Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Hong Kong Research Grants Council durch Zuschüsse 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, der Innovation and Technology Commission (ITCPD/17-9), dem Area of Excellence Scheme des University Grants Committee (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) und der Hong Kong University of Science & Technology (HKUST) durch den Zuschuss RPC10EG33 unterstützt.

Alle Tierverfahren, die bei dieser Arbeit durchgeführt werden, werden gemäß den Richtlinien der Laboratory Animal Facility der Hong Kong University of Science and Technology (HKUST) durchgeführt und von der Tierethikkommission der HKUST genehmigt. Für die Einrichtung und Bedienung des TPEF-SRS-Mikroskops ist eine Sicherheitsschulung für die Laserhandhabung erforderlich. Tragen Sie immer eine Laserschutzbrille mit entsprechendem Wellenlängenbereich, wenn es um Laser geht.
1. Aufbau...

In diesem Protokoll wird der grundlegende Aufbau des TPEF-SRS-Mikroskops ausführlich beschrieben. Für die SRS-Bildgebung sind die Pumpe und die Stokes-Strahlen innerhalb des OPO zeitlich und räumlich überlappt. Diese Überlappung kann jedoch nach dem Durchlaufen des Mikroskopsystems unterbrochen werden. Daher ist sowohl die räumliche als auch die zeitliche Optimierung der Kolokalisation der Pumpe und der Stokes-Träger notwendig und entscheidend, um eine optimale SRS-Bildgebung zu erreichen. Die zeitliche Verzöger...

Die Raman-Mikroskopie1,2 entwickelt sich zu einer leistungsstarken markierungsfreien Methode, um biologisches Gewebe basierend auf den charakteristischen Frequenzen verschiedener chemischer Bindungen in Biomolekülen abzubilden. Aufgrund ihrer nicht-invasiven und gut adaptiven Bildgebungsfähigkeit wurde die Raman-Mikroskopie häufig für die Bildgebung von lipidangereicherten Komponenten in biologischen Geweben wie Myelinscheide3,4,5, Adipozyten6,7 und Lipidtröpfchen eingesetzt8,9,10 . Das Signal der stimulierten Raman-Streuung (SRS), das als stimulierter Raman-Gewinn (SRG) oder stimulierter Raman-Verlust (SRL) erfasst wird, ist hintergrundfrei und zeigt eine perfekte spektrale Ähnlichkeit mit spontaner Raman-Streuung11,12. Darüber hinaus sind SRL und SRG linear von der Analytkonzentration abhängig, was eine quantitative Analyse der biochemischen Komponenten ermöglicht9,11,13. Die Zwei-Photonen-angeregte Fluoreszenzmikroskopie (TPEF) wurde aufgrund ihrer inhärenten optischen Schnittfähigkeit, tiefen Eindringtiefe und geringen Phototoxizität häufig für die biologische In-vivo-Bildgebung eingesetzt14,15,16. Die Leistung der TPEF-Bildgebung hängt jedoch von den Eigenschaften fluoreszierender Tags ab, und die Anzahl der auflösbaren Farben ist aufgrund der breitbandigen Fluoreszenzspektren begrenzt8,17,18,19. Markierungsfreie SRS-Bildgebung und fluoreszenzbasierte TPEF-Bildgebung sind zwei komplementäre Bildgebungsmodalitäten, und ihre Kombination kann reichlich biophysikalische und biochemische Informationen über Gewebe liefern. Diese beiden Bildgebungsmodalitäten basieren beide auf den nichtlinearen optischen (NLO) Prozessen, die eine einfache Integration in ein Mikroskopsystem ermöglichen. Die Kombination der SRS- und TPEF-Bildgebung, die sogenannte dual-modale Bildgebung, ermöglicht eine hochdimensionale Bildgebung und Profilierung von Zellen und Geweben und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis komplexer biologischer Systeme. Insbesondere kann die Pikosekunden-SRS-Mikroskopie eine chemische Bindungsbildgebung mit hoher spektraler Auflösung im Vergleich zur Femtosekunden-SRS-Technik (fs)11 erreichen, die es ermöglicht, mehrere biochemische Komponenten in biologischem Gewebe zu unterscheiden, insbesondere in der überfüllten Fingerabdruckregion20,21. Darüber hinaus zeigt SRS im Vergleich zu einem anderen häufig verwendeten dual-modalen NLO-Mikroskopsystem mit Integration eines kohärenten Anti-Stokes-Streumikroskops (CARS) eine überlegene Leistung gegenüber CARS in Bezug auf Spektral- und Bildinterpretation sowie Detektionsempfindlichkeit11. Das SRS-TPEF-Mikroskop wurde als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung verschiedener biologischer Systeme verwendet, wie Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis Kaulquappengehirn5, Mausgehirn23,24, Rückenmark25,26, peripherer Nerv27 und Fettgewebe7 usw.
Das Rückenmark bildet zusammen mit dem Gehirn das zentrale Nervensystem (ZNS). Die Visualisierung zellulärer Aktivitäten im ZNS in vivo unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von ZNS-Erkrankungen28,29,30 und für die Entwicklung entsprechender Therapien31,32,33. Die Myelinscheide, die Axone für eine Hochgeschwindigkeits-Wirkungspotentialleitung umhüllt und isoliert, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Die Demyelinisierung gilt als Kennzeichen bei Erkrankungen der weißen Substanz wie der Multiplen Sklerose34. Darüber hinaus können Myelinreste nach einer Rückenmarksverletzung35 die Makrophagenaktivierung modulieren, was zu chronischen Entzündungen und Sekundärverletzungen beiträgt36. Daher ist die In-vivo-Bildgebung von Myelinhüllen zusammen mit Neuronen und Gliazellen in lebenden Mausmodellen eine große Hilfe, um die dynamischen Prozesse bei ZNS-Erkrankungen zu verstehen.
In diesem Protokoll werden die grundlegenden Setup-Verfahren eines selbst gebauten TPEF-SRS-Mikroskops beschrieben und die dual-modalen In-vivo-Bildgebungsverfahren für das Rückenmark der Maus vorgestellt.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ermöglicht eine markierungsfreie Abbildung des biologischen Gewebes in seiner natürlichen Mikroumgebung auf der Grundlage intrinsischer molekularer Schwingungen und ist somit ein perfektes Werkzeug für die In-vivo-Untersuchung biologischer Prozesse bei subzellulärer Auflösung. Durch die Integration der Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenzbildgebung (TPEF) in das SRS-Mikroskop kann die dual-modale In-vivo-Bildgebung von Geweben kritische biochemische und biophysikalische Informationen aus mehreren Perspektiven erfassen, die helfen, die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau usw. beteiligt sind. In diesem Videoprotokoll wird der Aufbau eines TPEF-SRS-Mikroskopsystems sowie das in vivo bildgebende Verfahren des tierischen Rückenmarks vorgestellt. Das Rückenmark spielt als Teil des zentralen Nervensystems eine entscheidende Rolle bei der Kommunikation zwischen dem Gehirn und dem peripheren Nervensystem. Myelinscheide, die reich an Phospholipiden ist, umgibt und isoliert das Axon, um eine salzige Leitung von Aktionspotentialen zu ermöglichen. Die In-vivo-Bildgebung von Myelinscheiden im Rückenmark ist wichtig, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt auch die Tierpräparation und in vivo TPEF-SRS-Bildgebungsverfahren zur Aufnahme hochauflösender biologischer Bilder.

Die in vivo dual-modale Bildgebung von spinalen Axonen sowie Myelinscheiden wird mit den transgenen Thy1-YFPH-Mäusen durchgeführt, die EYFP in afferenten Neuronen des dorsalen Wurzelganglions exprimieren (Abbildung 3). Diese gekennzeichneten afferenten Neuronen leiten die sensorischen Informationen vom peripheren Nerv an das Rückenmark weiter, wobei sich der zentrale Ast in der Rückenmarksdorsalsäule befindet. Mit dem TPEF-SRS-Mikroskop können dicht verteilte Myelinhüllen mit...

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In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Die In-Vivo-Bildgebung von biologischem Gewebe mit subzellulärer Auflösung und chemischer Spezifität ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die dynamischen Prozesse zu verstehen, die am Zellstoffwechsel, der Immunantwort und dem Gewebeumbau beteiligt sind. Mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie können kritische biochemische und biophysikalische Informationen biologischer Gewebe aus mehreren Perspektiven mit subzellulärer Auflösung erfasst werden. Insbesondere kann diese dual-modale Mikroskopie verwendet werden, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen im Rückenmark der Maus abzubilden, um das Fortschreiten von neurodegenerativen Erkrankungen und Rückenmarksverletzungen zu untersuchen.Schalten Sie zunächst den Titan-Saphirlaser ein, indem Sie den Schlüsselschalter von der Standby- in die Ein-Position schalten und 30 Minuten warten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Schalten Sie dann den OPO ein, indem Sie auf die Starttaste auf dem OPO Control Panel klicken und warten Sie 20 Minuten, bis sich der Laser aufgewärmt hat. Nachdem sich der Pikosekundenlaser erwärmt hat, überprüfen Sie die Modulationstiefe des Stokes-Strahls, indem Sie die Leistung des Stokes-Strahls auf etwa 20 Milliwatt senken, den Laserverschluss für den Stokes-Strahl öffnen und einen Hochgeschwindigkeits-Fotodetektor am OPO-Ausgang platzieren, um den Strahl zu erkennen.Als nächstes verbinden Sie den Ausgangsanschluss des Photodetektors mit dem Eingangsanschluss eines Oszilloskops über ein Koaxialkabel mit einem BNC-Anschluss, um den Laserpuls zu überwachen. Öffnen Sie dann das EOM-Steuerungsfenster in der OPO-Steuerungssoftware und passen Sie die EOM-Leistung und -Phase entsprechend dem auf dem Oszilloskop gezeigten Pulsintensitätsdiagramm an, um eine maximale Modulationstiefe von 20 Megahertz zu erreichen. Öffnen Sie in der OPO-Steuerungssoftware den Laserverschluss der Pumpe, während Sie die Stokes-Ausgabe stoppen.Klicken Sie anschließend auf das Stellwerk, um die Wellenlänge des Pumpenstrahls auf 796 Nanometer einzustellen, klicken Sie dann auf die eingestellte OPO-Stromversorgungsbox und geben Sie 20 ein, um die Leistung für die optische Ausrichtung auf das Minimum einzustellen. Als nächstes platzieren Sie die Ausrichtungsplatte P1 hinter dem polarisierenden Strahlteiler bei etwa 10 Zentimetern und platzieren Sie die Platte P2 hinter P1 bei etwa 30 Zentimetern auf dem optischen Weg. Nachdem Sie den Mikroskopverschluss für den Pikosekunden-Laserstrahl geöffnet haben, stellen Sie den Spiegel M1 so ein, dass er die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P1 lokalisiert. Verwenden Sie ein Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P1 beim Einstellen des Spiegels M1 zu beobachten. Stellen Sie den Spiegel M2 entsprechend ein, um die Pikosekunden-Laserstrahlmitte am Durchgangsloch von P2 zu lokalisieren. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P2 beim Einstellen des Spiegels M2 zu beobachten. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Pikosekundenstrahlmitte am Durchgangsloch beider Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Verschluss des Pikosekundenstrahls in der Mikroskopsteuerungssoftware.Öffnen Sie als Nächstes den Mikroskopverschluss für den Femtosekunden-Laserstrahl. Stellen Sie den Spiegel M3 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P1 lokalisiert, und stellen Sie dann den Spiegel M4 so ein, dass er das Femtosekunden-Laserstrahlpunktzentrum am Durchgangsloch von P2 lokalisiert. Nachdem Sie die Spiegel eingestellt haben, bis sich die Femtosekunden-Laserstrahlmitte an den Durchgangslöchern der beiden Ausrichtungsplatten befindet, schließen Sie den Mikroskopverschluss für den Femtosekundenstrahl. Platzieren Sie als Nächstes eine Kamera an der Position des Objektivs, um die Position der beiden Strahlpunkte zu visualisieren, und markieren Sie die Position des Pumpstrahls auf dem Kamerabildschirm als Referenz.Platzieren Sie dann eine Ausrichtungsplatte P0 vor dem Objektiv L3 und stellen Sie den optischen Spiegel mit einer Hex-Taste so ein, dass die Stokes-Strahlmitte das Durchgangsloch der Ausrichtungsplatte am Laserausgangsanschluss passiert. Verwenden Sie das Infrarot-Zielfernrohr, um die Position des Strahlpunkts bei P0 während der Einstellung zu bestätigen. Entfernen Sie als Nächstes die Ausrichtungsplatte P0 und verwenden Sie die Hex-Taste, um den optischen Spiegel zwei so einzustellen, dass die Mitte des Stokes-Strahls mit der Referenzmarkierung des Pumpstrahls auf der Kamera kolokalisiert wird.Stellen Sie die Spiegel so lange ein, bis sich der Stokes-Strahl sowohl bei P0 als auch bei den Kameraebenen strikt mit dem Pumpenstrahl überlappt. Öffnen Sie die Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware und stellen Sie die Wellenlänge des Pumpenlasers auf 796 Nanometer und die Leistung der Pumpe und des Stokes-Strahls auf 50 bzw. 70 Milliwatt ein, was 15 bzw. 25 Milliwatt auf der Probe entspricht. Verwenden Sie dann Olivenöl für die Optimierung der Lock-in-Verstärkerphase.Das Olivenöl wird in einem Objektträger mit Seidenpapier an der Unterseite versiegelt, um die Signalrückstreuung oder EPI-SRS-Erkennung zu verbessern. Legen Sie die Olivenölprobe auf die Bühne und stellen Sie den Fokus des 25X-Objektivs auf die Probe ein. Stellen Sie mit der Mikroskopsteuerungssoftware die Bildgebungsparameter ein, wie im Textmanuskript erwähnt.Stellen Sie dann mit der Lock-in-Verstärkersteuerungssoftware den Zeitkonstantenwert auf 10 Mikrosekunden ein. Als nächstes scannen Sie den Laserstrahl über die Probe und stimmen die Phase mit einer Schrittweite von 22,5 Grad ab, bis die SRS-Signalintensität das Maximum erreicht. Scannen Sie dann die Probe mit geschlossenem Laserverschluss und stimmen Sie den Offset-Wert mit einer Schrittweite von einem Millivolt ab, bis das durchschnittliche SRS-Signal nahe Null liegt.Öffnen Sie als Nächstes den Verzögerungsmanager-Dialog in der OPO-Steuerungssoftware und scannen Sie das Olivenöl, wobei Sie die Verzögerungsstufe abstimmen, bis das Olivenöl-SRS-Signal sein Maximum erreicht. Stoppen Sie dann den Scanvorgang und klicken Sie im Dialogfeld "Verzögerungsmanager" auf die Schaltfläche "Daten hinzufügen", um die aktuellen Verzögerungsdaten aufzuzeichnen. Nachdem Sie auf ähnliche Weise Verzögerungsdaten an verschiedenen Raman-Verschiebungen durch die Abbildung verschiedener chemischer Proben erfasst haben, wählen Sie die Datenanpassung in der Reihenfolge fünf im Verzögerungsmanagerdialogfeld, um die aktuellen Datenpunkte mit der polynomischen Funktion fünfter Ordnung abzugleichen.Wenden Sie dann die angepassten Daten an, indem Sie auf die Schaltfläche Als benutzerdefiniert verwenden klicken und das Kontrollkästchen aktivieren. Die Verzögerungsstufe wird bei verschiedenen Wellenlängen entsprechend der angepassten Verzögerungskurve automatisch angepasst. Für die In-vivo-Bildgebung fixieren Sie die Maus auf der Stabilisierungsstufe, wobei ihr Rückenmark freigelegt und in Kochsalzlösung eingetaucht ist.Montieren Sie nun die Stabilisierungsstufe auf einer Fünf-Achsen-Stufe unter dem TPEF-SRS-Mikroskop. Sichern Sie dann den Mauskopf mit zwei Kopfstangen und senken Sie die Halteplatte ab, um genügend Platz für Brustbewegungen während der Atmung zu bieten und Bewegungsartefakte zu lindern. Als nächstes passen Sie das Z-Translationsstadium an, um den Fokus so einzustellen, bis das Hellfeldbild der Rückenmarksvaskulatur unter einem 10X-Objektiv beobachtet werden kann.Lokalisieren Sie die Rückenmarksvene in der Mitte des Sichtfeldes, indem Sie die zweiachsige Translationsstufe der fünfachsigen Stufe abstimmen. Passen Sie als Nächstes die Roll- und Nickwinkel der Fünf-Achsen-Stufe an, um die Rückenmarksoberfläche senkrecht zur Objektivachse basierend auf dem Hellfeldbild anzupassen. Ersetzen Sie dann das 10X durch ein 25X Wassertauchobjektiv für die TPEF-SRS-Bildgebung.Für die SRS-Bildgebung wählen Sie den Polarisationsstrahlteiler über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Wählen Sie für die TPEF-Bildgebung den dichroitischen Spiegel D2 über dem Objektiv aus, indem Sie die Schalttaste drücken, die mit dem motorisierten Flipper verbunden ist. Stellen Sie abschließend die Bildgebungsparameter wie im Textmanuskript beschrieben ein und beginnen Sie mit dem Scannen der Probe.In vivo zeigte die dual-modale Bildgebung von spärlich markierten YFP-Axonen und Myelinscheiden im Rückenmark der Maus, dass die Axone eng von einer dicken Schicht von Myelinscheiden umwickelt sind. Wie im TPEF-SRS-Rückenmarksbild zu sehen ist, haben die Knoten von Ranvier einen verringerten axonalen Durchmesser und das Axilemma ist direkt der extrazellulären Matrix ausgesetzt. In Kombination mit neuen Sonden für Fluoreszenz und SRS-Bildgebung mit Zwei-Photonen-angeregter Fluoreszenz kann die SRS-Mikroskopie eine gleichzeitige strukturelle und funktionelle Bildgebung verschiedener Biomoleküle erreichen, was unser Verständnis komplexer biologischer Prozesse erleichtert.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Ablehnung des Fluorescence Resonance Hintergrund in und Spontane Raman Mikrospektroskopie

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Forschung

Biotechnik

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Kleine und Wide Angle X-Ray Scattering Studium der biologischen Makromolekülen in Lösung

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imaging von biologischem Gewebe durch Desorption Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...