Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת מענקי המחקר של הונג קונג באמצעות מענקים 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, ועדת החדשנות והטכנולוגיה (ITCPD/17-9), תחום תוכנית המצוינות של ועדת המענקים של האוניברסיטה (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12), ואוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) באמצעות מענק RPC10EG33.

כל ההליכים בבעלי חיים המבוצעים בעבודה זו מתנהלים על פי הנחיות מתקן בעלי החיים במעבדה של אוניברסיטת הונג קונג למדע וטכנולוגיה (HKUST) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של HKUST. הכשרת בטיחות לטיפול בלייזר נדרשת כדי להגדיר ולהפעיל את מיקרוסקופ TPEF-SRS. תמיד ללבוש משקפי בטיחות לייזר עם טווח אורך ג...

בפרוטוקול זה, ההתקנה הבסיסית של מיקרוסקופ TPEF-SRS מתוארת בפירוט. עבור הדמיית SRS, המשאבה וקורות סטוקס חופפות זמנית ומרחבית בתוך OPO. עם זאת, חפיפה זו יכולה להיות משובשת לאחר שעבר דרך מערכת המיקרוסקופ. לכן, הן אופטימיזציה מרחבית והן אופטימיזציה זמנית של colocalization של המשאבה וקורות סטוקס הוא הכרחי ו?...

ראמאן מיקרוסקופיה1,2 מתגלה כשיטה רבת עוצמה ללא תוויות לדמות רקמות ביולוגיות המבוססות על התדרים האופייניים של קשרים כימיים שונים בביומולקולות. הודות ליכולת ההדמיה הלא פולשנית והמסתגלת היטב שלה, המיקרוסקופיה של ראמאן נמצא בשימוש נרחב להדמיית רכיבים מועשרים בשומנים ברקמות ביולוגיות כמו נדן מיאלין3,4,5, אדיפוציטים6,7 וטיפות שומנים בדם8,9,10 . אות פיזור ראמאן מגורה (SRS) שנרכש כרווח ראמאן מגורה (SRG) או אובדן ראמאן מגורה (SRL) הוא ללא רקע, מראה דמיון ספקטרלי מושלם פיזור ראמאן ספונטני 11,12. בנוסף, SRL ו- SRG תלויים באופן ליניארי בריכוז הניתוח, ומאפשרים ניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים9,11,13. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נרגשת דו-פוטונית (TPEF) נמצאת בשימוש נרחב להדמיה ביולוגית in vivo בשל יכולת החתך האופטית הטבועה בה, עומק החדירה העמוק והפוטוטוקסיות הנמוכה14,15,16. עם זאת, הביצועים של הדמיית TPEF תלויים במאפיינים של תגים פלואורסצנטיים, ומספר הצבעים הפתירים מוגבל עקב ספקטרום פלואורסצנטיות בפס רחב8,17,18,19. הדמיית SRS ללא תוויות והדמיה מבוססת פלואורסצנטיות TPEF הן שתי שיטות הדמיה משלימות, והשילוב ביניהן יכול לספק מידע ביופיסי וביוכימי בשפע של רקמות. שתי שיטות הדמיה אלה מבוססות שתיהן על התהליכים האופטיים הלא ליניאריים (NLO), המאפשרים אינטגרציה פשוטה במערכת מיקרוסקופ אחת. השילוב של הדמיית SRS ו- TPEF, מה שמכונה הדמיה דו-מודאלית, מאפשר הדמיה ופרופילים ממדיים גבוהים של תאים ורקמות, ומאפשר הבנה מקיפה של מערכות ביולוגיות מורכבות. באופן ספציפי, picosecond (ps) מיקרוסקופיה SRS יכול להשיג הדמיה כימית-קשר עם רזולוציה ספקטרלית גבוהה לעומת femtosecond (fs) SRS טכניקה11, המאפשר להבדיל בין רכיבים ביוכימיים מרובים ברקמה ביולוגית, במיוחד באזור טביעת האצבע הצפוף20,21. בנוסף, בהשוואה למערכת מיקרוסקופית אחרת של NLO הדו-מודאלית הנפוצה עם שילוב של מיקרוסקופ פיזור אנטי-סטוקס קוהרנטי (CARS), SRS מציג ביצועים מעולים למכוניות במונחים של פרשנות ספקטרלית ותמונה, כמו גם רגישות לזיהוי11. המיקרוסקופ SRS-TPEF שימש ככלי רב עוצמה לחקר מערכות ביולוגיות שונות, כגון Elegans Caenorhabditis9,22, מוח ראשן קסנופוס laevis5, מוח עכבר23,24, חוט השדרה25,26, עצב היקפי27, רקמת שומן7, וכו '.
חוט השדרה יחד עם המוח מרכיבים את מערכת העצבים המרכזית (CNS). הדמיית הפעילות התאית במערכת העצבים המרכזית במערכת העצבים המרכזית ב-vivo בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים היא קריטית להבנת המנגנונים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית28,29,30 ולפיתוח טיפולים מקבילים31,32,33. נדן מיאלין, העוטף ומבודד אקסונים להולכה פוטנציאלית של פעולה במהירות גבוהה, ממלא תפקיד משמעותי בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית. Demyelination נחשב כסימן היכר בהפרעות חומר לבן, כגון טרשת נפוצה34. בנוסף, לאחר פגיעה בחוט השדרה35, פסולת מיאלין יכולה לווסת את הפעלת המקרופאג ', התורמת לדלקת כרונית ולפציעה משנית36. לכן, בהדמיית vivo של נדן מיאלין יחד עם נוירונים ותאי גליה במודלים של עכבר חי הוא לעזר רב להבין את התהליכים הדינמיים בהפרעות במערכת העצבים המרכזית.
בפרוטוקול זה מתוארים הליכי ההתקנה הבסיסיים של מיקרוסקופ TPEF-SRS ביתי ומוכנסים המודאליות הכפולות בשיטות הדמיית vivo לחוט השדרה של העכבר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של הרקמות הביולוגיות במיקרו-סביבה הטבעית שלה המבוססת על רטט מולקולרי מהותי, ובכך מספקת כלי מושלם לחקר vivo של תהליכים ביולוגיים ברזולוציה תת-תאית. על ידי שילוב הדמיית פלואורסצנטיות נרגשת דו-פוטונית (TPEF) במיקרוסקופ SRS, הדו-מודאלי בהדמיית vivo של רקמות יכול לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי מנקודות מבט מרובות המסייעות בהבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות וכו '. בפרוטוקול וידאו זה, ההתקנה של מערכת מיקרוסקופ TPEF-SRS, כמו גם את שיטת הדמיית in vivo של חוט השדרה החייתי הוא הציג. חוט השדרה, כחלק ממערכת העצבים המרכזית, ממלא תפקיד קריטי בתקשורת בין המוח למערכת העצבים ההיקפית. נדן מיאלין, השופע בפוספוליפידים, מקיף ומבודד את האקסון כדי לאפשר הולכה מלוחה של פוטנציאל פעולה. בהדמיית vivo של נדן מיאלין בחוט השדרה חשוב ללמוד את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה. הפרוטוקול מתאר גם הכנה לבעלי חיים ושיטות הדמיה של vivo TPEF-SRS לרכישת תמונות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה.

הדמיה דו-מודאלית של אקסונים בעמוד השדרה, כמו גם נדן מיאלין, מתבצעת באמצעות העכברים הטרנסגניים Thy1-YFPH, המבטאים EYFP בתאי עצב של גנגליון שורש גב (איור 3). נוירונים אלה המסומנים כמתויגים מעבירים את המידע החושי מהעצב ההיקפי לחוט השדרה, כאשר הענף המרכזי ממוקם בעמוד הגב של חוט הש...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה ללא תוויות של ביומולקולות המבוססות על הרטט הפנימי שלהם של קשרים כימיים ספציפיים. בפרוטוקול זה, ההתקנה האינסטרומנטלית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב של SRS ושני פוטונים מתוארת כדי לדמיין מבנים תאיים בחוט השדרה של עכברים חיים.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

בהדמיית Vivo של רקמות ביולוגיות עם רזולוציה תת-תאית וספציפיות כימית הוא כלי רב עוצמה להבנת התהליכים הדינמיים הכרוכים בחילוף החומרים התאי, התגובה החיסונית ושיפוץ הרקמות. עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה מגרה של ראמאן, ניתן לרכוש מידע ביוכימי וביופיזי קריטי של רקמות ביולוגיות מנקודות מבט מרובות עם רזולוציה תת-תאית. באופן ספציפי, מיקרוסקופיה דו-מודאלית זו יכולה לשמש לתמונה של דינמיקה תאית ואינטראקציות בחוט השדרה של העכבר כדי לחקור את ההתקדמות של מחלות ניווניות ופגיעה בחוט השדרה.כדי להתחיל, להפעיל את לייזר ספיר טיטניום על ידי החלפת מתג המפתח מן המתנה למצב על ולחכות 30 דקות עבור הלייזר להתחמם. לאחר מכן הפעל את OPO על-ידי לחיצה על לחצן ההתחלה בלוח הבקרה של OPO והמתן 20 דקות עד שהלייזר יתחמם. לאחר שהלייזר picosecond מתחמם, בדוק את עומק האפנון של קרן סטוקס על ידי הורדת כוחה של קרן סטוקס לכ -20 מילי-וואט, פתיחת תריס הלייזר לקרן סטוקס והצבת גלאי צילום במהירות גבוהה בפלט OPO כדי לזהות את הקרן.לאחר מכן, חבר את יציאת הפלט של הפוטדקטור ליציאת הקלט של אוסצילוסקופ באמצעות כבל קואקסיאלי עם מחבר BNC לניטור פעימת הלייזר. לאחר מכן פתח את חלון הבקרה של EOM בתוכנת בקרת OPO והתאם את העוצמה והפזה של EOM בהתאם לדיאגרמת עוצמת הדופק המוצגת באוסצילוסקופ כדי להשיג עומק אפנון מרבי של 20 מגה-הרץ. בתוכנת בקרת OPO, פתח את תריס הלייזר משאבה תוך עצירת פלט סטוקס.לאחר מכן, לחץ על תיבת האות להגדיר כדי להגדיר את אורך הגל של קרן המשאבה ל 796 ננומטר, ולאחר מכן לחץ על תיבת הכוח OPO להגדיר ולהזין 20 כדי להגדיר את כוחה למינימום עבור יישור אופטי. לאחר מכן, הניחו את צלחת היישור P1 מאחורי מפצל הקרן המקטבת בכ -10 ס"מ ומניחים את הצלחת P2 מאחורי P1 בכ -30 ס"מ על הנתיב האופטי. לאחר פתיחת תריס המיקרוסקופ עבור קרן הלייזר picosecond, להתאים את המראה M1 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר picosecond בחור המעבר של P1. השתמש בטווח אינפרא-אדום כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P1 בעת התאמת המראה M1. באופן דומה, התאם את המראה M2 כדי לאתר את מרכז קרן הלייזר של פיקוסונד בחור העובר של P2. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לבחון את מיקום נקודת הקרן ב- P2 בעת התאמת המראה M2. לאחר התאמת המראות עד שמרכז הקרן של picosecond מאתר את החור העובר של שתי לוחות היישור, סגור את התריס של קרן picosecond בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.לאחר מכן, פתח את תריס המיקרוסקופ לקרן הלייזר הפמטו-שנייה. התאם את המראה M3 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר femtosecond בחור העובר של P1, ולאחר מכן להתאים את המראה M4 כדי לאתר את מרכז נקודת קרן הלייזר femtosecond בחור האחרון של P2. לאחר התאמת המראות עד שמרכז קרן הלייזר הפמטו-שניות מאתר את החורים העובריים של שתי לוחות היישור, סגור את תריס המיקרוסקופ עבור קרן הפמטו-שנייה. לאחר מכן, מקם מצלמה במיקום המטרה כדי לדמיין את המיקום של שני כתמי הקרן ולסמן את המיקום של קרן המשאבה על מסך המצלמה כהפניה.לאחר מכן מקם לוח יישור P0 לפני העדשה L3 ולהתאים את המראה האופטית אחד באמצעות מקש כישוף, כך מרכז קרן סטוקס עובר את החור העובר של צלחת היישור ביציאת יציאת לייזר. השתמש בטווח האינפרא-אדום כדי לאשר את מיקום נקודת הקרן ב- P0 במהלך ההתאמה. לאחר מכן, להסיר את לוח היישור P0 ולהשתמש במקש כישוף כדי להתאים את המראה האופטית שתיים, כך מרכז קרן סטוקס co-לוקליזציה עם סימן הייחוס של קרן המשאבה על המצלמה.המשיכו להתאים את המראות עד שקרן סטוקס תחפוף לחלוטין עם קרן המשאבה הן ב- P0 והן במישורי המצלמה. פתח את תוכנת בקרת המגבר הנעילה והגדר את אורך הגל של לייזר המשאבה ל -796 ננומטר ואת כוח המשאבה ואת קרן סטוקס ל -50 ו -70 מילי וואט המקבילים ל -15 ו -25 מילי וואט במדגם בהתאמה. לאחר מכן השתמשו בשמן זית לאופטימיזציה של שלב המגבר.שמן הזית אטום בשקופית עם נייר טישו המחובר לתחתית כדי לשפר את פיזור האות בחזרה או זיהוי EPI-SRS. מניחים את דגימת שמן הזית על הבמה ומתאימים את המוקד של המטרה 25X על המדגם. באמצעות תוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר את פרמטרי ההדמיה כפי שצוינו בכתב היד של הטקסט.לאחר מכן, באמצעות תוכנת בקרת מגבר הנעילה, הגדר את ערך קבוע הזמן ל- 10 מיקרו-שניות. לאחר מכן, לסרוק את קרן הלייזר מעל המדגם, כוונון השלב עם גודל צעד של 22.5 מעלות עד עוצמת האות SRS מגיע למקסימום. לאחר מכן סרוק את המדגם עם תריס הלייזר סגור, כוונון ערך ההיסט עם גודל צעד של מיליוולט אחד עד אות SRS הממוצע קרוב לאפס.לאחר מכן, פתחו את תיבת הדו-שיח של מנהל ההשהיה בתוכנת הבקרה של OPO וסרקו את שמן הזית, תוך כוונון שלב ההשהיה עד שאות SRS של שמן הזית יגיע למקסימום. לאחר מכן הפסק את הסריקה ולחץ על לחצן הוסף נתונים בתיבת הדו-שיח מנהל ההשהיה כדי להקליט את נתוני ההשהיה הנוכחיים. לאחר שנרכש באופן דומה נתוני עיכוב במשמרות ראמאן שונות על ידי הדמיית דגימות כימיות שונות, בחר את התאמת הנתונים לפי סדר חמש בתיבת הדו-שיח של מנהל העיכובים כדי להתאים את נקודות הנתונים הנוכחיות לפונקציה הפולינומית מסדר חמישי.לאחר מכן החל את הנתונים המותאמים על-ידי לחיצה על לחצן השימוש כלחצן מותאם אישית ובדיקת תיבת הסימון. שלב ההשהיה מותאם אוטומטית באורכי גל שונים בהתאם לעקומת ההשהיה המותאמת. להדמיית vivo, תקן את העכבר בשלב הייצוב עם חוט השדרה שלו חשוף ושקוע מלוחים.כעת הרם את שלב הייצוב על שלב חמישה צירים מתחת למיקרוסקופ TPEF-SRS. לאחר מכן אבטחו את ראש העכבר עם שני מוטות ראש והורידו את לוח ההחזקה כדי להציע מספיק מקום לתנועת החזה במהלך הנשימה, תוך הקלה על ממצאי תנועה. לאחר מכן, התאם את שלב התרגום Z כדי לכוונן את המוקד עד שניתן יהיה לצפות בתמונת ברייטפילד של כלי הדם של חוט השדרה תחת מטרה של פי 10.אתר את וריד הגב של חוט השדרה במרכז שדה הראייה על ידי כוונון השלב התרגומי הדו-צירי של שלב חמשת הצירים. לאחר מכן, כוונן את זוויות הגליל וההגשה של שלב חמשת הצירים כדי להתאים את משטח הגב של חוט השדרה בניצב לציר המטרה בהתבסס על התמונה של ברייטפילד. לאחר מכן החליפו את ה-10X במטרה טבילת מים פי 25 להדמיית TPEF-SRS.להדמיית SRS, בחר את מפצל הקרן המקטבת מעל המטרה על-ידי לחיצה על כפתור המתג המחובר לסנפיר הממונע. להדמיית TPEF, בחרו את המראה הדיכרואית D2 מעל המטרה על-ידי לחיצה על כפתור המתג המחובר לסנפיר הממונע. לבסוף, הגדר את פרמטרי ההדמיה כמתואר בכתב היד של הטקסט והתחל לסרוק את המדגם.בהדמיה דו-מודאלית של אקסונים YFP בעלי תווית דלילה ועטיפות מיאלין בחוט השדרה של העכבר, התברר כי האקסונים עטופים היטב בשכבה עבה של נדן מיאלין. כפי שניתן לראות בתמונת חוט השדרה TPEF-SRS, הצמתים של Ranvier ירדו קוטר האקסוני ואת האקסילמה נחשפת ישירות מטריצה חוץ תאית. בשילוב עם בדיקות חדשות עבור פלואורסצנטיות ו- SRS הדמיה שני פוטונים נרגש פלואורסצנטיות SRS מיקרוסקופיה יכול להשיג הדמיה מבנית ותפקודית בו זמנית של ביומולקולות שונות, להקל על ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מורכבים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

מחקרים קטנים ורחבים זווית X-Ray פיזור של מקרומולקולות ביולוגיות בפתרון

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הדמיה של רקמות ביולוגיות על ידי Desorption electrospray יינון המוני ספקטרומטריית

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל<em&gt; In vivo</em&gt; דימות אופטי

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...