Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينوه بمنح NCI R01 CA216248 و CA206458 و CA179556 لتمويل هذا العمل. نود أيضا أن نشيد بالدكتور كيفن إليسيري ومجموعة التصوير الخاصة به على خبرتهم التقنية في التطوير المبكر لبرنامجنا الحيوي. كما نشكر الدكتور بن كوكس والأعضاء الآخرين في مجموعة Eliceiri Fabrication Group في معهد Morgridge للأبحاث على تصميمهم التقني الأساسي خلال المراحل المبكرة من MIW. ساعدت الدكتورة إلين دوبسون في إجراء محادثات مفيدة حول أداة تجزئة WEKA القابلة للتدريب على ImageJ. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكتورة ميليسا سكالا والدكتورة أليكسا باريس هيتون على استخدام المجهر في الوقت المناسب. وأخيرا، نود أن نشكر الدكتورة بريجيت رابي، D.V.M، على جميع المناقشات المدروسة والنصائح حول التعامل مع الماوس والعناية به.

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ويسكونسن ماديسون. الرفاه وإدارة الألم في جميع التجارب على الحيوانات أمر بالغ الأهمية. وبالتالي ، يتم بذل كل جهد ممكن للتأكد من أن الحيوان مريح ويحظى برعاية جيدة في كل خطوة من خطوات الإجراء.
<p class=...

التصوير داخل الحيوية 4D هو أداة قوية للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية الديناميكية داخل السياق المكاني والزمني للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. توفر هذه المخطوطة إطارا تشغيليا أساسيا وقابلا للتكيف لتقسيم تفاعلات الخلايا الديناميكية داخل كتلة الورم أو السدى المجاورة أو على مقربة من شبكة الأو...

من المعروف أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) في البيئة الدقيقة للورم يتم ترسيبها ديناميكيا وإعادة تشكيلها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا لزيادة تسهيل تطور المرض1،2،3. توفر تعديلات المصفوفة هذه إشارات ميكانيكية وبيولوجية تغير سلوك الخلية وغالبا ما تؤدي إلى دورة مستمرة من إعادة تشكيل المصفوفة4. غالبا ما يتم إجراء التحقيق في التفاعل الديناميكي المتبادل بين الخلايا السرطانية والمصفوفة خارج الخلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية أو أنظمة الموائع الدقيقة. في حين أظهرت هذه النهج من القاعدة إلى القمة آليات إعادة تشكيل ECM 5,6,7 ، وزيادة الانتشار 8 ، والانتقال الظهاري إلى الوسيط 9,10,11,12 ، وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها 7,13,14,15,16 ، كان تركيزهم في المقام الأول على عدد قليل من أنواع الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا السرطانية أو الخلايا الليفية) ضمن مصفوفة 3D متجانسة مقارنة بتنوع وعدم تجانس التفاعلات الموجودة داخل الأنسجة الفسيولوجية. بالإضافة إلى الأنظمة المخبرية ، يمكن أن يوفر علم أنسجة الأورام خارج الجسم الحي أيضا بعض الأفكار حول تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM17. تتميز الكيمياء النسيجية المناعية بقدرتها على تحليل أنواع متعددة من الخلايا فيما يتعلق بالتكوين والبنية غير المتجانسين مكانيا ل ECM ، لكن نقاط النهاية الثابتة للأنسجة الثابتة لا تلتقط الطبيعة الديناميكية للتفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة. فتح التصوير داخل الحيوية الباب لاستجواب التفاعلات المتنوعة والديناميكية داخل السياق الفسيولوجي للبيئة الدقيقة للورم الأصلي.
قدرات التصوير داخل الورم الحيوي تتقدم بسرعة. وقد مكنت التحسينات في تصميم نوافذ التصوير والتقنيات الجراحية لزرع النوافذ من تصوير الورم الطولي على المدى الطويل في مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية (أي الورم الأولي والغدد الليمفاوية والمواقع النقيلية18،19،20). وعلاوة على ذلك، أصبحت قدرة الأجهزة البصرية على تصور البيانات وجمعها في أبعاد متعددة (أي كثافة التألق الطيفي المكاني ومدى الحياة)، وبدقة وسرعة عاليتين (معدل الفيديو) متاحة على نطاق واسع. توفر التكنولوجيا المحسنة فرصة لاستكشاف التغيرات السريعة في إشارات الخلايا وديناميكيات النمط الظاهري داخل بيئة فسيولوجية. وأخيرا ، فإن التوسع في الأدوات البصرية الجينية ومجموعة واسعة من تركيبات الفلورسنت الجينية تسمح بوضع علامات على أنواع معينة من الخلايا لالتقاط هجرة الخلايا في البيئة الدقيقة للورم أو تتبع سلالة الخلية أثناء التطور أو تطور المرض21,22. يوفر استخدام هذه الأدوات مع تقنية CRISPR / Cas9 للباحثين الفرصة لإنشاء نماذج حيوانية فريدة في الوقت المناسب.
في حين أن كل هذه التطورات تجعل التصوير داخل الحيوية طريقة قوية بشكل متزايد لاستكشاف التفاعلات الخلوية الديناميكية والفسيولوجية ، لا تزال هناك حاجة مهمة لتطوير استراتيجيات توفر سياقا مكانيا وزمنيا وهيكليا على مستوى الأنسجة لهذه التفاعلات البيولوجية. في الوقت الحالي ، تعوض العديد من دراسات التصوير داخل الحيوية عن نقص المعالم البصرية مثل الأوعية الدموية عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في الأوعية الدموية أو استخدام نماذج الفئران التي تعبر خارجيا عن بروتينات الفلورسنت لتحديد السمات الفيزيائية. تستخدم الأصباغ والركائز القابلة للحقن مثل ديكستران الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأوعية الدموية بنجاح في المجموعات الحيوية19 و 23 و 24. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، يتطلب الأمر تلاعبات إضافية بالماوس وتقتصر فائدته على التجارب قصيرة الأجل. بالنسبة للدراسات الطولية ، يمكن أن يكون ديكستران الفلورسنت مشكلة حيث نلاحظ تراكم الدكستران في الخلايا البلعمية أو الانتشار في الأنسجة المحيطة بمرور الوقت25. تم تقديم دمج البروتين الفلوري الخارجي في نموذج الفأر كبديل للديكستران الفلوري ولكنه يمثل قيودا خاصة به. لا يزال توافر وتنوع الفلوروفورات الخارجية داخل نماذج الفئران محدودا ومكلفا لإنشائه. بالإضافة إلى ذلك ، في نماذج محددة ، مثل نماذج PDX ، فإن التلاعب الجيني غير مرغوب فيه أو ممكن. وقد تبين أيضا أن وجود البروتينات الفلورية أو المضيئة الحيوية داخل الخلايا يتم التعرف عليها على أنها غريبة داخل الفأر ، وضمن نماذج الفئران المناعية ، وهذا يقلل من كمية الانبثاث بسبب استجابة الجهاز المناعي المضيف26,27. وأخيرا، غالبا ما تحتل البروتينات الفلورية الخارجية أو الأصباغ الفلورية المستخدمة في السياق المكاني أو لتقسيم البيانات اللاحقة نطاقات أولية من الطيف الضوئي يمكن استخدامها بطريقة أخرى للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية ذات الاهتمام.
يمثل استخدام الإشارة الجوهرية من ECM أو التألق الداخلي من الخلايا داخل الأنسجة وسيلة عالمية محتملة خالية من الملصقات لتقسيم البيانات داخل الحيوية لإجراء تحليل خلوي ومكاني أكثر تعمقا. لطالما استخدم الجيل التوافقي الثاني (SHG) لتصور ECM28. مع التطوير اللاحق لأدوات مهمة للمساعدة في توصيف تنظيم الألياف29،30،31 ، من الممكن توصيف سلوك الخلية بالنسبة لبنية ECM المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التألق الذاتي من المستقلب الداخلي ، NAD (P) H ، أداة أخرى خالية من الملصقات لتقسيم البيئة الدقيقة للورم في الجسم الحي. يتألق NAD(P)H بشكل مشرق في الخلايا السرطانية ويمكن استخدامه للتمييز بين حدود عش الورم المتنامي من السدى المحيط به21,32. وأخيرا ، فإن الأوعية الدموية هي بنية فسيولوجية مهمة في البيئة الدقيقة للورم وموقع التفاعلات الرئيسية الخاصة بنوع الخلية 33،34،35. تم استخدام إثارة خلايا الدم الحمراء (RBC) أو بلازما الدم لتصور الأوعية الدموية للورم ، وباستخدام إثارة اثنين أو ثلاثة فوتونات (2P ؛ 3P) ، تبين أن قياس معدلات تدفق الدم ممكن36. ومع ذلك ، في حين أن الأوعية الدموية الأكبر يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال توقيعات التألق الداخلية الخاصة بها ، فإن تحديد الأوعية الدموية الصغيرة الدقيقة والمتغيرة والأقل فلورسنت يتطلب المزيد من الخبرة. هذه الصعوبات المتأصلة تعيق تجزئة الصورة المثلى. لحسن الحظ ، يمكن أيضا قياس مصادر التألق الداخلي (أي خلايا الدم الحمراء وبلازما الدم) عن طريق التصوير الفلوري مدى الحياة37 ، والذي يستفيد من الخصائص الفيزيائية الضوئية الفريدة للأوعية الدموية ويمثل إضافة مفيدة إلى صندوق الأدوات المتنامي داخل الحيوية.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير عمل لتجزئة التصوير داخل الحيوية رباعي الأبعاد (4D) بشكل صريح باستخدام إشارات جوهرية مثل التألق الداخلي و SHG من الاستحواذ إلى التحليل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات الطولية من خلال نافذة تصوير الثدييات حيث قد لا يكون التألق الخارجي عمليا أو ممكنا ، كما هو الحال مع نماذج PDX. ومع ذلك ، فإن مبادئ التجزئة الموضحة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على المستخدمين داخل المناطق الحيوية الذين يحققون في بيولوجيا الورم أو تطور الأنسجة أو حتى فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية. ستسمح مجموعة أساليب التحليل المبلغ عنها للمستخدمين بالتمييز بين السلوك الخلوي بين مناطق تكوينات ألياف الكولاجين المحاذاة أو العشوائية ، ومقارنة أعداد أو سلوكيات الخلايا الموجودة في مناطق محددة من البيئة الدقيقة للورم ، وتعيين الأوعية الدموية إلى البيئة الدقيقة للورم باستخدام إشارة خالية من الملصقات أو جوهرية فقط. معا ، تخلق هذه الأساليب إطارا تشغيليا لزيادة عمق المعلومات المكتسبة من التصوير الحيوي 4D للغدة الثديية مع تقليل الحاجة إلى ملصقات خارجية إضافية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

تعد القدرة على تصور التفاعلات الفسيولوجية المعقدة والديناميكية بين العديد من أنواع الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل بيئة دقيقة حية للورم خطوة مهمة نحو فهم الآليات التي تنظم تطور الورم. في حين يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات التصوير داخل الحيوية الحالية ، إلا أنه لا يزال يمثل تحديا بسبب الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة والحاجة إلى السياق المكاني داخل الملاحظة التجريبية. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير سير عمل التصوير داخل الحيوية الذي يجمع بين تصوير الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين ، والتألق الداخلي من العامل المساعد الأيضي NAD (P) H ، والمجهر التصويري الفلوري مدى الحياة (FLIM) كوسيلة لتقسيم البيئة المجهرية للورم بشكل غير جراحي إلى المجالات الأساسية لعش الورم ، والسدى المحيط أو ECM ، والأوعية الدموية. يفصل هذا البروتوكول غير الجراحي العملية خطوة بخطوة التي تتراوح من الحصول على صور الفاصل الزمني لنماذج أورام الثدي إلى تحليل ما بعد المعالجة وتجزئة الصور. الميزة الأساسية لسير العمل هذا هي أنه يستغل التوقيعات الأيضية لوضع البيئة الدقيقة للورم الحي المتغيرة ديناميكيا في سياقها دون استخدام ملصقات الفلورسنت الخارجية ، مما يجعلها مفيدة لنماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض البشري والاستخدام السريري المستقبلي حيث لا يمكن تطبيق الفلوروفورات الخارجية بسهولة.

تركيب MIW والتخطيط التجريبي الأساسي هي الخطوات الأولى في هذه العملية. هذا التصميم والبروتوكول الخاص ب MIW أكثر قابلية للدراسات الطولية19 وقد تم استخدامه بنجاح مع كل من المجاهر المستقيمة والمقلوبة. في هذه الحالة ، تم استخدام المجهر المقلوب لأنه أدى إلى استقرار صورة أكبر للغدة الث...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

تستخدم طريقة التصوير داخل الحيوية الموصوفة هنا الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين والتألق الداخلي من العامل الأيضي المساعد NAD (P) H إلى تقسيم بيئة مجهرية للورم غير المسمى بشكل غير جراحي إلى مقصورات الورم واللحمية والأوعية الدموية لإجراء تحليل متعمق للصور الحيوية 4D.

نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

يسمح لنا التصوير داخل الحيوية بمراقبة التفاعلات الفسيولوجية داخل البيئة الدقيقة للورم. وباستخدام هذه الطريقة ، يمكن تقسيم السلوكيات الديناميكية المحددة التي يتم ملاحظتها باستخدام ميزات الأنسجة المحلية. يستخدم هذا البروتوكول فقط إشارة خالية من الملصقات في كل مكان من ألياف الكولاجين أو مستقلبات الفلورسنت الذاتية لتقسيم TME ، وبالتالي تقليل كمية التلاعب بالماوس.هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على أي نظام داخل الحيوية حيث يلزم فهم التفاعلات الديناميكية المتعلقة بهياكل المصفوفة خارج الخلية أو الهياكل الوعائية. سيوضح هذا الإجراء ديف إنمان ، كبير أخصائيي الأبحاث ، وإيريكا هوفمان ، طالبة الدراسات العليا من المختبر. ابدأ في إعداد زجاج غطاء نافذة تصوير الثدييات عن طريق نقع زجاج غطاء دائري 1.5 12 ملم في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتجفيف زجاج الغطاء تحت مصباح حراري وقم بتأمين الزجاج على إطار نافذة التصوير الثديي المعدني باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate.علاج المادة اللاصقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم مسحة منقوعة بالأسيتون لتنظيف نافذة التصوير الثديي المجمعة للمادة اللاصقة الزائدة قبل غمر نافذة التصوير الثديي في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق على الأقل للمساعدة في التطهير. بعد التجفيف ، قم بتخزين نافذة التصوير الثديي التي تم تنظيفها في طبق بتري معقم.قبل البدء في الجراحة لزرع النافذة ، قم بتعقيم الأدوات الجراحية وتعقيم الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد سطح طاولة معقم للجراحة مع بطانية تسخين مغطاة بحقل معقم. اضبط بطانية الاحترار بحيث تكون درجة الحرارة المقاسة أعلى الحقل المعقم 40 درجة مئوية.استخدم الإضاءة الباردة الإضافية والنظارات المكبرة للإجراء الجراحي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية التي تتكون من معطف مختبر معقم يستخدم مرة واحدة ، والأكمام الجراحية ، والقفازات ، وحماية العين ، وقناع الوجه. بعد ذلك ، قم بإزالة فرو الفأر المخدر في الغدة الثديية الإربية الرابعة باستخدام كريم مزيل للشعر وشطف الموقع الجراحي بشاش منقوع بالماء المعقم.ثم قم بإعداد الموقع الجراحي المزيل للشعر للجراحة عن طريق تعقيم سطح الجلد بثلاثة مقشرات Betadine والإيثانول بالتناوب. عند الانتهاء، ارفعي الجلد بلطف فوق الغدة الثديية رقم أربعة باستخدام الملقط. بمجرد سحب الجلد بعيدا عن جدار الجسم ، قم بإزالة مقطع ملليمتر واحد من الطبقة الجلدية عند طرف الملقط باستخدام مقص مجهري جراحي.دون قطع الغدة الأساسية ، قم بإنشاء شق 10 ملم ثم حرر الغدة الثديية من الطبقة الجلدية بحركة لطيفة للملقط. أضف PBS لتغطية الغدة المكشوفة. استخدم خياطة مضفرة من الحرير 5-0 لإنشاء خيط خيط محفظة على طول محيط الفتحة ، ثم أدخل حافة نافذة التصوير الثديي بحيث تتفاعل الطبقة الجلدية مع الشق المتلقي لنافذة التصوير الثديي.أثناء تمديد الظهارة في الطرف الآخر من نافذة التصوير الثديي ، ادفع نافذة التصوير الثديي المعدني إلى مكانها بحيث تقوم الطبقة الجلدية بإشراك الشق المتلقي بالكامل حول محيط نافذة التصوير الثديي بأكمله. ثم قم بربط سلسلة المحفظة لرسم الطبقة الجلدية في الشق وربط الطبقة لتأمين النافذة. ضع مضادا حيويا موضعيا على الطبقة الجلدية في نافذة التصوير الثديي وراقب الماوس باستمرار.بعد استعادة الوعي الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ، قم بإيواء نافذة التصوير الثديي المزروعة بالفأر بشكل منفصل على فراش ناعم مع وضع كوخ صغير في القفص والسماح للفأر بالتعافي لمدة 48 ساعة قبل التصوير. للتصوير ، استخدم نظام هواء قسري مضبوط على 30 درجة مئوية. استخدم سخان موضوعي إضافي لتجنب الانجراف في التركيز البؤري Z والسماح للنظام بالوصول إلى التوازن عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التصوير.ثم قم بإعداد غرفة تدفئة على مسرح المجهر. بعد التأكد من التخدير باستخدام طريقة قرصة إصبع القدم ، أضف مرهما للعين إلى الماوس. للحفاظ على الترطيب المناسب ، حقن 0.5 ملليلتر من PBS تحت الجلد كل ساعتين طوال مدة جلسة التصوير.ضع جل مائي بدلا من الماء على الهدف ونظف الجزء الخارجي من زجاج نافذة التصوير الثديي باستخدام قضيب قطني ومنظف زجاج قبل نقل الماوس إلى مرحلة المجهر المسخن مسبقا. بعد وضع الماوس على مرحلة المجهر ، اضغط على طوق نافذة التصوير الثديي في فتحة استقبال 14 ملم في إدراج المرحلة لتحقيق الاستقرار في الصور وتناسب خرطوم الأيزوفلوران. ثم ضع مجال التصوير في بؤرة التركيز باستخدام مناظير المجهر وإضاءة Brightfield ، مع مراقبة الأوعية الدموية مع تدفق الدم.تحقق من استقرار مجال الرؤية. في حالة وجود قطع أثرية لحركة التنفس ، ضع ضغطا لطيفا على الجانب الخلفي من الغدة باستخدام كتلة رغوة صغيرة وقطعة تشبه السينكريتور من الشريط اللاصق. بعد تطبيق الضغط، تحقق من الحفاظ على تدفق الدم في جميع أنحاء مجال الرؤية.بمجرد تخدير الماوس ووضعه بشكل آمن على مرحلة المجهر المقلوب ، ابدأ في تحديد المناطق ذات الاهتمام. باستخدام مصدر ضوء موجه إلى نافذة التصوير الثديي ، استخدم مناظير المجهر لتحديد المناطق المحتملة للتحقيق. يجب أن يكون التركيز على رؤية الأوعية الدموية وتدفق الدم.إضافة وحفظ مواضع XY في البرنامج. عند ضبط مستويات الطاقة المناسبة، قم بإعداد مكدس Z ولاحظ ظهور ألياف الكولاجين الوفيرة على بعد 20 إلى 50 ميكرومتر تحت السطح الزجاجي لنافذة التصوير الثديي. سيصبح الكولاجين أقل انتشارا حيث يقسم المجهر أعمق في الورم.تكشف الفراغات في الجيل التوافقي الثاني أو SHG عن موقع كتل الورم. ضع شريحة Z العلوية أسفل طبقة الخلايا الانفرادية مع ظهور ألياف الكولاجين الأولى عند 50 إلى 100 ميكرون. ضع شريحة Z السفلية على 250 ميكرومتر حيث تتلاشى الألياف وتهيمن الإشارة الضعيفة.ثم كرر الإجراء لجميع مواضع XY المحفوظة. بمجرد تعيين نطاق مكدس Z ، قم بزيادة وقت الإقامة إلى ثمانية ميكروثانية وتحسين إعدادات الطاقة والكاشف. قم بتحسين مستويات الطاقة اللازمة لإثارة الأنسجة لكل تجربة واستخدام قوى تصل إلى 90 مللي واط عند 750 نانومتر أو 70 مللي واط عند 890 نانومتر في الفتحة الخلفية للهدف.بعد ذلك ، ابدأ بفترات زمنية مدتها 10 دقائق بين نقاط التجميع لمعظم أفلام الترحيل داخل المناطق الحيوية واضبط الفواصل الزمنية وفقا للأهداف التجريبية. إذا لوحظت علامات السمية الضوئية مثل تبييض الخلايا أو التألق الذاتي المتزايد بسرعة والتبييض الضوئي المفرط ، فقم بتقليل طاقة الليزر أو زيادة فترات الفاصل الزمني كما تشير الظروف. بالنسبة للتصوير الفلوري مدى الحياة أو FLIM ل NADPH ، ابدأ في معاينة المسح الضوئي وضبط طاقة الليزر حتى تكون قراءة تمييز الكسر الثابت أو CFD بين 10 إلى الخامس و 10 إلى السادس.تجاوز CFD بعد 10 إلى النتيجة السادسة في تراكم الفوتون والنتائج الإجمالية الضعيفة. بمجرد ضبط مستوى الطاقة ، اضبط وقت التكامل بين 90 إلى 120 ثانية وابدأ مجموعة FLIM للحصول على فوتونات من مجال الرؤية للوقت المخصص. أظهر مجال رؤية نموذجي داخل ورم ثديي خال من الملصقات ألياف كولاجين وفيرة بالقرب من النافذة وانخفاض في الوفرة أعمق في الورم.ساعد استخدام عمر التألق أو NADPH في تحديد الأوعية الدموية. كانت بعض المناطق المظلمة في الصور عبارة عن طيات الورم أو تعقب فصوص الورم المجاورة. لتحديد الأوعية الدموية ، تم التحقق من صحة صورة مركبة باستخدام NDPH FLIM من خلال مقارنة إسقاطات الكثافة القصوى للمكدس داخل الحيوية قبل وبعد حقن الوريد الذيل من ديكستران الفلورسنت.ويبين التحليل التمثيلي التحديد الكمي لأربعة فئران ومجالات الرؤية. لتحديد حدود كتل الورم الخالية من الملصقات ، تم استخدام التألق الذاتي NADPH. وذكرت الصور البصمات الأيضية للخلايا وموقع الأوعية الدموية.كما حدد التألق الذاتي AFD البلاعم. مع مخطط التجزئة ، تم تقسيم الورم الخالي من الملصقات إلى مقصورات لعش الورم والسدى والأوعية الدموية باستخدام SHG و NADPH autofluorescence فقط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا تصنيف ألياف السدى والكولاجين إلى مناطق محلية من الألياف المحاذاة.أهم شيء يجب تذكره لهذا البروتوكول هو التأكد من أن الماوس مخدوم ومقيد بشكل صحيح بحيث يظل مجال الرؤية مستقرا للتصوير.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

مرحلة الوقت الفاصل، خالية من التسمية، وكمية التصوير دراسة الخلايا السرطانية البشرية الساكنة والنشطة

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

التصوير التحيئي الطولي لسلوك خلايا أورام الدماغ استجابة لخزعة جراحية غازية

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

تقييم البيئة الدقيقة للورم من الانبثاث المدخل بوساطة الأوعية الدموية المرتبطة بنشر الخلايا السرطانية باستخدام التصوير داخل الحيوية وتحليل الأنسجة الثابتة

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

رواية سترومال ليفيبليوم-تعديل 3D نموذج الورم كرويويد لدراسة الورم ستروما التفاعل واكتشاف المخدرات

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

التشريح المجهري بالليزر الصناعي الموجه بالذكاء الاصطناعي للتحليل البروتيني المجهري للبيئة الدقيقة للورم

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...