Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Hong Kong Research Grants Council par le biais de subventions 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Commission de l’innovation et de la technologie (ITCPD/17-9), le programme de domaine d’excellence du Comité des subventions universitaires (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) et l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) par le biais de la subvention RPC10EG33.

Toutes les procédures animales effectuées dans ce travail sont menées conformément aux directives du Laboratory Animal Facility de l’Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST) et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de HKUST. Une formation à la sécurité pour la manipulation laser est nécessaire pour configurer et utiliser le microscope TPEF-SRS. Portez toujours des lunettes de sécurité laser avec une plage de longueurs d’onde appropriée lorsque vous traitez avec un l...

Dans ce protocole, la configuration de base du microscope TPEF-SRS est décrite en détail. Pour l’imagerie SRS, la pompe et les faisceaux stokes se chevauchent temporellement et spatialement à l’intérieur de l’OPO. Cependant, ce chevauchement peut être perturbé après le passage dans le système de microscope. Par conséquent, l’optimisation spatiale et temporelle de la colocalisation de la pompe et des faisceaux de Stokes est nécessaire et essentielle pour obtenir une imagerie SRS optimale. Le délai temp...

La microscopie Raman1,2 est en train de devenir une puissante méthode sans étiquette pour imager les tissus biologiques en fonction des fréquences caractéristiques de diverses liaisons chimiques dans les biomolécules. En raison de sa capacité d’imagerie non invasive et bien adaptative, la microscopie Raman a été largement utilisée pour l’imagerie de composants enrichis en lipides dans des tissus biologiques tels que la gaine de myéline3,4,5, les adipocytes6,7 et les gouttelettes lipidiques8,9,10 . Le signal de diffusion Raman stimulée (SRS) acquis sous forme de gain Raman stimulé (SRG) ou de perte Raman stimulée (SRL) est sans arrière-plan, montrant une ressemblance spectrale parfaite avec la diffusion Raman spontanée11,12. De plus, le SRL et le SSR dépendent linéairement de la concentration de l’analyte, ce qui permet une analyse quantitative des composants biochimiques9,11,13. La microscopie à fluorescence excitée à deux photons (TPEF) a été largement utilisée pour l’imagerie biologique in vivo en raison de sa capacité de sectionnement optique inhérente, de sa profondeur de pénétration profonde et de sa faible phototoxicité14,15,16. Cependant, les performances de l’imagerie TPEF dépendent des caractéristiques des étiquettes fluorescentes, et le nombre de couleurs résolvables est limité en raison des spectres de fluorescence à large bande8,17,18,19. L’imagerie SRS sans étiquette et l’imagerie TPEF basée sur la fluorescence sont deux modalités d’imagerie complémentaires, et leur combinaison peut fournir des informations biophysiques et biochimiques abondantes sur les tissus. Ces deux modalités d’imagerie sont toutes deux basées sur les processus optiques non linéaires (NLO), ce qui permet une intégration simple dans un système de microscope. La combinaison de l’imagerie SRS et TPEF, appelée imagerie dual-modale, permet l’imagerie et le profilage de haute dimension des cellules et des tissus, facilitant ainsi une compréhension complète des systèmes biologiques complexes. Plus précisément, la microscopie SRS picoseconde (ps) permet d’obtenir une imagerie de liaison chimique avec une résolution spectrale élevée par rapport à la technique SRS femtoseconde (fs)11, permettant de différencier plusieurs composants biochimiques dans les tissus biologiques, en particulier dans la région d’empreintes digitales encombrée20,21. En outre, par rapport à un autre système de microscope NLO bimodal couramment utilisé avec intégration d’un microscope à diffusion anti-Stokes cohérente (CARS), SRS montre des performances supérieures à CARS en termes d’interprétation spectrale et d’image ainsi que de sensibilité de détection11. Le microscope SRS-TPEF a été utilisé comme un outil puissant pour étudier divers systèmes biologiques, tels que Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerveau de souris23,24, moelle épinière25,26, nerf périphérique27 et tissu adipeux7, etc.
La moelle épinière et le cerveau constituent le système nerveux central (SNC). La visualisation des activités cellulaires dans le SNC in vivo dans des conditions physiologiques et pathologiques est essentielle pour comprendre les mécanismes des troubles du SNC28,29,30 et pour développer des thérapies correspondantes31,32,33. La gaine de myéline, qui enveloppe et isole les axones pour une conduction potentielle d’action à grande vitesse, joue un rôle important dans le développement du SNC. La démyélinisation est considérée comme une caractéristique dans les troubles de la substance blanche, tels que la sclérose en plaques34. De plus, après une lésion de la moelle épinière35, les débris de myéline peuvent moduler l’activation des macrophages, contribuant ainsi à l’inflammation chronique et aux lésions secondaires36. Par conséquent, l’imagerie in vivo de la gaine de myéline avec les neurones et les cellules gliales dans des modèles murins vivants est d’une grande aide pour comprendre les processus dynamiques dans les troubles du SNC.
Dans ce protocole, les procédures de configuration fondamentales d’un microscope TPEF-SRS construit à la maison sont décrites et les méthodes d’imagerie in vivo bimodales pour la moelle épinière de souris sont introduites.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des tissus biologiques dans son microenvironnement naturel basée sur la vibration moléculaire intrinsèque, fournissant ainsi un outil parfait pour l’étude in vivo des processus biologiques à résolution subcellulaire. En intégrant l’imagerie par fluorescence excitée à deux photons (TPEF) dans le microscope SRS, l’imagerie in vivo bimodale des tissus peut acquérir des informations biochimiques et biophysiques critiques à partir de multiples perspectives qui aident à comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus, etc. Dans ce protocole vidéo, la configuration d’un système de microscope TPEF-SRS ainsi que la méthode d’imagerie in vivo de la moelle épinière animale sont introduites. La moelle épinière, en tant que partie du système nerveux central, joue un rôle essentiel dans la communication entre le cerveau et le système nerveux périphérique. La gaine de myéline, abondante en phospholipides, entoure et isole l’axone pour permettre la conduction saltatoire des potentiels d’action. L’imagerie in vivo des gaines de myéline dans la moelle épinière est importante pour étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière. Le protocole décrit également la préparation animale et les méthodes d’imagerie TPEF-SRS in vivo pour acquérir des images biologiques à haute résolution.

L’imagerie bimodale in vivo des axones de la colonne vertébrale ainsi que des gaines de myéline est réalisée à l’aide de souris transgéniques Thy1-YFPH, qui expriment l’EYFP dans les neurones afférents des ganglions de la racine dorsale (Figure 3). Ces neurones afférents marqués relaient l’information sensorielle du nerf périphérique à la moelle épinière, la branche centrale étant située dans la colonne dorsale de la moelle épinière. Avec le microscope TPEF...

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In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

L’imagerie in vivo de tissus biologiques avec une résolution subcellulaire et une spécificité chimique est un outil puissant pour comprendre les processus dynamiques impliqués dans le métabolisme cellulaire, la réponse immunitaire et le remodelage des tissus. Avec la fluorescence combinée à deux photons et la microscopie à diffusion Raman stimulée, les informations biochimiques et biophysiques critiques des tissus biologiques peuvent être acquises à partir de multiples perspectives avec une résolution subcellulaire. Plus précisément, cette microscopie bimodale peut être utilisée pour imager la dynamique cellulaire et les interactions dans la moelle épinière de la souris afin d’étudier la progression des maladies neurodégénératives et des lésions de la moelle épinière.Pour commencer, allumez le laser saphir de titane en passant de la position de veille à la position allumée et attendez 30 minutes que le laser se réchauffe. Allumez ensuite l’OPO en cliquant sur le bouton de démarrage du panneau de commande OPO et attendez 20 minutes que le laser se réchauffe. Une fois le laser picoseconde réchauffé, vérifiez la profondeur de modulation du faisceau stokes en abaissant la puissance du faisceau Stokes à environ 20 milliwatts, en ouvrant l’obturateur laser du faisceau Stokes et en plaçant un photodétecteur haute vitesse à la sortie OPO pour détecter le faisceau.Ensuite, connectez le port de sortie du photodétecteur au port d’entrée d’un oscilloscope à l’aide d’un câble coaxial avec un connecteur BNC pour surveiller l’impulsion laser. Ouvrez ensuite la fenêtre de commande EOM dans le logiciel de contrôle OPO et ajustez la puissance et la phase EOM en fonction du diagramme d’intensité d’impulsion indiqué sur l’oscilloscope pour obtenir une profondeur de modulation maximale à 20 mégahertz. Dans le logiciel de contrôle OPO, ouvrez l’obturateur laser de la pompe tout en arrêtant la sortie Stokes.Ensuite, cliquez sur la boîte de signal définie pour définir la longueur d’onde du faisceau de la pompe à 796 nanomètres, puis cliquez sur la boîte d’alimentation OPO définie et entrez 20 pour régler sa puissance au minimum pour l’alignement optique. Ensuite, placez la plaque d’alignement P1 derrière le séparateur de faisceau polarisant à environ 10 centimètres et placez la plaque P2 derrière P1 à environ 30 centimètres sur le chemin optique. Après avoir ouvert l’obturateur du microscope pour le faisceau laser picoseconde, ajustez le miroir M1 pour localiser le centre du faisceau laser picoseconde au trou traversant de P1. Utilisez une lunette infrarouge pour observer la position du point de faisceau à P1 lors du réglage du miroir M1. De même, ajustez le miroir M2 pour localiser le centre du faisceau laser picoseconde au trou traversant de P2. Utilisez la lunette infrarouge pour observer la position du point de faisceau à P2 lors du réglage du miroir M2. Après avoir réglé les miroirs jusqu’à ce que le centre du faisceau picoseconde se situe au trou traversant des deux plaques d’alignement, fermez l’obturateur du faisceau picoseconde dans le logiciel de contrôle du microscope.Ensuite, ouvrez l’obturateur du microscope pour le faisceau laser femtoseconde. Ajustez le miroir M3 pour localiser le centre du point de faisceau laser femtoseconde au trou traversant de P1, puis ajustez le miroir M4 pour localiser le centre du point de faisceau laser femtoseconde au trou traversant de P2. Après avoir ajusté les miroirs jusqu’à ce que le centre du faisceau laser femtoseconde se trouve aux trous traversants des deux plaques d’alignement, fermez l’obturateur du microscope pour le faisceau femtoseconde. Ensuite, placez une caméra à la position de l’objectif pour visualiser l’emplacement des deux points de faisceau et marquer la position du faisceau de la pompe sur l’écran de la caméra comme référence.Placez ensuite une plaque d’alignement P0 avant l’objectif L3 et ajustez le miroir optique à l’aide d’une touche hexagonale afin que le centre du faisceau Stokes passe le trou traversant de la plaque d’alignement au port de sortie laser. Utilisez la lunette infrarouge pour confirmer la position du point de faisceau à P0 pendant le réglage. Ensuite, retirez la plaque d’alignement P0 et utilisez la touche hexadécimale pour régler le miroir optique deux afin que le centre du faisceau Stokes coïncide avec la marque de référence du faisceau de pompe sur la caméra.Continuez à régler les miroirs jusqu’à ce que le faisceau Stokes chevauche strictement le faisceau de la pompe à la fois sur les plans P0 et caméra. Ouvrez le logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage et réglez la longueur d’onde du laser de la pompe à 796 nanomètres et la puissance de la pompe et du faisceau de Stokes à 50 et 70 milliwatts correspondant respectivement à 15 et 25 milliwatts sur l’échantillon. Ensuite, utilisez de l’huile d’olive pour l’optimisation de la phase de l’amplificateur de verrouillage.L’huile d’olive est scellée dans une lame avec du papier de soie attaché au fond pour améliorer la diffusion du signal ou la détection EPI-SRS. Placez l’échantillon d’huile d’olive sur la scène et ajustez la mise au point de l’objectif 25X sur l’échantillon. À l’aide du logiciel de contrôle du microscope, définissez les paramètres d’imagerie mentionnés dans le manuscrit textuel.Ensuite, à l’aide du logiciel de contrôle de l’amplificateur de verrouillage, réglez la valeur de la constante de temps sur 10 microsecondes. Ensuite, scannez le faisceau laser sur l’échantillon, en réglant la phase avec une taille de pas de 22,5 degrés jusqu’à ce que l’intensité du signal SRS atteigne le maximum. Scannez ensuite l’échantillon avec l’obturateur laser fermé, en réglant la valeur de décalage avec une taille de pas d’un millivolt jusqu’à ce que le signal SRS moyen soit proche de zéro.Ensuite, ouvrez la boîte de dialogue du gestionnaire de retard dans le logiciel de contrôle OPO et scannez l’huile d’olive, en réglant l’étape de retard jusqu’à ce que le signal SRS de l’huile d’olive atteigne son maximum. Arrêtez ensuite l’analyse et cliquez sur le bouton Ajouter des données dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour enregistrer les données de retard actuelles. Après avoir acquis de la même manière des données de retard à différents décalages Raman en imageant divers échantillons chimiques, sélectionnez l’ajustement des données dans l’ordre cinq dans la boîte de dialogue du gestionnaire de retard pour adapter les points de données actuels à la fonction polynomique du cinquième ordre.Appliquez ensuite les données ajustées en cliquant sur le bouton Utiliser comme personnalisé et en cochant la case. L’étage de retard est automatiquement ajusté à différentes longueurs d’onde en fonction de la courbe de retard ajustée. Pour l’imagerie in vivo, fixez la souris au stade de stabilisation avec sa moelle épinière exposée et immergée dans une solution saline.Montez maintenant l’étage de stabilisation sur un étage à cinq axes sous le microscope TPEF-SRS. Ensuite, fixez la tête de la souris avec deux barres de tête et abaissez la plaque de maintien pour offrir suffisamment d’espace pour le mouvement de la poitrine pendant la respiration, atténuant ainsi les artefacts de mouvement. Ensuite, ajustez l’étage de translation Z pour régler la mise au point jusqu’à ce que l’image Brightfield de la vascularisation de la moelle épinière puisse être observée sous un objectif 10X.Localisez la veine dorsale de la moelle épinière au centre du champ de vision en réglant l’étape translationnelle à deux axes de l’étape à cinq axes. Ensuite, réglez les angles de roulis et de tangage de l’étage à cinq axes pour ajuster la surface dorsale de la moelle épinière perpendiculairement à l’axe de l’objectif en fonction de l’image Brightfield. Remplacez ensuite le 10X par un objectif d’immersion dans l’eau 25X pour l’imagerie TPEF-SRS.Pour l’imagerie SRS, sélectionnez le séparateur de faisceau polarisant au-dessus de l’objectif en appuyant sur le bouton de commutation connecté à la nageoire motorisée. Pour l’imagerie TPEF, sélectionnez le miroir dichroïque D2 au-dessus de l’objectif en appuyant sur le bouton de commutation connecté à la nageoire motorisée. Enfin, définissez les paramètres d’imagerie comme décrit dans le manuscrit textuel et commencez à numériser l’échantillon.L’imagerie bimodale in vivo des axones YFP et des gaines de myéline peu marqués dans la moelle épinière de la souris a révélé que les axones sont étroitement enveloppés par une épaisse couche de gaines de myéline. Comme on peut le voir sur l’image de la moelle épinière TPEF-SRS, les nœuds de Ranvier ont un diamètre axonal diminué et l’axilemme est directement exposé à la matrice extracellulaire. Combinée à de nouvelles sondes pour la fluorescence et l’imagerie SRS à fluorescence excitée à deux photons, la microscopie SRS peut réaliser simultanément l’imagerie structurelle et fonctionnelle de diverses biomolécules, facilitant ainsi notre compréhension des processus biologiques complexes.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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