Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

本署透过拨款16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19、创新及科技署（ITCPD/17-9）、大学教育资助委员会卓越领域计划（AoE/M-604/16， AOE/M-09/12）及香港科技大学（科大）资助RPC10EG33，支持这项工作。

本工作所进行的所有动物程序均按照香港科技大学（科大）实验动物设施的指引进行，并已获科大动物伦理委员会批准。设置和操作TPEF-SRS显微镜需要激光处理的安全培训。处理激光时，始终佩戴波长范围合适的激光安全护目镜。
1. TPEF-SRS显微镜的设置（设置原理图见 图1）
<ol><li>使用与锁模镱光纤激光器连接的集成光学参数?...

在该协议中，详细描述了TPEF-SRS显微镜的基本设置。对于SRS成像，泵浦和斯托克斯光束在OPO内部在时间和空间上重叠。然而，这种重叠在通过显微镜系统后可能会被破坏。因此，泵和斯托克斯光束共定位的空间和时间优化对于实现最佳SRS成像是必要的，也是至关重要的。泵浦和斯托克斯光束之间的时间延迟与两束光束的光路差有关，这取决于光学元件在显微镜系统中的色散38。当...

拉曼显微镜1，2正在成为一种强大的无标记方法，可以根据生物分子中各种化学键的特征频率对生物组织进行成像。由于其非侵入性和适应性强的成像能力，拉曼显微镜已被广泛用于成像生物组织中富含脂质的成分，如髓鞘3，4，5，脂肪细胞6，7和脂滴8，9，10.受激拉曼散射（SRS）信号作为受激拉曼增益（SRG）或受激拉曼损耗（SRL）获得的受激拉曼散射（SRS）信号是无背景的，显示出与自发拉曼散射的完美光谱相似性11，12。此外，SRL和SRG线性依赖于分析物浓度，允许对生化组分进行定量分析9，11，13。双光子激发荧光显微镜（TPEF）由于其固有的光学切片能力，深度渗透深度和低光毒性，已被广泛用于体内生物成像14，15，16。然而，TPEF成像的性能取决于荧光标签的特性，并且由于宽带荧光光谱8，17，18，19，可分辨颜色的数量受到限制。无标记SRS成像和基于荧光的TPEF成像是两种互补的成像方式，它们的组合可以提供丰富的组织生物物理和生化信息。这两种成像模式都基于非线性光学（NLO）过程，允许简单地集成到一个显微镜系统中。SRS和TPEF成像的结合，即所谓的双模态成像，可以对细胞和组织进行高维成像和分析，从而促进对复杂生物系统的全面理解。具体而言，与飞秒（fs）SRS技术相比，皮秒（ps）SRS显微镜可以实现具有高光谱分辨率的化学键成像11，从而可以区分生物组织中的多种生化成分，特别是在拥挤的指纹区域20，21。此外，与另一种集成了相干反斯托克斯散射（CARS）显微镜的常用双模态NLO显微镜系统相比，SRS在光谱和图像解释以及检测灵敏度方面表现出优于CARS的性能11。SRS-TPEF显微镜已被用作研究各种生物系统的有力工具，例如秀丽隐杆线虫9，22，非洲爪蟾蝌蚪脑5，小鼠脑23，24，脊髓25，26，周围神经27和脂肪组织7等。
脊髓与大脑一起构成了中枢神经系统（CNS）。在生理和病理条件下，可视化CNS体内的细胞活动对于理解CNS疾病的机制28，29，30和开发相应的疗法至关重要31，32，33。髓鞘包裹和绝缘轴突以实现高速动作电位传导，在CNS的发展中起着重要作用。脱髓鞘被认为是白质疾病的标志，如多发性硬化症34。此外，脊髓损伤后35，髓鞘碎片可以调节巨噬细胞活化，导致慢性炎症和继发性损伤36。因此，活体小鼠模型中髓鞘与神经元和神经胶质细胞的体内成像对了解CNS疾病的动态过程有很大帮助。
在该协议中，描述了自制TPEF-SRS显微镜的基本设置程序，并介绍了小鼠脊髓的双模态 体内 成像方法。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

受激拉曼散射（SRS）显微镜能够基于内在分子振动对自然微环境中的生物组织进行无标记成像，从而为亚细胞分辨率下生物过程的 体内 研究提供了完美的工具。通过将双光子激发荧光（TPEF）成像集成到SRS显微镜中，组织的双模态 体内 成像可以从多个角度获取关键的生化和生物物理信息，这有助于了解细胞代谢，免疫反应和组织重塑等所涉及的动态过程。在该视频协议中，介绍了TPEF-SRS显微镜系统的设置以及动物脊髓的 体内 成像方法。脊髓作为中枢神经系统的一部分，在大脑和周围神经系统之间的通信中起着至关重要的作用。髓鞘富含磷脂，包围并隔离轴突，以允许作用电位的盐传导。脊髓髓中髓鞘的 体内 成像对于研究神经退行性疾病和脊髓损伤的进展非常重要。该协议还描述了动物制备和 体内 TPEF-SRS成像方法，以获取高分辨率的生物图像。

使用Thy1-YFPH转基因小鼠进行脊髓轴突和髓鞘的体内双模态成像，其在背根神经节传入神经元中表达EYFP（图3）。这些标记的传入神经元将感觉信息从周围神经传递到脊髓，中央分支位于脊髓背柱中。使用TPEF-SRS显微镜，可以使用无标记SRS成像清晰地观察密集分布的髓鞘，并且可以使用TPEF成像观察稀疏标记的YFP轴突。通过双模型成像显示，轴突被一层厚厚的髓鞘紧密包?...

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In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

受激拉曼散射（SRS）显微镜允许根据特定化学键的固有振动对生物分子进行无标记成像。在该协议中，描述了集成SRS和双光子荧光显微镜的仪器设置，以可视化活小鼠脊髓中的细胞结构。

体内 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

具有亚细胞分辨率和化学特异性的生物组织的体内成像是了解细胞代谢，免疫反应和组织重塑中涉及的动态过程的有力工具。结合双光子荧光和受激拉曼散射显微镜，可以从多个角度以亚细胞分辨率获取生物组织的关键生化和生物物理信息。具体而言，这种双模态显微镜可用于成像小鼠脊髓中的细胞动力学和相互作用，以研究神经退行性疾病和脊髓损伤的进展。首先，将钥匙开关从待机位置切换到打开位置，然后等待 30 分钟让激光器预热，从而打开钛蓝宝石激光器。然后通过单击 OPO 控制面板上的开始按钮打开 OPO，并等待 20 分钟让激光预热。皮秒激光预热后，通过将斯托克斯光束的功率降低到约20毫瓦，打开斯托克斯光束的激光快门并在OPO输出端放置高速光电探测器来检测光束，从而检查斯托克斯光束的调制深度。接下来，使用带有BNC连接器的同轴电缆将光电探测器的输出端口连接到示波器的输入端口，以监视激光脉冲。然后打开OPO控制软件中的EOM控制窗口，根据示波器上显示的脉冲强度图调整EOM功率和相位，以达到20兆赫兹的最大调制深度。在 OPO 控制软件中，打开泵浦激光快门，同时停止 Stokes 输出。接下来，单击设置信号框以将泵浦光束的波长设置为796纳米，然后单击设置的OPO电源盒并输入20以将其功率设置为最小值以进行光学对准。接下来，将对准板P1放在偏振分束器后面约10厘米处，并将板P2放在P1后面的光路上约30厘米处。打开皮秒激光束的显微镜快门后，调整反射镜M1，将皮秒激光束中心定位在P1的通孔处。使用红外示波器观察在调整反射镜M1时P1处的光束点的位置。同样，调整反射镜M2以将皮秒激光束中心定位在P2的通孔处。使用红外示波器观察光束点在调整反射镜M2时在P2的位置。调整反射镜直到皮秒光束中心位于两个对准板的通孔处后，在显微镜控制软件中关闭皮秒光束的快门。接下来，打开飞秒激光束的显微镜快门。调整反射镜M3，将飞秒激光束光斑中心定位在P1的通孔处，然后调整反射镜M4，将飞秒激光束光斑中心定位在P2的通孔处。调整反射镜后，直到飞秒激光束中心位于两个对准板的通孔处，关闭飞秒光束的显微镜快门。接下来，将相机放置在物镜的位置以可视化两个光束点的位置，并在相机屏幕上标记泵浦光束的位置作为参考。然后将对准板P0放在透镜L3之前，并使用六角键调整光学反射镜，以便斯托克斯光束中心通过激光输出端口处对准板的通孔。在调整过程中，使用红外示波器确认光束点在P0的位置。接下来，取下对齐板P0并使用十六进制键调整光学反射镜二，以便斯托克斯光束的中心与相机上泵浦光束的参考标记共同定位。继续调整反射镜，直到斯托克斯光束在P0和相机平面上与泵浦光束严格重叠。打开锁相放大器控制软件，将泵浦激光器的波长设置为796纳米，将泵浦和斯托克斯光束的功率设置为50和70毫瓦，分别对应于样品上的15和25毫瓦。然后使用橄榄油进行锁相放大器相位优化。将橄榄油密封在载玻片中，底部附有薄纸，以增强信号回散射或EPI-SRS检测。将橄榄油样品放在载物台上，并将25X物镜的焦点调整到样品上。使用显微镜控制软件，设置文本手稿中提到的成像参数。然后使用锁相放大器控制软件，将时间常数值设置为10微秒。接下来，扫描样品上的激光束，以22.5度的步长调整相位，直到SRS信号强度达到最大值。然后在关闭激光快门的情况下扫描样品，以1毫伏的步长调整偏移值，直到平均SRS信号接近零。接下来，在OPO控制软件中打开延迟管理器对话框并扫描橄榄油，调整延迟阶段，直到橄榄油SRS信号达到最大值。然后停止扫描并单击延迟管理器对话框中的添加数据按钮以记录当前的延迟数据。通过对各种化学样品进行成像来获取不同拉曼位移的延迟数据后，在延迟管理器对话框中按第五顺序选择数据拟合，以拟合具有五阶多项函数的当前数据点。然后，通过单击“用作自定义”按钮并选中复选框来应用适合的数据。延迟级根据拟合的延迟曲线在不同波长下自动调整。对于体内成像，将小鼠固定在稳定阶段，其脊髓暴露并浸入盐水中。现在，将稳定级安装在TPEF-SRS显微镜下方的五轴载物台上。然后用两个头杆固定鼠标头，并降低固定板，以便在呼吸过程中为胸部运动提供足够的空间，从而减轻运动伪影。接下来，调整Z平移阶段以调整焦点，直到可以在10X物镜下观察到脊髓脉管系统的明场图像。通过调整五轴阶段的两轴平移阶段，将脊髓背静脉定位在视野的中心。接下来，调整五轴载物台的滚动和俯仰角度，以根据明场图像调整垂直于物镜轴的脊髓背表面。然后用25X水浸物镜替换10X，用于TPEF-SRS成像。对于SRS成像，通过按下连接到电动脚蹼的开关按钮，选择物镜上方的偏振分束器。对于TPEF成像，通过按下连接到电动脚蹼的开关按钮，选择物镜上方的二向色镜D2。最后，按照文本手稿中所述设置成像参数，并开始扫描样品。小鼠脊髓中稀疏标记的YFP轴突和髓鞘的体内双模态成像显示，轴突被一层厚厚的髓鞘紧密包裹。从TPEF-SRS脊髓图像中可以看出，Ranvier的节点轴突直径减小，腋窝直接暴露于细胞外基质。结合新的荧光探针和SRS成像双光子激发荧光SRS显微镜可以实现各种生物分子的同步结构和功能成像，便于我们理解复杂的生物过程。

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Bioengineering

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