Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل مجلس هونغ كونغ للمنح البحثية من خلال المنح 16103215 16148816 16102518 16102920 و T13-607/12R و T13-706/11-1 و T13-605/18W و C6002-17GF و C6001-19E و N_HKUST603/19 ولجنة الابتكار والتكنولوجيا (ITCPD/17-9) ومخطط مجال التميز للجنة المنح الجامعية (AoE / M-604/16 و AOE / M-09/12) وجامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST) من خلال المنحة RPC10EG33.

يتم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية التي يتم تنفيذها في هذا العمل وفقا للمبادئ التوجيهية لمرفق المختبر التابع لجامعة هونغ كونغ للعلوم والتكنولوجيا (HKUST) وقد تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في HKUST. مطلوب تدريب على السلامة للتعامل مع الليزر لإعداد وتشغيل مجهر TPEF-SRS. دائما ارتد...

في هذا البروتوكول ، يتم وصف الإعداد الأساسي لمجهر TPEF-SRS بالتفصيل. بالنسبة لتصوير SRS ، تتداخل المضخة وحزم Stokes زمنيا ومكانيا داخل OPO. ومع ذلك ، يمكن تعطيل هذا التداخل بعد المرور عبر نظام المجهر. لذلك ، فإن كل من التحسين المكاني والزماني للتوطين المشترك للمضخة وعوارض ستوكس ضروري وحاسم لتحقيق ا?...

يظهر مجهر رامان 1,2 كطريقة قوية خالية من الملصقات لتصوير الأنسجة البيولوجية بناء على الترددات المميزة للروابط الكيميائية المختلفة في الجزيئات الحيوية. نظرا لقدرته على التصوير غير الغازية والتكيفية بشكل جيد ، تم استخدام مجهر رامان على نطاق واسع لتصوير المكونات الغنية بالدهون في الأنسجة البيولوجية مثل غمد المايلين 3،4،5 ، الخلايا الشحمية6،7 ، وقطرات الدهون 8،9،10 . إشارة تشتت رامان المحفزة (SRS) المكتسبة ككسب رامان محفز (SRG) أو فقدان رامان محفز (SRL) خالية من الخلفية ، وتظهر تشابها طيفيا مثاليا مع تشتت رامان التلقائي 11,12. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد SRL و SRG خطيا على تركيز التحليل ، مما يسمح بالتحليل الكمي للمكونات الكيميائية الحيوية 9،11،13. تم استخدام المجهر الفلوري المثير ثنائي الفوتون (TPEF) على نطاق واسع للتصوير البيولوجي في الجسم الحي بسبب قدرته المتأصلة على التقسيم البصري ، وعمق الاختراق العميق ، وانخفاض السمية الضوئية 14،15،16. ومع ذلك ، يعتمد أداء تصوير TPEF على خصائص علامات الفلورسنت ، وعدد الألوان القابلة للحل محدود بسبب أطياف التألق عريض النطاق8،17،18،19. يعد تصوير SRS الخالي من الملصقات وتصوير TPEF القائم على التألق طريقتين للتصوير التكميلي ، ويمكن أن يوفر مزيجهما معلومات فيزيائية حيوية وكيميائية حيوية وفيرة للأنسجة. تعتمد هاتان الطريقتان للتصوير على العمليات البصرية غير الخطية (NLO) ، والتي تسمح بالتكامل البسيط في نظام مجهري واحد. يتيح الجمع بين التصوير SRS و TPEF ، ما يسمى بالتصوير ثنائي الوسائط ، التصوير عالي الأبعاد وتوصيف الخلايا والأنسجة ، مما يسهل فهما شاملا للأنظمة البيولوجية المعقدة. وعلى وجه التحديد، يمكن للفحص المجهري للبيكوثانية (ps) SRS تحقيق تصوير الرابطة الكيميائية بدقة طيفية عالية مقارنة بتقنية الفيمتو ثانية (fs) SRS11، مما يسمح بالتمييز بين مكونات كيميائية حيوية متعددة في الأنسجة البيولوجية، خاصة في منطقة بصمات الأصابع المزدحمة20،21. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع نظام مجهر NLO مزدوج الوسائط شائع الاستخدام مع دمج مجهر متماسك مضاد لتشتت ستوكس (CARS)، يظهر SRS أداء متفوقا على CARS من حيث التفسير الطيفي والصورة وكذلك حساسية الكشف11. تم استخدام مجهر SRS-TPEF كأداة قوية لدراسة الأنظمة البيولوجية المختلفة ، مثل Caenorhabditis elegans9,22 ، Xenopus laevis tadpole brain5 ، دماغ الفأر 23,24 ، الحبل الشوكي 25,26 ، العصب المحيطي 27 ، والأنسجة الدهنية7 ، إلخ.
يشكل الحبل الشوكي مع الدماغ الجهاز العصبي المركزي (CNS). يعد تصور الأنشطة الخلوية في الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية أمرا بالغ الأهمية لفهم آليات اضطرابات الجهاز العصبي المركزي28،29،30 ولتطوير العلاجات المقابلة31،32،33. يلعب غمد المايلين ، الذي يلف ويعزل المحاور العصبية للتوصيل المحتمل للعمل عالي السرعة ، دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. يعتقد أن إزالة الميالين هي السمة المميزة في اضطرابات المادة البيضاء، مثل التصلب المتعدد34. بالإضافة إلى ذلك ، بعد إصابة الحبل الشوكي35 ، يمكن لحطام المايلين تعديل تنشيط البلاعم ، مما يساهم في الالتهاب المزمن والإصابة الثانوية36. لذلك ، فإن التصوير في الجسم الحي لغمد المايلين مع الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في نماذج الفئران الحية يساعد بشكل كبير على فهم العمليات الديناميكية في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراءات الإعداد الأساسية لمجهر TPEF-SRS المصنوع في المنزل ويتم تقديم طرق التصوير ثنائية الوسائط في الجسم الحي للحبل الشوكي للفأر.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

يتيح الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) التصوير الخالي من الملصقات للأنسجة البيولوجية في بيئتها الدقيقة الطبيعية استنادا إلى الاهتزاز الجزيئي الجوهري ، وبالتالي توفير أداة مثالية لدراسة العمليات البيولوجية في الجسم الحي بدقة دون الخلايا. من خلال دمج التصوير الفلوري المثير ثنائي الفوتون (TPEF) في مجهر SRS ، يمكن للتصوير المزدوج الوسائط في الجسم الحي للأنسجة الحصول على معلومات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية مهمة من وجهات نظر متعددة مما يساعد على فهم العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها التمثيل الغذائي الخلوي والاستجابة المناعية وإعادة تشكيل الأنسجة ، إلخ. في بروتوكول الفيديو هذا ، يتم تقديم إعداد نظام مجهر TPEF-SRS بالإضافة إلى طريقة التصوير في الجسم الحي للحبل الشوكي الحيواني. يلعب الحبل الشوكي ، كجزء من الجهاز العصبي المركزي ، دورا حاسما في التواصل بين الدماغ والجهاز العصبي المحيطي. غمد المايلين ، الوفير في الدهون الفوسفاتية ، يحيط بالمحور العصبي ويعزله للسماح بالتوصيل المالح لإمكانات العمل. في الجسم الحي التصوير من أغماد المايلين في الحبل الشوكي مهم لدراسة تطور الأمراض العصبية التنكسية وإصابة الحبل الشوكي. يصف البروتوكول أيضا إعداد الحيوانات وطرق التصوير TPEF-SRS في الجسم الحي للحصول على صور بيولوجية عالية الدقة.

في الجسم الحي ، يتم إجراء التصوير ثنائي الوسائط للمحاور الشوكية وكذلك أغماد المايلين باستخدام الفئران المعدلة وراثيا Thy1-YFPH ، والتي تعبر عن EYFP في الخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية (الشكل 3). تنقل هذه الخلايا العصبية القريبة المعلومات الحسية من العصب المحيطي إلى ?...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

يسمح الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) بالتصوير الخالي من الملصقات للجزيئات الحيوية بناء على اهتزازها الجوهري لروابط كيميائية محددة. في هذا البروتوكول ، يتم وصف الإعداد الفعال لمجهر SRS المتكامل والمجهر الفلوري ثنائي الفوتون لتصور الهياكل الخلوية في الحبل الشوكي للفئران الحية.

في الجسم الحي تصوير الأنسجة البيولوجية مع التألق المشترك ثنائي الفوتون والمجهر المجهري المبعثر رامان المحفز

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

في الجسم الحي التصوير للأنسجة البيولوجية مع القرار تحت الخلوي والخصوصية الكيميائية هو أداة قوية لفهم العمليات الديناميكية التي ينطوي عليها التمثيل الغذائي الخلوي، والاستجابة المناعية، وإعادة تشكيل الأنسجة. مع التألق ثنائي الفوتون المشترك وتحفيز المجهر المبعثر رامان ، يمكن الحصول على المعلومات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية الهامة للأنسجة البيولوجية من وجهات نظر متعددة بدقة دون الخلايا. على وجه التحديد ، يمكن استخدام هذا الفحص المجهري ثنائي الوسائط لتصوير الديناميكيات الخلوية والتفاعلات في الحبل الشوكي للفأر لدراسة تطور الأمراض العصبية التنكسية وإصابة الحبل الشوكي.للبدء ، قم بتشغيل ليزر الياقوت التيتانيوم عن طريق تبديل مفتاح المفتاح من وضع الاستعداد إلى وضع التشغيل وانتظر لمدة 30 دقيقة حتى يسخن الليزر. ثم قم بتشغيل OPO بالنقر فوق زر البدء في لوحة تحكم OPO وانتظر لمدة 20 دقيقة حتى يسخن الليزر. بعد تسخين ليزر بيكو ثانية ، تحقق من عمق التعديل لشعاع ستوكس عن طريق خفض قوة شعاع ستوكس إلى حوالي 20 مللي واط ، وفتح مصراع الليزر لشعاع ستوكس ووضع كاشف صور عالي السرعة عند مخرج OPO للكشف عن الشعاع.بعد ذلك ، قم بتوصيل منفذ الإخراج الخاص بكاشف الصور بمنفذ الإدخال الخاص بمنظار الذبذبات باستخدام كابل محوري مع موصل BNC لمراقبة نبضة الليزر. ثم افتح نافذة التحكم في EOM في برنامج التحكم OPO واضبط طاقة EOM وطورها وفقا لمخطط كثافة النبض الموضح على الذبذبات لتحقيق أقصى عمق تعديل عند 20 ميجاهرتز. في برنامج التحكم OPO ، افتح مصراع ليزر المضخة أثناء إيقاف إخراج Stokes.بعد ذلك ، انقر فوق مربع الإشارة المحدد لضبط الطول الموجي لشعاع المضخة على 796 نانومتر ، ثم انقر فوق مربع طاقة OPO المحدد وأدخل 20 لضبط طاقته على الحد الأدنى للمحاذاة البصرية. بعد ذلك ، ضع لوحة المحاذاة P1 خلف مقسم شعاع الاستقطاب عند حوالي 10 سم ووضع اللوحة P2 خلف P1 عند حوالي 30 سم على المسار البصري. بعد فتح مصراع المجهر لشعاع ليزر بيكو ثانية ، اضبط المرآة M1 لتحديد موقع مركز شعاع ليزر بيكو ثانية في الفتحة من خلال P1. استخدم منظار الأشعة تحت الحمراء لمراقبة موضع بقعة الشعاع عند P1 عند ضبط المرآة M1. وبالمثل ، اضبط المرآة M2 لتحديد موقع مركز شعاع ليزر بيكو ثانية في الفتحة العرضية P2. استخدم نطاق الأشعة تحت الحمراء لمراقبة موضع بقعة الشعاع عند P2 عند ضبط المرآة M2. بعد ضبط المرايا حتى يقع مركز شعاع بيكو ثانية في الفتحة من خلال كل من لوحات المحاذاة ، أغلق مصراع شعاع بيكو ثانية في برنامج التحكم المجهري.بعد ذلك ، افتح مصراع المجهر لشعاع ليزر الفيمتو ثانية. اضبط المرآة M3 لتحديد موقع مركز بقعة شعاع ليزر الفيمتو ثانية في الفتحة العرضية P1 ، ثم اضبط المرآة M4 لتحديد موقع مركز بقعة شعاع الليزر الفيمتو ثانية في الفتحة من خلال P2. بعد ضبط المرايا حتى يقع مركز شعاع ليزر الفيمتو ثانية عند الثقوب من خلال لوحين المحاذاة ، أغلق مصراع المجهر لشعاع الفيمتو ثانية. بعد ذلك ، ضع كاميرا في موضع الهدف لتصور موقع نقطتي الشعاع ووضع علامة على موضع شعاع المضخة على شاشة الكاميرا كمرجع.ثم ضع لوحة محاذاة P0 قبل العدسة L3 واضبط المرآة البصرية باستخدام مفتاح سداسي عشري بحيث يمر مركز شعاع ستوكس عبر ثقب لوحة المحاذاة في منفذ إخراج الليزر. استخدم نطاق الأشعة تحت الحمراء لتأكيد موضع بقعة الشعاع عند P0 أثناء الضبط. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة المحاذاة P0 واستخدم المفتاح السداسي لضبط المرآة البصرية الثانية بحيث يتشارك مركز شعاع Stokes في تحديد موقعه مع العلامة المرجعية لشعاع المضخة على الكاميرا.استمر في ضبط المرايا حتى يتداخل شعاع ستوكس بشكل صارم مع شعاع المضخة في كل من P0 وطائرات الكاميرا. افتح برنامج التحكم في مضخم الصوت واضبط الطول الموجي لليزر المضخة على 796 نانومتر وقوة المضخة وشعاع ستوكس على 50 و 70 مللي واط المقابلة ل 15 و 25 مللي واط على العينة على التوالي. ثم استخدم زيت الزيتون لتحسين مرحلة مكبر الصوت المقفل.يتم ختم زيت الزيتون في شريحة مع المناديل الورقية المرفقة في الجزء السفلي لتعزيز تشتت الإشارة مرة أخرى أو الكشف عن EPI-SRS. ضع عينة زيت الزيتون على المسرح واضبط تركيز هدف 25X على العينة. باستخدام برنامج التحكم في المجهر ، قم بتعيين معلمات التصوير كما هو مذكور في مخطوطة النص.ثم باستخدام برنامج التحكم في مضخم الصوت ، اضبط القيمة الثابتة للوقت على 10 ميكروثانية. بعد ذلك ، قم بمسح شعاع الليزر فوق العينة ، وضبط المرحلة بحجم خطوة يبلغ 22.5 درجة حتى تصل شدة إشارة SRS إلى الحد الأقصى. ثم امسح العينة ضوئيا مع إغلاق مصراع الليزر، وضبط قيمة الإزاحة بحجم خطوة واحد مللي فولت حتى يقترب متوسط إشارة SRS من الصفر.بعد ذلك ، افتح مربع حوار مدير التأخير في برنامج التحكم OPO وقم بمسح زيت الزيتون ، وضبط مرحلة التأخير حتى تصل إشارة SRS لزيت الزيتون إلى الحد الأقصى. ثم توقف عن المسح الضوئي وانقر على زر إضافة بيانات في مربع حوار مدير التأخير لتسجيل بيانات التأخير الحالية. بعد الحصول على بيانات تأخير مماثلة في نوبات رامان المختلفة عن طريق تصوير عينات كيميائية مختلفة ، حدد البيانات المناسبة بالترتيب خمسة في مربع حوار مدير التأخير لتناسب نقاط البيانات الحالية مع الدالة متعددة الأسماء من الدرجة الخامسة.ثم قم بتطبيق البيانات المجهزة بالنقر فوق الزر "استخدام كمخصص" وتحديد خانة الاختيار. يتم ضبط مرحلة التأخير تلقائيا بأطوال موجية مختلفة وفقا لمنحنى التأخير المجهز. للتصوير في الجسم الحي ، قم بإصلاح الماوس في مرحلة التثبيت مع تعرض الحبل الشوكي وغمره في محلول ملحي.الآن قم بتركيب مرحلة التثبيت على مرحلة من خمسة محاور تحت مجهر TPEF-SRS. ثم قم بتأمين رأس الماوس بقضيبي رأس وخفض لوحة الإمساك لتوفير مساحة كافية لحركة الصدر أثناء التنفس ، مما يخفف من التحف الحركية. بعد ذلك ، اضبط المرحلة الانتقالية Z لضبط التركيز حتى يمكن ملاحظة صورة Brightfield للأوعية الدموية في الحبل الشوكي تحت هدف 10X.حدد موقع الوريد الظهري للحبل الشوكي في مركز مجال الرؤية عن طريق ضبط المرحلة الانتقالية ذات المحورين للمرحلة ذات المحاور الخمسة. بعد ذلك ، اضبط زوايا اللفة والملعب لمرحلة المحاور الخمسة لضبط السطح الظهري للحبل الشوكي عموديا على المحور الموضوعي استنادا إلى صورة Brightfield. ثم استبدل 10X بهدف غمر الماء 25X لتصوير TPEF-SRS.بالنسبة لتصوير SRS، حدد فاصل شعاع الاستقطاب فوق الهدف عن طريق الضغط على زر التبديل المتصل بالزعانف المزودة بمحرك. لتصوير TPEF ، حدد المرآة ثنائية اللون D2 فوق الهدف عن طريق الضغط على زر التبديل المتصل بالزعانف الآلية. وأخيرا، اضبط معلمات التصوير كما هو موضح في مخطوطة النص وابدأ في مسح العينة.في الجسم الحي ، كشف التصوير ثنائي الوسائط لمحاور YFP ذات العلامات المتناثرة وأغماد المايلين في الحبل الشوكي للفأر أن المحاور ملفوفة عن كثب بواسطة طبقة سميكة من أغماد المايلين. كما يتضح من صورة الحبل الشوكي TPEF-SRS ، انخفضت عقد رانفييه من القطر المحوري ويتعرض المحور مباشرة للمصفوفة خارج الخلية. جنبا إلى جنب مع تحقيقات جديدة للتألق والتصوير SRS اثنين من الفوتون الإثارة التألق المجهري SRS يمكن أن يحقق التصوير الهيكلي والوظيفي في وقت واحد من مختلف الجزيئات الحيوية، مما يسهل فهمنا للعمليات البيولوجية المعقدة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

خلفية رفض الإسفار في الرنين وMicrospectroscopy رامان العفوي

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

الصغيرة وعلى نطاق واسع زاوية التشتت الدراسات راي X-الجزيئات البيولوجية في الحل

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

طويلة الأجل حيوي داخلي المناعي التصوير من الأنسجة مكونات مصفوفة مع Epifluorescence والميكروسكوب ثنائي الفوتون

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...