Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

この研究は、香港研究助成金評議会の助成金16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19、イノベーション技術委員会(ITCPD/17-9)、大学助成金委員会のエリア・オブ・エクセレンス・スキーム(AoE/M-604/16、AOE/M-09/12)、香港科技大学(HKUST)の助成金RPC10EG33を通じて支援を受けました。

この作業で実施されるすべての動物処置は、香港科技大学(HKUST)の実験動物施設のガイドラインに従って行われ、HKUSTの動物倫理委員会によって承認されています。TPEF-SRS顕微鏡のセットアップと操作には、レーザーハンドリングの安全トレーニングが必要です。レーザーを扱うときは、常に適切な波長範囲のレーザー安全ゴーグルを着用してください。
1. TPEF-SRS顕微?...

このプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップが詳細に説明されています。SRSイメージングの場合、ポンプビームとストークスビームはOPO内で時間的および空間的に重なり合っています。しかしながら、この重なりは、顕微鏡システムを通過した後に破壊され得る。したがって、ポンプビームとストークスビームの共局在化の空間的および時間的最適化の両方が、最適なSRSイメ?...

ラマン顕微鏡1,2は、生体分子中の様々な化学結合の特徴的な周波数に基づいて生体組織を画像化する強力な標識フリー法として浮上している。ラマン顕微鏡は、その非侵襲的で適応性の高いイメージング能力により、ミエリン鞘3,4,5、脂肪細胞6,7、および脂肪滴8,9,10などの生物学的組織における脂質富化成分のイメージングに広く使用されています。.誘導ラマンゲイン(SRG)または刺激ラマン損失(SRL)として取得された誘導ラマン散乱(SRS)信号はバックグラウンドフリーであり、自発的なラマン散乱と完全にスペクトル的に類似している11、12。さらに、SRLおよびSRGは分析物濃度に直線的に依存し、生化学成分の定量分析を可能にする9、11、13。二光子励起蛍光顕微鏡(TPEF)は、その固有の光学切片化能力、深い浸透深さ、および低い光毒性のために、in vivo生物学的イメージングに広く使用されてきました14,15,16。しかし、TPEFイメージングの性能は蛍光タグの特性に依存し、広帯域蛍光スペクトル8、17、18、19のために解決可能な色の数が制限されています。ラベルフリーSRSイメージングと蛍光ベースのTPEFイメージングは、2つの相補的なイメージングモダリティであり、それらの組み合わせは、組織の豊富な生物物理学的および生化学的情報を提供することができます。これら2つのイメージングモダリティは、どちらも非線形光学(NLO)プロセスに基づいており、1つの顕微鏡システムに簡単に統合できます。SRSイメージングとTPEFイメージングの組み合わせ、いわゆるデュアルモーダルイメージングは、細胞や組織の高次元イメージングとプロファイリングを可能にし、複雑な生物学的システムの包括的な理解を容易にします。具体的には、ピコ秒(ps)SRS顕微鏡は、フェムト秒(fs)SRS技術11と比較して高いスペクトル分解能で化学結合イメージングを達成することができ、生体組織、特に混雑した指紋領域20,21における複数の生化学的成分を区別することを可能にする。さらに、コヒーレントアンチストークス散乱(CARS)顕微鏡を統合した別の一般的に使用されるデュアルモーダルNLO顕微鏡システムと比較して、SRSはスペクトルおよび画像解釈、および検出感度の点でCARSよりも優れた性能を示しています11。SRS-TPEF顕微鏡は、カエノラブディティス・エレガンス9,22、アフリカツメガエル・ラエビス・オタマジャクシ脳5、マウス脳23,24、脊髄25,26、末梢神経27、脂肪組織7など、さまざまな生物系を研究するための強力なツールとして使用されてきました。
脊髄は脳とともに中枢神経系(CNS)を構成しています。生理学的および病理学的条件下でのCNSのインビボでの細胞活動を視覚化することは、CNS障害のメカニズムを理解し28,29,30および対応する治療法を開発するために重要である31,32,33。高速活動電位伝導のために軸索を包み込み、絶縁するミエリン鞘は、CNSの発達において重要な役割を果たしている。脱髄は、多発性硬化症などの白質障害の特徴として考えられています34。さらに、脊髄損傷後35、ミエリン破片はマクロファージの活性化を調節し、慢性炎症および二次損傷に寄与する36。したがって、生きたマウスモデルにおけるニューロンおよびグリア細胞と共にミエリン鞘のインビボイメージングは、CNS障害における動的プロセスを理解するのに非常に役立つ。
このプロトコルでは、自家製のTPEF-SRS顕微鏡の基本的なセットアップ手順を説明し、マウス脊髄のデュアルモーダル in vivo イメージング方法を紹介します。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、固有の分子振動に基づいて、その天然微小環境における生体組織の標識のないイメージングを可能にし、したがって、細胞内分解能での生物学的プロセスの in vivo 研究のための完璧なツールを提供する。2光子励起蛍光(TPEF)イメージングをSRS顕微鏡に統合することにより、組織のデュアルモーダル in vivo イメージングは、細胞代謝、免疫応答、組織リモデリングなどに関与する動的プロセスを理解するのに役立つ、複数の視点から重要な生化学的および生物物理学的情報を取得できます。このビデオプロトコルでは、TPEF-SRS顕微鏡システムのセットアップと、動物の脊髄の in vivo イメージング方法が導入されています。脊髄は、中枢神経系の一部として、脳と末梢神経系との間のコミュニケーションにおいて重要な役割を果たしている。リン脂質が豊富なミエリン鞘は、軸索を囲んで絶縁し、活動電位の塩分化伝導を可能にする。脊髄内のミエリン鞘の インビボ イメージングは、神経変性疾患および脊髄損傷の進行を研究するために重要である。このプロトコルはまた、高解像度の生物学的画像を取得するための動物調製および インビボ TPEF-SRSイメージング法についても記載しています。

脊髄軸索およびミエリン鞘のインビボデュアルモーダルイメージングは、後根神経節求心性ニューロンでEYFPを発現するThy1-YFPHトランスジェニックマウスを用いて実施される(図3)。これらの標識された求心性ニューロンは、末梢神経から脊髄に感覚情報を中継し、中央枝は脊髄背柱に位置する。TPEF-SRS顕微鏡では、ラベルフリーSRSイメージングにより密集分布ミエ?...

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In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

誘導ラマン散乱(SRS)顕微鏡は、特定の化学結合の固有の振動に基づいて生体分子の標識のないイメージングを可能にします。このプロトコルでは、生きたマウスの脊髄の細胞構造を視覚化するために、統合されたSRSおよび2光子蛍光顕微鏡の機器セットアップが記載されている。

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

細胞内分解能と化学的特異性を備えた生物学的組織のIn Vivoイメージングは、細胞代謝、免疫応答、および組織リモデリングに関与する動的プロセスを理解するための強力なツールです。2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせることで、生体組織の重要な生化学的および生物物理学的情報を細胞内分解能で複数の視点から取得できます。具体的には、このデュアルモーダル顕微鏡は、神経変性疾患および脊髄損傷の進行を研究するために、マウス脊髄における細胞動態および相互作用を画像化するために使用することができる。まず、キースイッチをスタンバイからオンの位置に切り替えてチタンサファイアレーザーの電源を入れ、レーザーがウォームアップするまで30分間待ちます。次に、OPOコントロールパネルのスタートボタンをクリックしてOPOの電源を入れ、レーザーがウォームアップするまで20分間待ちます。ピコ秒レーザーが暖まったら、ストークスビームのパワーを約20ミリワットに下げ、ストークスビーム用のレーザーシャッターを開き、OPO出力に高速フォトディテクタを配置してビームを検出することで、ストークスビームの変調深さを確認します。次に、BNCコネクタ付きの同軸ケーブルを用いて、光検出器の出力ポートをオシロスコープの入力ポートに接続し、レーザパルスを監視します。次に、OPO制御ソフトウェアでEOM制御ウィンドウを開き、オシロスコープに示されているパルス強度図に従ってEOM電力と位相を調整して、20メガヘルツで最大変調深度を達成します。OPO制御ソフトウェアで、ストークス出力を停止しながらポンプレーザーシャッターを開きます。次に、信号の設定ボックスをクリックしてポンプビームの波長を796ナノメートルに設定し、OPO電源ボックスを設定し、20を入力して光アライメントの電力を最小に設定します。次に、偏光ビームスプリッタの後ろにアライメント板P1を約10センチ、P1の後ろのプレートP2を光路上約30センチで配置する。ピコ秒レーザー光用の顕微鏡シャッターを開けた後、ミラーM1を調整して、ピコ秒レーザー光の中心をP1の貫通孔に位置させます。赤外線スコープを使用して、ミラーM1を調整するときにP1のビームスポットの位置を観察します。同様に、ミラーM2を調整して、ピコ秒レーザービームの中心をP2の貫通孔に位置させる。赤外線スコープを使用して、ミラーM2を調整するときにP2のビームスポットの位置を観察します。ピコ秒ビーム中心が両アライメントプレートの貫通孔に位置するまでミラーを調整した後、顕微鏡制御ソフトウェアでピコ秒ビームのシャッターを閉じる。次に、フェムト秒レーザー光用の顕微鏡シャッターを開きます。ミラーM3を調整してP1の貫通穴にフェムト秒レーザー光スポット中心を配置し、次にミラーM4を調整してフェムト秒レーザー光スポット中心をP2の貫通穴に配置します。フェムト秒レーザー光の中心が2枚の配向板の貫通孔に位置するまでミラーを調整した後、フェムト秒ビーム用の顕微鏡シャッターを閉じる。次に、対物レンズの位置にカメラを配置して2つのビームスポットの位置を視覚化し、カメラ画面上のポンプビームの位置を基準としてマークします。次に、レンズL3の前にアライメント板P0を配置し、ストークスビーム中心がレーザ出力ポートにおけるアライメントプレートの貫通孔を通過するように六角キーを用いて光学ミラー1を調整する。赤外線スコープを使用して、調整中のP0でのビームスポットの位置を確認します。次に、アライメントプレートP0を取り外し、六角キーを使用して光学ミラー2を調整し、ストークスビームの中心がカメラ上のポンプビームの基準マークと共局在するようにする。ストークスビームがP0とカメラ面の両方でポンプビームと厳密に重なるまで、ミラーを調整し続けます。ロックインアンプ制御ソフトウェアを開き、ポンプレーザーの波長を796ナノメートルに設定し、ポンプとストークスビームのパワーをサンプルの15ミリワットと25ミリワットに対応する50ミリワットと70ミリワットに設定します。次に、ロックインアンプの位相最適化にオリーブオイルを使用します。オリーブオイルは、信号の後方散乱またはEPI-SRS検出を強化するために、底部に取り付けられたティッシュペーパーでスライドに密封されます。オリーブオイルサンプルをステージに置き、サンプル上の25X対物レンズの焦点を調整します。顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、テキスト原稿に記載されているようにイメージングパラメータを設定します。次にロックインアンプ制御ソフトを用いて、時定数値を10マイクロ秒に設定する。次に、レーザービームをサンプル上でスキャンし、SRS信号強度が最大に達するまで22.5度のステップサイズで位相をチューニングします。次に、レーザーシャッターを閉じた状態でサンプルをスキャンし、平均SRS信号がゼロに近づくまでオフセット値を1ミリボルトのステップサイズで調整します。次に、OPO制御ソフトウェアで遅延マネージャダイアログを開き、オリーブオイルをスキャンし、オリーブオイルSRS信号が最大に達するまで遅延ステージを調整します。次に、スキャンを停止し、遅延マネージャダイアログのデータの追加ボタンをクリックして、現在の遅延データを記録します。さまざまな化学サンプルをイメージングして、異なるラマンシフトで遅延データを同様に集録した後、遅延マネージャダイアログで5番目の順序でデータ適合を選択し、現在のデータポイントを5次ポリノミック関数で適合させます。次に、カスタムとしての使用ボタンをクリックし、チェックボックスをオンにして、適合データを適用します。遅延段は、適合された遅延曲線に従って異なる波長で自動調整されます。in vivoイメージングの場合は、マウスを安定化ステージに固定し、脊髄を露出させ、生理食塩水に浸します。次に、TPEF-SRS顕微鏡の下の5軸ステージに安定化ステージを取り付けます。次に、マウスヘッドを2つのヘッドバーで固定し、保持プレートを下げて、呼吸中の胸の動きに十分なスペースを確保し、モーションアーチファクトを軽減します。次に、Z並進段階を調整して、脊髄血管系のブライトフィールド画像が10倍の対物レンズの下で観察できるようになるまで焦点を調整します。5軸段階の2軸並進段階を同調させることによって視野の中心にある脊髄背静脈を見つける。次に、5軸ステージのロール角とピッチ角を調整し、ブライトフィールド画像に基づいて対物軸に垂直な脊髄背面を調整します。次に、TPEF-SRSイメージング用の10Xを25X水浸漬対物レンズに置き換えます。SRSイメージングの場合は、電動フリッパーに接続されているスイッチボタンを押して、対物レンズの上にある偏光ビームスプリッターを選択します。TPEFイメージングでは、電動フリッパーに接続されているスイッチボタンを押して、対物レンズの上にあるダイクロイックミラーD2を選択します。最後に、テキスト原稿の説明に従ってイメージングパラメータを設定し、サンプルのスキャンを開始します。マウス脊髄内のまばらに標識されたYFP軸索およびミエリン鞘のインビボデュアルモーダルイメージングは、軸索がミエリン鞘の厚い層によって密接に包まれていることを明らかにした。TPEF-SRS脊髄画像に見られるように、ランヴィエの節は軸索径が小さく、腋窩は細胞外マトリックスに直接露出している。蛍光およびSRSイメージング用の新しいプローブと組み合わせることで、2光子励起蛍光SRS顕微鏡は、さまざまな生体分子の構造的および機能的イメージングを同時に実現し、複雑な生物学的プロセスの理解を容易にします。

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JoVE Journal

Bioengineering

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