücre sayımından sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.Daha sonra, mililitre başına altı hücreye üç ila beş kez 10 elde etmek ve bir kriyo şişesine yerleştirmek için peleti zenginleştirilmiş dondurucu ortamda tekrar askıya alın. Sıcaklığı dakikada yaklaşık bir santigrat derece düşürerek hücreleri eksi 80 santigrat derecede uygun bir kriyodondurucu kapta yavaşça dondurun. Ertesi gün, uzun süreli depolama için korunan numuneyi bir azot depolama kabına taşıyın.Taze hazırlanmış amplifikasyon ortamını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda ısıtın. Kriyotik şişeleri azot depolama tankından çıkarın ve tüm şişeyi suya batırmamaya dikkat ederek hızlı bir şekilde su banyosuna yerleştirin. Sadece küçük bir donmuş damlacık kaldığında kriyo şişelerini su banyosundan çıkarın.Şişeleri% 70 alkol ile silin ve kaputun altına yerleştirin. Bir mililitrelik pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, damla yönünde bir mililitre ılık amplifikasyon ortamı ekleyin.Bir dakika sonra, bir mililitre amplifikasyon ortamı daha ekleyin ve bir dakika bekleyin. 10 mililitre amplifikasyon ortamı ekleyin ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yapın. Süper natantı aspire edin ve atın.Pelet, mililitre başına altı hücreye bir kez 10 hücre yoğunluğu elde etmek için gereken bir amplifikasyon ortamı hacminde yeniden askıya alın. Hücreleri, amplifikasyon ortamı içeren 25 santimetrekarelik kollajen kaplı bir şişeye tohumladıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Daha önce gösterildiği gibi hücre amplifikasyonunu gerçekleştirmeden önce iki ila üç gün boyunca hücre genişlemesini görsel olarak gözlemleyin.Hücreleri filtre başına 3.3 kat 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda, apikal tarafta 300 mikrolitre amplifikasyon ortamı ve bazolateral tarafta 900 mikrolitre hava sıvı ortamı ile desteklenmiş 0.33 santimetrekare kollajen kaplı gözenekli filtrelerde tohumlayın. Üç gün sonra, apikal ortamı aspire edin ve farklılaşmış bir epitel oluşturmak için hava-sıvı ortamındaki hücreleri hava-sıvı ortamında üç ila dört hafta boyunca kültürleyin. Bazal ortamı her 48 ila 72 saatte bir değiştirin.Hava-sıvı arayüzünde kültürlenen taze HNE hücreleri, polarize ve farklılaşmış solunum epitelinin tipik bir özelliğini sergiledi. 78 HNE hücre örneğinde, hemen ve bir ila yedi günlük bir yıkama ortamında taşındıktan sonra tohumlanan burun fırçalamada başarı oranları karşılaştırıldı. Başarılı kültürlerin ilk ortalama yüzdesi% 82 idi ve sıfır ila beş gün arasında tohumlanan örneklerde% 87'ye ulaştı.Taze koşullarda başarılı bir şekilde farklılaşan örneklerin %83'ü kriyokorunmuş örneklerde de başarılı olmuştur. Benzer şekilde, taze koşullarda farklılaşamayan örneklerde,% 71'i donma-çözülme koşullarında da başarısız olmuştur. Dahası, kriyo şişe başına altı hücreye iki ila üç kez 10 arasında dondurulmuş örneklerin% 50'si çözüldüğünde büyüyemedi ve altı hücreye iki kez 10'un altında% 80'e ulaştı.Forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimi ve DMSO ile muamele edilmiş HNE hücrelerinde CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimi için, taze veya dondurulmuş çözülmüş HNE arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Tedavi üzerine, her iki hücre tipi de forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir artış ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişiminde bir azalma ile önemli bir düzeltme göstermiştir. CFTR fonksiyonlu ikili tedavilerin düzeltici yanıtı, DMSO ile tedavi edilen HNE hücrelerinin forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimine kıyasla değerlendirildi ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak hem VX-809 artı VX-770 hem de VX-661 artı VX-770 ile anlamlı derecede iyileşti.HNE'de altı F508del homozigot hastadan üç farklı CFTR modülatör tedavisi karşılaştırıldı. Bir CFTR düzeltici ve güçlendirici, hem köşe hem de CFTR modülatörleri ile birlikte kullanıldığında, forskoline yanıt olarak kısa devre akımı değişimini ve CFTR inhibitörü 172'ye yanıt olarak kısa devre akımı değişimini benzer ölçüde düzeltir. HNE hücrelerini dondururken, çözülme üzerine iyi bir sonuç alma şansını artırmak için kriyo şişe başına en az 3 milyon hücreye sahip olmak önemlidir.HNE hücrelerinde CFTR aktivitesinin, kistik fibrozda kişiselleştirilmiş tedavileri değerlendirmek ve ayarlamak için iyi bir prediktif model olduğu gösterilmiştir.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Trans-epitel iyon taşıma farelerde ölçmek için burun potansiyel fark

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...