Name: in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma, Hong Kong Araştırma Hibeleri Konseyi tarafından 16103215, 16148816, 16102518 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu (ITCPD/17-9), Üniversite Hibeleri Komitesi Mükemmellik Programı Alanı (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) ve Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (HKUST) tarafından RPC10EG33 hibesi yoluyla desteklenmiştir.

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi (HKUST) Laboratuvar Hayvanları Tesisi'nin yönergelerine göre yürütülmekte ve HKUST Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır. TPEF-SRS mikroskobunun kurulması ve çalıştırılması için lazer kullanımı için güvenlik eğitimi gereklidir. Lazerle çalışırken daima uygun dalga boyu aralığına sahip lazer güvenlik gözlükleri kullanın.
1. TPEF-SRS mikroskob...

Bu protokolde, TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulumu ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. SRS görüntüleme için, pompa ve Stokes kirişleri OPO'nun içinde geçici ve uzamsal olarak üst üste biner. Bununla birlikte, bu örtüşme mikroskop sisteminden geçtikten sonra bozulabilir. Bu nedenle, pompanın ve Stokes ışınlarının kolokalizasyonunun hem mekansal hem de zamansal optimizasyonu, optimum SRS görüntülemeyi elde etmek için gerekli ve kritiktir. Pompa ve Stokes ışını arasındaki zamansal gecikme,...

Raman mikroskobu1,2, biyomoleküllerdeki çeşitli kimyasal bağların karakteristik frekanslarına dayanarak biyolojik dokuları görüntülemek için güçlü bir etiketsiz yöntem olarak ortaya çıkmaktadır. Non-invaziv ve iyi uyarlanabilir görüntüleme kabiliyeti sayesinde Raman mikroskopisi, miyelin kılıfı3,4,5, adipositler6,7 ve lipit damlacıkları gibi biyolojik dokulardaki lipitle zenginleştirilmiş bileşenleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılmaktadır8,9,10 . Uyarılmış Raman kazancı (SRG) veya uyarılmış Raman kaybı (SRL) olarak elde edilen uyarılmış Raman saçılması (SRS) sinyali arka plansızdır ve spontan Raman saçılmasına mükemmel spektral benzerlik gösterir11,12. Ek olarak, SRL ve SRG, analit konsantrasyonuna doğrusal olarak bağımlıdır ve biyokimyasal bileşenlerin kantitatif analizine izin verir9,11,13. İki foton uyarılmış floresan mikroskobu (TPEF), doğal optik kesitleme yeteneği, derin penetrasyon derinliği ve düşük fototoksisitesi nedeniyle in vivo biyolojik görüntüleme için yaygın olarak kullanılmaktadır14,15,16. Bununla birlikte, TPEF görüntülemenin performansı floresan etiketlerin özelliklerine bağlıdır ve geniş bant floresan spektrumları nedeniyle çözülebilir renklerin sayısı sınırlıdır8,17,18,19. Etiketsiz SRS görüntüleme ve floresan bazlı TPEF görüntüleme iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemidir ve bunların kombinasyonu dokuların bol miktarda biyofiziksel ve biyokimyasal bilgisini sağlayabilir. Bu iki görüntüleme yönteminin her ikisi de, tek bir mikroskop sistemine basit entegrasyona izin veren doğrusal olmayan optik (NLO) işlemlere dayanmaktadır. SRS ve TPEF görüntülemenin kombinasyonu, sözde çift modal görüntüleme, hücrelerin ve dokuların yüksek boyutlu görüntülenmesini ve profillenmesini sağlayarak karmaşık biyolojik sistemlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırır. Spesifik olarak, pikosaniye (ps) SRS mikroskopisi, femtosaniye (fs) SRS tekniğine11 kıyasla yüksek spektral çözünürlükte kimyasal bağ görüntülemesi elde edebilir ve biyolojik dokuda, özellikle kalabalık parmak izi bölgesinde20,21 çoklu biyokimyasal bileşenleri ayırt etmeyi sağlar. Ek olarak, tutarlı anti-Stokes saçılma (CARS) mikroskobunun entegrasyonu ile yaygın olarak kullanılan bir başka çift modlu NLO mikroskop sistemi ile karşılaştırıldığında, SRS, spektral ve görüntü yorumlamanın yanı sıra algılama hassasiyeti açısından CARS'a üstün performans göstermektedir11. SRS-TPEF mikroskobu, Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis kurbağa yavrusu beyni5, fare beyni23,24, omurilik25,26, periferik sinir27 ve yağ dokusu7 gibi çeşitli biyolojik sistemleri incelemek için güçlü bir araç olarak kullanılmıştır.
Omurilik, beyin ile birlikte merkezi sinir sistemini (CNS) oluşturur. Fizyolojik ve patolojik koşullar altında CNS'deki hücresel aktiviteleri in vivo olarak görselleştirmek, CNS bozukluklarının mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir28,29,30 ve buna karşılık gelen tedavilerin geliştirilmesi31,32,33. Yüksek hızlı aksiyon potansiyeli iletimi için aksonları saran ve yalıtan miyelin kılıf, CNS'nin gelişiminde önemli bir rol oynar. Demiyelinasyon, multipl skleroz gibi beyaz cevher bozukluklarında bir ayırt edici özellik olarak düşünülmektedir34. Ek olarak, omurilik yaralanmasından35 sonra, miyelin kalıntıları makrofaj aktivasyonunu modüle ederek kronik inflamasyona ve ikincil yaralanmaya katkıda bulunabilir36. Bu nedenle, canlı fare modellerinde nöronlar ve glial hücrelerle birlikte miyelin kılıfın in vivo görüntülenmesi, CNS bozukluklarındaki dinamik süreçleri anlamada büyük yardımcı olmaktadır.
Bu protokolde, ev yapımı bir TPEF-SRS mikroskobunun temel kurulum prosedürleri tanımlanmış ve fare omuriliği için çift modlu in vivo görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#2 Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11223-20</td>
			<td>For laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 10X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25X objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XLPLN25XSVMP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burn cream</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>&#945;6300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Stanford research</td>
			<td>SR570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current photomultiplier modules</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11461-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2 665 nm long-pass dichroic mirror</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF665-Di02-25x36</td>
			<td>For directing epi-fluorescence signal to the detection module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D3 700 nm short-pass dichroic mirror</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>69-206</td>
			<td>For separating SRS from TPEF detection path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilating cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 975 nm short-pass filter</td>
			<td>Edmund</td>
			<td>86-108</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FS1 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-850/310</td>
			<td>For blocking stokes beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-525/50</td>
			<td>For selecting YFP signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fs2 Shortpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-715/SP-25</td>
			<td>For blocking fs excitation laser beam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Half-wave plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SAHWP05M-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed photodetector</td>
			<td>MenloSystems</td>
			<td>FPD 310-F</td>
			<td>For checking Stokes beam modulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR Scope</td>
			<td>FJW</td>
			<td>FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CPA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L10</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4052-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA1422-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L3</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-050-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L4</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-060-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>f=100 mm, AB coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L8</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LA4874-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L9</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-035-B-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lock-in amplifier</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized flipper</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MFF101/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifunctional acquisition card</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>APE</td>
			<td></td>
			<td>For detecting SRS signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picosecond laser source</td>
			<td>APE</td>
			<td>picoEmerald</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polarizing beam splitter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CCM1-PBS252/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power meter</td>
			<td>Newport</td>
			<td>843-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan lens L5</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SL50-CLS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning mirror</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>6215H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone gel</td>
			<td>World Precision Inc.</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:sapphire fs laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Chameleon Ultra II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube lens L6</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TTL200-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated raman scattering microscopy

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyolojik dokuların doğal mikro ortamında içsel moleküler titreşime dayalı etiketsiz görüntülenmesini sağlar, böylece hücresel altı çözünürlükte biyolojik süreçlerin in vivo çalışması için mükemmel bir araç sağlar. İki foton uyarılmış floresan (TPEF) görüntülemeyi SRS mikroskobuna entegre ederek, dokuların çift modal in vivo görüntülemesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamaya yardımcı olan çoklu perspektiflerden kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgiler elde edebilir. Bu video protokolünde, bir TPEF-SRS mikroskop sisteminin kurulması ve hayvan omuriliğinin in vivo görüntüleme yöntemi tanıtılmaktadır. Omurilik, merkezi sinir sisteminin bir parçası olarak, beyin ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişimde kritik bir rol oynar. Fosfolipitlerde bol miktarda bulunan miyelin kılıfı, aksiyon potansiyellerinin tuzlayıcı iletimine izin vermek için aksonu çevreler ve yalıtır. Omurilikteki miyelin kılıfların in vivo görüntülenmesi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik hasarının ilerlemesini incelemek için önemlidir. Protokol ayrıca hayvan hazırlama ve yüksek çözünürlüklü biyolojik görüntüler elde etmek için in vivo TPEF-SRS görüntüleme yöntemlerini de tanımlamaktadır.

Spinal aksonların ve miyelin kılıflarının in vivo dual-modal görüntülemesi, dorsal kök gangliyon afferent nöronlarında EYFP'yi eksprese eden Thy1-YFPH transgenik fareler kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 3). Bu etiketli afferent nöronlar, duyusal bilgiyi periferik sinirden omuriliğe iletir, merkezi dal omurilik dorsal kolonunda bulunur. TPEF-SRS mikroskobu ile, yoğun olarak dağılmış miyelin kılıfı, etiketsiz SRS görüntüleme kullanılarak net bir şekil...

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy at JoVE.com

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Hücre altı çözünürlük ve kimyasal özgüllük ile biyolojik dokuların in Vivo görüntülenmesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamak için güçlü bir araçtır. Kombine iki foton floresansı ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile, biyolojik dokuların kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgileri, hücre altı çözünürlükle çoklu perspektiflerden elde edilebilir. Spesifik olarak, bu çift modlu mikroskopi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik yaralanmasının ilerlemesini incelemek için fare omuriliğindeki hücresel dinamikleri ve etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilir.Başlamak için, tuş düğmesini bekleme modundan açık konuma getirerek titanyum safir lazeri açın ve lazerin ısınması için 30 dakika bekleyin. Ardından, OPO kontrol panelindeki başlat düğmesine tıklayarak OPO'yu açın ve lazerin ısınması için 20 dakika bekleyin. Pikosaniye lazer ısındıktan sonra, Stokes ışınının gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a düşürerek, Stokes ışını için lazer deklanşörünü açarak ve ışını algılamak için OPO çıkışına yüksek hızlı bir fotoğraf dedektörü yerleştirerek Stokes ışınının modülasyon derinliğini kontrol edin.Ardından, lazer darbesini izlemek için BNC konektörlü bir koaksiyel kablo kullanarak fotodetektörün çıkış portunu bir osiloskopun giriş portuna bağlayın. Ardından OPO kontrol yazılımında EOM kontrol penceresini açın ve 20 megahertz'de maksimum modülasyon derinliği elde etmek için EOM gücünü ve fazını osiloskopta gösterilen darbe yoğunluğu diyagramına göre ayarlayın. OPO kontrol yazılımında, Stokes çıkışını durdururken pompa lazer deklanşörünü açın.Ardından, pompa ışınının dalga boyunu 796 nanometreye ayarlamak için sinyal kutusunu ayarlayın, ardından OPO güç kutusunu ayarlayın ve gücünü optik hizalama için minimuma ayarlamak üzere 20 girin. Daha sonra, P1 hizalama plakasını polarize edici ışın ayırıcının arkasına yaklaşık 10 santimetreye yerleştirin ve P2 plakasını optik yolda yaklaşık 30 santimetrede P1'in arkasına yerleştirin. Pikosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açtıktan sonra, P1'in içinden geçen delikteki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M1'i ayarlayın. M1 aynasını ayarlarken P1'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi bir kapsam kullanın. Benzer şekilde, P2'nin geçiş deliğindeki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M2'yi ayarlayın. M2 aynasını ayarlarken P2'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi kapsamı kullanın. Pikosaniye ışın merkezi her iki hizalama plakasının içinden geçen deliğe yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, mikroskop kontrol yazılımındaki pikosaniye ışınının deklanşörünü kapatın.Ardından, femtosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açın. P1'in geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M3'ü ayarlayın, ardından P2'nin geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M4'ü ayarlayın. Femtosaniye lazer ışını merkezi iki hizalama plakasının içinden deliklere yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, femtosaniye ışını için mikroskop deklanşörünü kapatın. Ardından, iki ışın noktasının konumunu görselleştirmek ve pompa ışınının kamera ekranındaki konumunu referans olarak işaretlemek için hedefin konumuna bir kamera yerleştirin.Ardından, L3 lensinin önüne bir P0 hizalama plakası yerleştirin ve optik aynayı bir altıgen anahtar kullanarak ayarlayın, böylece Stokes ışın merkezi, lazer çıkış portundaki hizalama plakasının içinden geçen delikten geçer. Ayarlama sırasında P0'daki ışın noktasının konumunu onaylamak için kızılötesi kapsamı kullanın. Ardından, P0 hizalama plakasını çıkarın ve optik aynayı iki olarak ayarlamak için altıgen tuşunu kullanın, böylece Stokes ışınının merkezi, kamera üzerindeki pompa ışınının referans işaretiyle birlikte lokalize olur.Stokes ışını hem P0 hem de kamera düzlemlerindeki pompa ışını ile kesinlikle örtüşene kadar aynaları ayarlamaya devam edin. Kilitli amplifikatör kontrol yazılımını açın ve pompa lazerinin dalga boyunu 796 nanometreye ve pompanın ve Stokes ışınının gücünü, numune üzerinde sırasıyla 15 ve 25 miliwatt'a karşılık gelen 50 ve 70 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra kilitleme amplifikatörü faz optimizasyonu için zeytinyağı kullanın.Zeytinyağı, sinyal geri saçılımını veya EPI-SRS tespitini arttırmak için tabana tutturulmuş kağıt mendil ile bir slaytta kapatılır. Zeytinyağı örneğini sahneye yerleştirin ve 25X hedefinin odağını numuneye ayarlayın. Mikroskop kontrol yazılımını kullanarak, görüntüleme parametrelerini metin yazısında belirtildiği gibi ayarlayın.Ardından, kilitli amplifikatör kontrol yazılımını kullanarak, zaman sabiti değerini 10 mikrosaniyeye ayarlayın. Daha sonra, lazer ışınını numune üzerinde tarayın ve SRS sinyal yoğunluğu maksimuma ulaşana kadar fazı 22,5 derecelik bir adım boyutuyla ayarlayın. Ardından, lazer deklanşörü kapalıyken numuneyi tarayın ve ortalama SRS sinyali sıfıra yakın olana kadar ofset değerini bir milivoltluk bir adım boyutuyla ayarlayın.Ardından, OPO kontrol yazılımında gecikme yöneticisi iletişim kutusunu açın ve zeytinyağını tarayın, zeytinyağı SRS sinyali maksimuma ulaşana kadar gecikme aşamasını ayarlayın. Ardından taramayı durdurun ve geçerli gecikme verilerini kaydetmek için gecikme yöneticisi iletişim kutusundaki veri ekle düğmesine tıklayın. Çeşitli kimyasal örnekleri görüntüleyerek farklı Raman kaymalarında benzer şekilde gecikme verilerini elde ettikten sonra, mevcut veri noktalarını beşinci dereceden polinom fonksiyonuna uydurmak için gecikme yöneticisi iletişim kutusunda beşinci sıraya uygun verileri seçin.Ardından, özel olarak kullan düğmesine tıklayarak ve onay kutusunu işaretleyerek takılan verileri uygulayın. Gecikme aşaması, takılan gecikme eğrisine göre farklı dalga boylarında otomatik olarak ayarlanır. İn vivo görüntüleme için, fareyi omuriliği açıkta ve saline batırılmış halde stabilizasyon aşamasına sabitleyin.Şimdi stabilizasyon aşamasını TPEF-SRS mikroskobunun altındaki beş eksenli bir aşamaya monte edin. Ardından fare kafasını iki kafa çubuğuyla sabitleyin ve nefes alma sırasında göğüs hareketi için yeterli alan sağlamak için tutma plakasını indirin ve hareket artefaktlarını hafifletin. Daha sonra, omurilik vaskülatürünün Brightfield görüntüsü 10X hedefi altında gözlemlenene kadar odağı ayarlamak için Z-translasyonel aşamasını ayarlayın.Beş eksenli aşamanın iki eksenli translasyonel aşamasını ayarlayarak omurilik dorsal venini görüş alanının merkezine yerleştirin. Ardından, omurilik dorsal yüzeyini Brightfield görüntüsüne göre objektif eksene dik olarak ayarlamak için beş eksenli aşamanın rulo ve perde açılarını ayarlayın. Ardından TPEF-SRS görüntüleme için 10X'i 25X suya daldırma hedefiyle değiştirin.SRS görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki polarize edici ışın ayırıcıyı seçin. TPEF görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki dikroik ayna D2'yi seçin. Son olarak, görüntüleme parametrelerini metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın ve örneği taramaya başlayın.Fare omuriliğindeki seyrek etiketli YFP aksonlarının ve miyelin kılıflarının in vivo dual-modal görüntülenmesi, aksonların kalın bir miyelin kılıf tabakası ile yakından sarıldığını ortaya koymuştur. TPEF-SRS omurilik görüntüsünde görülebileceği gibi, Ranvier'in düğümleri aksonal çapı azalmıştır ve aksilemma doğrudan hücre dışı matrise maruz kalmıştır. Floresan ve SRS görüntüleme için yeni problar ile birleştirildiğinde, iki foton uyarılmış floresan SRS mikroskobu, çeşitli biyomoleküllerin eşzamanlı yapısal ve fonksiyonel görüntülemesini sağlayarak karmaşık biyolojik süreçleri anlamamızı kolaylaştırabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Rezonans ve spontan Raman Microspectroscopy Floresan Arkaplan reddi

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Çözüm Biyolojik Makromoleküllerin Küçük ve Geniş Açı X-Ray Saçılma Çalışmaları

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Desorpsiyon Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Biyolojik Dokuların Görüntüleme

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Aracı Olarak bir lipozomal-kapsüllü Yakın-Kızılötesi floroforun Floresan-söndürme<em&gt; İn Vivo</em&gt; Optik Görüntüleme

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...