Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong através de subsídios 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, a Comissão de Inovação e Tecnologia (ITCPD/17-9), a Área de Excelência do Comitê de Subsídios Universitários (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) e a Universidade de Ciência & Tecnologia de Hong Kong (HKUST) através da concessão RPC10EG33.

Todos os procedimentos animais realizados neste trabalho são realizados de acordo com as diretrizes do Laboratório de Instalações Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong (HKUST) e aprovados pelo Comitê de Ética Animal do HKUST. O treinamento de segurança para manuseio a laser é necessário para configurar e operar o microscópio TPEF-SRS. Use sempre óculos de segurança a laser com alcance de comprimento de onda apropriado ao lidar com laser.
1. Configuraç...

Neste protocolo, a configuração básica do microscópio TPEF-SRS é descrita em detalhes. Para a imagem srs, os feixes de bomba e Stokes são temporalmente e espacialmente sobrepostos dentro do OPO. No entanto, essa sobreposição pode ser interrompida após passar pelo sistema de microscópio. Portanto, tanto a otimização espacial quanto temporal da colocalização das vigas da bomba e dos feixes de Stokes é necessária e fundamental para alcançar a imagem ótima do SRS. O atraso temporal entre a bomba e o feixe ...

A microscopia raman1,2 está emergindo como um poderoso método livre de rótulos para imagem de tecidos biológicos com base nas frequências características de várias ligações químicas em biomoléculas. Devido à sua capacidade de imagem não invasiva e bem adaptativa, a microscopia de Raman tem sido amplamente utilizada para imagens de componentes enriquecidos com lipídios em tecidos biológicos como a bainha de mielina3,4,5, adipócitos6,7, e gotículas lipídicas8,9,10 . O sinal de dispersão de Raman estimulado (SRS) adquirido como ganho de Raman estimulado (SRG) ou perda de Raman estimulado (SRL) é livre de fundo, mostrando perfeita semelhança espectral com Raman espontâneo espalhando11,12. Além disso, o SRL e o SRG dependem linearmente da concentração de analitos, permitindo a análise quantitativa dos componentes bioquímicos9,11,13. A microscopia de fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) tem sido amplamente utilizada para imagens biológicas in vivo devido à sua capacidade de seção óptica inerente, profundidade de penetração profunda e baixa fototoxicidade14,15,16. No entanto, o desempenho da imagem TPEF depende das características das tags fluorescentes, e o número de cores solucionáveis é limitado devido ao espectro de fluorescência de banda larga8,17,18,19. A imagem TPEF baseada em imagens TPEF baseadas em ressonância magnética e fluorescência sem rótulos são duas modalidades de imagem complementares, e sua combinação pode fornecer informações biofísicas e bioquímicas abundantes dos tecidos. Essas duas modalidades de imagem são baseadas nos processos ópticos não lineares (NLO), o que permite uma integração simples em um sistema de microscópio. A combinação da imagem SRS e TPEF, a chamada imagem dual-modal, permite imagens de alta dimensão e perfil de células e tecidos, facilitando uma compreensão abrangente de sistemas biológicos complexos. Especificamente, a microscopia SRS picosecond (ps) pode alcançar imagens de ligação química com alta resolução espectral em comparação com a técnica srs femtosegundo (fs)11, permitindo diferenciar múltiplos componentes bioquímicos em tecido biológico, especialmente na região de impressão digital lotada20,21. Além disso, em comparação com outro sistema de microscópio NLO dual-modal comumente usado com integração do microscópio de dispersão anti-Stokes coerente (CARS), o SRS mostra desempenho superior aos CARS em termos de interpretação espectral e de imagem, bem como sensibilidade de detecção11. O microscópio SRS-TPEF tem sido usado como uma poderosa ferramenta para estudar vários sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cérebro de rato23,24, medula espinhal25,26, nervo periférico27, e tecido adiepos7, etc.
A medula espinhal juntamente com o cérebro compõe o sistema nervoso central (SNC). Visualizar atividades celulares no IN VIVO em condições fisiológicas e patológicas é fundamental para a compreensão dos mecanismos dos transtornos do CNS28,29,30 e para o desenvolvimento de terapias correspondentes31,32,33. A baia de mielina, que envolve e isola axônios para condução potencial de ação de alta velocidade, desempenha um papel significativo no desenvolvimento do CNS. A demyelination é considerada uma marca registrada em distúrbios da matéria branca, como a esclerose múltipla34. Além disso, após lesão na medula espinhal35, os detritos de mielina podem modular a ativação do macrófago, contribuindo para inflamação crônica e lesões secundárias36. Portanto, a imagem in vivo da baialina de mielina juntamente com neurônios e células gliais em modelos de camundongos vivos é de grande ajuda para entender os processos dinâmicos nos distúrbios do CNS.
Neste protocolo, são descritos os procedimentos fundamentais de configuração de um microscópio TPEF-SRS construído em casa e introduzidos os métodos de imagem in vivo dual-modal para medula espinhal do rato.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite a imagem livre de rótulos dos tecidos biológicos em seu microambiente natural com base na vibração molecular intrínseca, fornecendo assim uma ferramenta perfeita para o estudo in vivo de processos biológicos em resolução subcelular. Ao integrar a fluorescência excitada de dois fótons (TPEF) no microscópio SRS, a imagem em si de tecidos pode adquirir informações bioquímicas e biofísicas críticas de múltiplas perspectivas que ajudam a entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual, etc. Neste protocolo de vídeo, é introduzida a configuração de um sistema de microscópio TPEF-SRS, bem como o método de imagem in vivo da medula espinhal animal. A medula espinhal, como parte do sistema nervoso central, desempenha um papel crítico na comunicação entre o cérebro e o sistema nervoso periférico. A baia de mielina, abundante em fosfolipídios, circunda e isola o axônio para permitir a condução saltatória de potenciais de ação. A imagem in vivo de baias de mielina na medula espinhal é importante para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular. O protocolo também descreve a preparação animal e métodos de imagem in vivo TPEF-SRS para adquirir imagens biológicas de alta resolução.

A imagem dual-modal in vivo de axônios espinhais, bem como baiatas de mielina é conduzida usando os camundongos transgênicos Thy1-YFPH, que expressam EYFP em neurônios aferentes neurônios aferentes de gânglios de raiz dorsal (Figura 3). Estes neurônios rotulados retransmitem as informações sensoriais do nervo periférico para a medula espinhal, com o ramo central localizado na coluna dorsal da medula espinhal. Com o microscópio TPEF-SRS, a baátima de mielina densamente di...

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In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) permite imagens livres de rótulos de biomoléculas com base em sua vibração intrínseca de ligações químicas específicas. Neste protocolo, a configuração instrumental de um microscópio de srs e fluorescência de dois fótons integrado é descrita para visualizar estruturas celulares na medula espinhal de camundongos vivos.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

In Vivo, a imagem de tecidos biológicos com resolução subcelular e especificidade química é uma poderosa ferramenta para entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual. Com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão raman estimulada, informações bioquímicas críticas e biofísicas de tecidos biológicos podem ser adquiridas a partir de múltiplas perspectivas com resolução subcelular. Especificamente, essa microscopia dual-modal pode ser usada para imagem da dinâmica celular e interações na medula espinhal do camundongo para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular.Para começar, ligue o laser de safira de titânio alternando o interruptor da chave da posição de espera para a posição e espere 30 minutos para o laser aquecer. Em seguida, ligue o OPO clicando no botão iniciar no painel de controle OPO e espere 20 minutos para que o laser aqueça. Após o laser picosegundo aquecido, verifique a profundidade de modulação do feixe de Stokes baixando a potência do feixe de Stokes para aproximadamente 20 miliwatts, abrindo o obturador laser para o feixe de Stokes e colocando um detector de fotos de alta velocidade na saída OPO para detectar o feixe.Em seguida, conecte a porta de saída do fotodetetor à porta de entrada de um osciloscópio usando um cabo coaxial com um conector BNC para monitorar o pulso laser. Em seguida, abra a janela de controle EOM no software de controle OPO e ajuste a potência e a fase do EOM de acordo com o diagrama de intensidade de pulso mostrado no osciloscópio para alcançar a profundidade máxima de modulação em 20 mega-hertz. No software de controle OPO, abra o obturador a laser da bomba enquanto para a saída de Stokes.Em seguida, clique na caixa de sinal de configuração para definir o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nanômetros, em seguida, clique na caixa de alimentação OPO definida e digite 20 para definir sua potência ao mínimo para alinhamento óptico. Em seguida, coloque a placa de alinhamento P1 atrás do divisor de feixe polarizador em cerca de 10 centímetros e coloque a placa P2 atrás de P1 a cerca de 30 centímetros no caminho óptico. Depois de abrir o obturador de microscópio para o feixe laser picosegundo, ajuste o espelho M1 para localizar o centro de raios laser picosegundo no buraco de P1. Use um escopo infravermelho para observar a posição do ponto de feixe em P1 ao ajustar o espelho M1. Da mesma forma, ajuste o espelho M2 para localizar o centro de raios laser picosegundo no buraco de P2. Use o escopo infravermelho para observar a posição do ponto de feixe em P2 ao ajustar o espelho M2. Depois de ajustar os espelhos até que o centro de feixe picosegundo se localize no orifício de ambas as placas de alinhamento, feche o obturador do feixe picosegundo no software de controle de microscópio.Em seguida, abra o obturador de microscópio para o raio laser femtosegundo. Ajuste o espelho M3 para localizar o centro de ponto do feixe laser femtosegundo no buraco de P1, em seguida, ajuste o espelho M4 para localizar o centro de ponto do feixe laser femtosegundo no buraco de P2. Depois de ajustar os espelhos até que o centro de raios laser femtosegundo se localize nos orifícios das duas placas de alinhamento, feche o obturador de microscópio para o feixe femtosegundo. Em seguida, coloque uma câmera na posição do objetivo de visualizar a localização dos dois pontos de viga e marcar a posição do feixe da bomba na tela da câmera como referência.Em seguida, coloque uma placa de alinhamento P0 antes da lente L3 e ajuste o espelho óptico usando uma tecla hexa, de modo que o centro de feixe stokes passe o orifício da placa de alinhamento na porta de saída laser. Use o escopo infravermelho para confirmar a posição do ponto de feixe em P0 durante o ajuste. Em seguida, remova a placa de alinhamento P0 e use a tecla hexax para ajustar o espelho óptico dois para que o centro do feixe stokes co-localize com a marca de referência do feixe de bomba na câmera.Continue ajustando os espelhos até que o feixe de Stokes se sobreponha estritamente com o feixe da bomba tanto em P0 quanto nos aviões da câmera. Abra o software de controle do amplificador de travamento e defina o comprimento de onda do laser da bomba para 796 nanômetros e a potência da bomba e do feixe stokes para 50 e 70 miliwatts correspondentes a 15 e 25 miliwatts na amostra, respectivamente. Em seguida, use azeite para otimização de fase do amplificador de travamento.O azeite é selado em um slide com papel de tecido preso ao fundo para melhorar a dispersão de sinal de volta ou detecção de EPI-SRS. Coloque a amostra de azeite no palco e ajuste o foco do objetivo 25X na amostra. Usando o software de controle de microscópio, defina os parâmetros de imagem mencionados no manuscrito do texto.Em seguida, usando o software de controle do amplificador lock-in, defina o valor constante de tempo para 10 microsegundos. Em seguida, escaneie o raio laser sobre a amostra, afinando a fase com um tamanho de passo de 22,5 graus até que a intensidade do sinal SRS atinja o máximo. Em seguida, escaneie a amostra com o obturador a laser fechado, ajustando o valor de deslocamento com um tamanho de passo de um milívolo até que o sinal srs médio esteja perto de zero.Em seguida, abra o diálogo do gerenciador de atrasos no software de controle OPO e escaneie o azeite de oliva, afinando a etapa de atraso até que o sinal SRS de azeite atinja seu máximo. Em seguida, pare de digitalizar e clique no botão adicionar dados na caixa de diálogo do gerenciador de atraso para registrar os dados de atraso atuais. Depois de adquirir dados de atraso em diferentes mudanças raman por imagem várias amostras químicas, selecione os dados que se encaixam na ordem cinco na caixa de diálogo do gerente de atraso para se encaixar nos pontos de dados atuais com a função polinómica de quinta ordem.Em seguida, aplique os dados instalados clicando no uso como botão personalizado e verificando a caixa de seleção. O estágio de atraso é ajustado automaticamente em diferentes comprimentos de onda de acordo com a curva de atraso instalada. Para imagens in vivo, fixar o mouse em estágio de estabilização com sua medula espinhal exposta e imersa em soro fisiológico.Agora monte o estágio de estabilização em um estágio de cinco eixos abaixo do microscópio TPEF-SRS. Em seguida, fixe a cabeça do mouse com duas barras de cabeça e baixe a placa de retenção para oferecer espaço suficiente para o movimento do peito durante a respiração, aliviando artefatos de movimento. Em seguida, ajuste o estágio Z-translacional para ajustar o foco até que a imagem brightfield da vasculatura da medula espinhal possa ser observada sob um objetivo de 10X.Localize a veia dorsal da medula espinhal no centro do campo de visão, afinando o estágio translacional de dois eixos do estágio de cinco eixos. Em seguida, sintonize os ângulos de rolo e tom do estágio de cinco eixos para ajustar a superfície dorsal da medula espinhal perpendicular ao eixo objetivo com base na imagem brightfield. Em seguida, substitua o 10X por um objetivo de imersão de água de 25X para imagens TPEF-SRS.Para a imagem SRS, selecione o divisor de feixes polarizadores acima do objetivo pressionando o botão de interruptor conectado à nadadeira motorizada. Para a imagem TPEF, selecione o espelho dicroico D2 acima do objetivo pressionando o botão de interruptor conectado à nadadeira motorizada. Por fim, defina os parâmetros de imagem conforme descrito no manuscrito do texto e comece a digitalizar a amostra.Imagens de dois modais in vivo de axônios YFP e baás de mielina na medula espinhal do rato revelaram que os axônios são intimamente envoltos por uma camada grossa de baás de mielina. Como pode ser visto na imagem da medula espinhal TPEF-SRS, os nós de Ranvier diminuíram o diâmetro axonal e o axilemma está diretamente exposto à matriz extracelular. Combinado com novas sondas para fluorescência e ressonância magnética de dois fótons exultantes da microscopia SRS pode alcançar imagens estruturais e funcionais simultâneas de várias biomoléculas, facilitando nossa compreensão de processos biológicos complexos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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