Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Hong Kong Research Grants Council door middel van subsidies 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, de Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), het Area of Excellence Scheme van de University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) en de Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) door middel van subsidie RPC10EG33.

Alle dierprocedures die in dit werk worden uitgevoerd, worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Laboratory Animal Facility van de Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) en zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van HKUST. Veiligheidstraining voor laserbehandeling is vereist om de TPEF-SRS-microscoop in te stellen en te bedienen. Draag altijd een laserveiligheidsbril met het juiste golflengtebereik bij het omgaan met laser.
1. Opstelling van de TPEF-SRS mi...

In dit protocol wordt de basisopstelling van de TPEF-SRS microscoop in detail beschreven. Voor SRS-beeldvorming zijn de pomp- en Stokes-stralen tijdelijk en ruimtelijk overlapt in de OPO. Deze overlapping kan echter worden verstoord na het passeren van het microscoopsysteem. Daarom is zowel ruimtelijke als temporele optimalisatie van de colocalisatie van de pomp en Stokes-balken noodzakelijk en cruciaal voor het bereiken van optimale SRS-beeldvorming. De temporele vertraging tussen de pomp en de Stokes-bundel is gerelat...

Raman microscopie1,2 is in opkomst als een krachtige labelvrije methode om biologische weefsels in beeld te brengen op basis van de karakteristieke frequenties van verschillende chemische bindingen in biomoleculen. Vanwege het niet-invasieve en goed adaptieve beeldvormingsvermogen is Raman-microscopie op grote schaal gebruikt voor het afbeelden van lipide-verrijkte componenten in biologische weefsels zoals myelineschede3,4,5, adipocyten6,7 en lipidedruppels8,9,10 . Gestimuleerd Raman-verstrooiingssignaal (SRS) verkregen als gestimuleerde Raman-versterking (SRG) of gestimuleerd Raman-verlies (SRL) is achtergrondvrij en vertoont perfecte spectrale gelijkenis met spontane Raman-verstrooiing11,12. Bovendien zijn SRL en SRG lineair afhankelijk van de analytconcentratie, waardoor kwantitatieve analyse van biochemische componenten mogelijk is9,11,13. Twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (TPEF) is veel gebruikt voor in vivo biologische beeldvorming vanwege het inherente optische sectioningvermogen, de diepe penetratiediepte en de lage fototoxiciteit14,15,16. De prestaties van TPEF-beeldvorming zijn echter afhankelijk van de kenmerken van fluorescerende tags en het aantal oplosbare kleuren is beperkt vanwege de breedbandfluorescentiespectraspray8,17,18,19. Labelvrije SRS-beeldvorming en op fluorescentie gebaseerde TPEF-beeldvorming zijn twee complementaire beeldvormingsmodaliteiten en hun combinatie kan overvloedige biofysische en biochemische informatie van weefsels bieden. Deze twee beeldvormingsmodaliteiten zijn beide gebaseerd op de niet-lineaire optische (NLO) processen, die eenvoudige integratie in één microscoopsysteem mogelijk maken. De combinatie van de SRS- en TPEF-beeldvorming, de zogenaamde dual-modale beeldvorming, maakt hoogdimensionale beeldvorming en profilering van cellen en weefsels mogelijk, waardoor een uitgebreid begrip van complexe biologische systemen wordt vergemakkelijkt. In het bijzonder kan picoseconde (ps) SRS-microscopie chemische bindingsbeeldvorming bereiken met een hoge spectrale resolutie in vergelijking met femtoseconde (fs) SRS-techniek11, waardoor meerdere biochemische componenten in biologisch weefsel kunnen worden onderscheiden, vooral in het overvolle vingerafdrukgebied20,21. Bovendien, in vergelijking met een ander veelgebruikt dual-modaal NLO-microscoopsysteem met integratie van coherente anti-Stokes-verstrooiingsmicroscoop (CARS), vertoont SRS superieure prestaties ten opzichte van CARS in termen van spectrale en beeldinterpretatie en detectiegevoeligheid11. De SRS-TPEF microscoop is gebruikt als een krachtig hulpmiddel om verschillende biologische systemen te bestuderen, zoals Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kikkervis hersenen5, muizenbrein23,24, ruggenmerg25,26, perifere zenuw27 en vetweefsel7, enz.
Het ruggenmerg vormt samen met de hersenen het centrale zenuwstelsel (CZS). Het visualiseren van cellulaire activiteiten in het CZS in vivo onder fysiologische en pathologische omstandigheden is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van CZS-aandoeningen28,29,30 en voor het ontwikkelen van overeenkomstige therapieën31,32,33. Myelineschede, die axonen omwikkelt en isoleert voor snelle actiepotentiaalgeleiding, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van het CZS. Demyelinisatie wordt gezien als een kenmerk bij wittestofstoornissen, zoals multiple sclerose34. Bovendien kan myeline-puin na ruggenmergletsel35 de activering van macrofagen moduleren, wat bijdraagt aan chronische ontsteking en secundair letsel36. Daarom is in vivo beeldvorming van myelineschede samen met neuronen en gliacellen in levende muismodellen van grote hulp om de dynamische processen bij CZS-aandoeningen te begrijpen.
In dit protocol worden de fundamentele installatieprocedures van een zelfgebouwde TPEF-SRS-microscoop beschreven en worden de dual-modale in vivo beeldvormingsmethoden voor het ruggenmerg van muizen geïntroduceerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) maakt labelvrije beeldvorming van de biologische weefsels in zijn natuurlijke micro-omgeving mogelijk op basis van intrinsieke moleculaire trillingen, waardoor een perfect hulpmiddel wordt geboden voor in vivo studie van biologische processen met subcellulaire resolutie. Door twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) beeldvorming in de SRS-microscoop te integreren, kan de dual-modale in vivo beeldvorming van weefsels kritische biochemische en biofysische informatie vanuit meerdere perspectieven verkrijgen die helpt bij het begrijpen van de dynamische processen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering, enz. In dit videoprotocol wordt de opstelling van een TPEF-SRS microscoopsysteem en de in vivo beeldvormingsmethode van het dierlijke ruggenmerg geïntroduceerd. Het ruggenmerg, als onderdeel van het centrale zenuwstelsel, speelt een cruciale rol in de communicatie tussen de hersenen en het perifere zenuwstelsel. Myelineschede, overvloedig aanwezig in fosfolipiden, omringt en isoleert het axon om zoute geleiding van actiepotentialen mogelijk te maken. In vivo beeldvorming van myelinescheden in het ruggenmerg is belangrijk om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen. Het protocol beschrijft ook dierbereiding en in vivo TPEF-SRS-beeldvormingsmethoden om biologische beelden met hoge resolutie te verkrijgen.

In vivo dual-modale beeldvorming van spinale axonen en myelinescheden wordt uitgevoerd met behulp van de Thy1-YFPH transgene muizen, die EYFP tot expressie brengen in dorsale wortel ganglion afferente neuronen (figuur 3). Deze gelabelde afferente neuronen geven de sensorische informatie van de perifere zenuw door aan het ruggenmerg, met de centrale tak in de dorsale kolom van het ruggenmerg. Met de TPEF-SRS-microscoop kan een dicht verdeelde myelineschede duidelijk worden gevisualis...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) microscopie maakt labelvrije beeldvorming van biomoleculen mogelijk op basis van hun intrinsieke vibratie van specifieke chemische bindingen. In dit protocol wordt de instrumentele opstelling van een geïntegreerde SRS- en twee-fotonenfluorescentiemicroscoop beschreven om cellulaire structuren in het ruggenmerg van levende muizen te visualiseren.

In vivo Beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

In Vivo beeldvorming van biologische weefsels met subcellulaire resolutie en chemische specificiteit is een krachtig hulpmiddel om de dynamische processen te begrijpen die betrokken zijn bij cellulair metabolisme, immuunrespons en weefselremodellering. Met gecombineerde twee-fotonenfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie kan kritische biochemische en biofysische informatie van biologische weefsels vanuit meerdere perspectieven met subcellulaire resolutie worden verkregen. In het bijzonder kan deze dual-modale microscopie worden gebruikt om cellulaire dynamiek en interacties in het ruggenmerg van muizen in beeld te brengen om de progressie van neurodegeneratieve ziekten en dwarslaesie te bestuderen.Schakel om te beginnen de titanium saffierlaser in door de toetsschakelaar van de stand-by naar de aan-positie te schakelen en wacht 30 minuten totdat de laser is opgewarmd. Schakel vervolgens de OPO in door op de startknop op het OPO-bedieningspaneel te klikken en wacht 20 minuten tot de laser is opgewarmd. Nadat de picosecondelaser is opgewarmd, controleert u de modulatiediepte van de Stokes-straal door het vermogen van de Stokes-straal te verlagen tot ongeveer 20 milliwatt, de lasersluiter voor de Stokes-straal te openen en een snelle fotodetector op de OPO-uitgang te plaatsen om de straal te detecteren.Sluit vervolgens de uitvoerpoort van de fotodetector aan op de ingangspoort van een oscilloscoop met behulp van een coaxiale kabel met een BNC-connector om de laserpuls te bewaken. Open vervolgens het EOM-besturingsvenster in de OPO-besturingssoftware en pas het EOM-vermogen en de fase aan volgens het pulsintensiteitsdiagram dat op de oscilloscoop wordt weergegeven om een maximale modulatiediepte van 20 megahertz te bereiken. Open in de OPO-besturingssoftware de lasersluiter van de pomp terwijl u de Stokes-uitgang stopt.Klik vervolgens op het instelsignaalhuis om de golflengte van de pompbundel in te stellen op 796 nanometer, klik vervolgens op de OPO-voedingsbox instellen en voer 20 in om het vermogen in te stellen op het minimum voor optische uitlijning. Plaats vervolgens uitlijnplaat P1 achter de polariserende bundelsplitser op ongeveer 10 centimeter en plaats plaat P2 achter P1 op ongeveer 30 centimeter op het optische pad. Na het openen van de microscoopsluiter voor de picoseconde laserstraal, past u de spiegel M1 aan om het picoseconde laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P1 te lokaliseren. Gebruik een infraroodkijker om de positie van de bundelvlek op P1 te observeren bij het afstellen van de spiegel M1. Pas op dezelfde manier de spiegel M2 aan om het picoseconde laserstraalcentrum in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren. Gebruik de infraroodkijker om de positie van de bundelspot op P2 te observeren bij het afstellen van de spiegel M2. Na het afstellen van de spiegels totdat het picoseconde bundelcentrum zich in het doorgaande gat van beide uitlijningsplaten bevindt, sluit u de sluiter van de picosecondebundel in de microscoopbesturingssoftware.Open vervolgens de microscoopsluiter voor de femtoseconde laserstraal. Pas de spiegel M3 aan om het femtoseconde laserstraalspotcentrum in het doorgaande gat van P1 te lokaliseren en pas vervolgens spiegel M4 aan om het femtoseconde laserstraalspotcentrum in het doorgaande gat van P2 te lokaliseren. Nadat u de spiegels hebt afgesteld totdat het femtoseconde laserstraalcentrum zich in de doorgaande gaten van de twee uitlijningsplaten bevindt, sluit u de microscoopsluiter voor de femtosecondestraal. Plaats vervolgens een camera op de positie van het objectief om de locatie van de twee bundelspots te visualiseren en markeer de positie van de pompstraal op het camerascherm als referentie.Plaats vervolgens een uitlijningsplaat P0 voor de lens L3 en pas de optische spiegel aan met een inbussleutel, zodat het Stokes-straalcentrum het doorgaande gat van de uitlijningsplaat bij de laseruitgangspoort passeert. Gebruik de infraroodkijker om de positie van de bundelvlek op P0 te bevestigen tijdens de aanpassing. Verwijder vervolgens de uitlijningsplaat P0 en gebruik de inbussleutel om de optische spiegel twee aan te passen, zodat het midden van de Stokes-bundel co-lokaliseert met het referentiemerk van de pompstraal op de camera.Blijf de spiegels afstellen totdat de Stokes-straal strikt overlapt met de pompstraal op zowel P0- als de cameravlakken. Open de lock-in versterkerbesturingssoftware en stel de golflengte van de pomplaser in op 796 nanometer en het vermogen van de pomp en Stokes-straal op 50 en 70 milliwatt, wat overeenkomt met respectievelijk 15 en 25 milliwatt op het monster. Gebruik dan olijfolie voor lock-in versterker fase optimalisatie.De olijfolie is verzegeld in een dia met tissuepapier aan de onderkant om de signaalverstrooiing of EPI-SRS-detectie te verbeteren. Plaats het olijfoliemonster op het podium en pas de focus van het 25X-objectief aan op het monster. Stel met behulp van de microscoopbesturingssoftware de beeldvormingsparameters in zoals vermeld in het tekstmanuscript.Stel vervolgens met behulp van de lock-in versterkerbesturingssoftware de tijdconstante waarde in op 10 microseconden. Scan vervolgens de laserstraal over het monster en stem de fase af met een stapgrootte van 22,5 graden totdat de SRS-signaalintensiteit het maximum bereikt. Scan vervolgens het monster met de lasersluiter gesloten en stem de offsetwaarde af met een stapgrootte van één millivolt totdat het gemiddelde SRS-signaal dicht bij nul is.Open vervolgens het dialoogvenster vertragingsmanager in de OPO-besturingssoftware en scan de olijfolie, waarbij u de vertragingsfase afstemt totdat het SRS-signaal van de olijfolie zijn maximum bereikt. Stop vervolgens met scannen en klik op de knop Gegevens toevoegen in het dialoogvenster vertragingsbeheer om de huidige vertragingsgegevens vast te leggen. Na het op dezelfde manier verkrijgen van vertragingsgegevens bij verschillende Raman-verschuivingen door verschillende chemische monsters in beeld te brengen, selecteert u de gegevens in volgorde vijf in het dialoogvenster vertragingsmanager om de huidige gegevenspunten te passen met de polynomische functie van de vijfde orde.Pas vervolgens de aangepaste gegevens toe door op de knop Gebruiken als aangepast te klikken en het selectievakje aan te vinken. De vertragingsfase wordt automatisch aangepast op verschillende golflengten volgens de aangepaste vertragingscurve. Voor in vivo beeldvorming fixeert u de muis op het stabilisatiestadium met het ruggenmerg blootgelegd en ondergedompeld in zoutoplossing.Monteer nu de stabilisatietrap op een vijfassige trap onder de TPEF-SRS-microscoop. Bevestig vervolgens de muiskop met twee hoofdstangen en laat de houderplaat zakken om voldoende ruimte te bieden voor borstbewegingen tijdens de ademhaling, waardoor bewegingsartefacten worden verlicht. Pas vervolgens de Z-translationele fase aan om de focus af te stemmen totdat het Brightfield-beeld van de vasculatuur van het ruggenmerg kan worden waargenomen onder een 10X-objectief.Lokaliseer de ruggenmergader in het midden van het gezichtsveld door de tweeassige translationele fase van de vijfassige fase af te stemmen. Stem vervolgens de rol- en pitchhoeken van de vijfassige trap af om het ruggenmerg dorsale oppervlak loodrecht op de objectieve as aan te passen op basis van de Brightfield-afbeelding. Vervang vervolgens de 10X door een 25X waterdompelingsobjectief voor TPEF-SRS-beeldvorming.Voor SRS-beeldvorming selecteert u de polariserende bundelsplitser boven het objectief door op de schakelknop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper. Voor TPEF-beeldvorming selecteert u de dichroïsche spiegel D2 boven het objectief door op de schakelknop te drukken die is aangesloten op de gemotoriseerde flipper. Stel ten slotte de beeldvormingsparameters in zoals beschreven in het tekstmanuscript en begin met het scannen van het monster.In vivo dual-modale beeldvorming van schaars gelabelde YFP-axonen en myelineschechten in het ruggenmerg van de muis onthulde dat de axonen nauw omwikkeld zijn door een dikke laag myelinescheden. Zoals te zien is in de TPEF-SRS-ruggenmergafbeelding, hebben de knopen van Ranvier een verminderde axonale diameter en wordt het axilemma direct blootgesteld aan de extracellulaire matrix. In combinatie met nieuwe sondes voor fluorescentie en SRS-beeldvorming van twee-foton geëxciteerde fluorescentie kan SRS-microscopie gelijktijdige structurele en functionele beeldvorming van verschillende biomoleculen bereiken, waardoor ons begrip van complexe biologische processen wordt vergemakkelijkt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Kleine en Wide Angle X-ray scattering Studies van biologische macromoleculen in oplossing

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Het maken van lijm en Oplosbare verlopen for Imaging Cell Migration met fluorescentie microscopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Beeldvorming van biologische weefsels door desorptie electrospray ionisatie massaspectrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...