Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
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作者希望感谢NCI R01 CA216248，CA206458和CA179556资助这项工作。我们还要感谢Kevin Eliceiri博士及其成像小组在早期开发我们活体内计划方面的技术专长。我们还感谢Ben Cox博士和Morgridge研究所Eliceiri制造小组的其他成员，他们在MIW的早期阶段进行了必要的技术设计。Ellen Dobson博士协助进行了有关ImageJ可训练WEKA分割工具的有用对话。此外，我们要感谢Melissa Skala博士和Alexa Barres-Heaton博士及时使用他们的显微镜。最后，我们要感谢 Brigitte Raabe 博士，D.V.M.，感谢他就我们的鼠标处理和护理所做的所有深思熟虑的讨论和建议。

所描述的所有实验都得到了威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会的批准。所有动物实验中的福祉和疼痛管理都至关重要。因此，尽一切努力确保动物在手术的每一步都感到舒适和照顾。
1. 乳腺成像窗口 （MIW） 的生成
<ol><li>要构建乳腺成像窗口，请用手术级不锈钢制造14毫米的环。</li>
	<li>使用5%清洁剂的热溶液清洁机加工的窗框，在流动的去离?...

4D活体成像是研究天然肿瘤微环境的空间和时间背景下动态生理相互作用的强大工具。该手稿提供了一个非常基本且适应性强的操作框架，仅使用来自二次谐波产生或NAD（P）H自发荧光的内源性信号来划分肿瘤肿块内，相邻基质或靠近血管网络的动态细胞相互作用。该协议提供了一种全面的分步方法，从植入成像窗口到图像采集，分析和分割。我们相信这种技术将有助于建立一个必要的分析框架，...

已知肿瘤微环境中的细胞外基质（ECM）被多种细胞类型动态沉积和重塑，以进一步促进疾病进展1，2，3。这些基质改变提供了改变细胞行为的机械和生物学线索，并且通常导致基质重塑的持续循环4。对肿瘤细胞和细胞外基质之间动态，相互相互作用的研究通常使用三维（3D）体外培养或微流体系统进行。虽然这些自下而上的方法已经证明了ECM重塑5，6，7，增殖增加8，上皮到间充质转变9，10，11，12以及肿瘤细胞迁移和侵袭的机制7，13，14，15，16，他们的重点主要集中在均匀的3D基质中的几种细胞类型（例如，肿瘤细胞或成纤维细胞）上，与生理组织内存在的相互作用的多样性和异质性相比。除了体外系统外，离体肿瘤组织学还可以提供一些关于这些细胞-细胞和细胞-ECM相互作用的见解17。免疫组织化学的优点是能够分析与ECM的空间异质组成和结构相关的多种细胞类型，但是固定组织的静态终点不能捕获细胞与微环境之间相互作用的动态性质。活体成像为在原生肿瘤微环境的生理环境中询问各种动态相互作用打开了大门。
活体肿瘤成像的能力正在迅速提高。影像学窗口设计的改进和植入视窗的手术技术使得在各种解剖位置（即原发性肿瘤，淋巴结，转移部位18，19，20）进行长期纵向肿瘤成像。此外，光学仪器在多个维度（即光谱、空间荧光强度和寿命）以及高分辨率和高速（视频速率）下可视化和收集数据的能力正在变得广泛应用。改进的技术为探索生理环境中细胞信号传导和表型动力学的快速变化提供了机会。最后，光遗传学工具的扩增和广泛的遗传荧光构建体允许标记特定细胞类型以捕获肿瘤微环境中的细胞迁移或发育或疾病进展期间的细胞谱系示踪21，22。将这些工具与CRISPR / Cas9技术结合使用，为研究人员提供了及时生成独特动物模型的机会。
虽然所有这些进展使活体成像成为探索动态和生理细胞相互作用的日益强大的方法，但仍然需要制定在组织水平上为这些生物相互作用提供空间，时间和结构背景的策略。目前，许多活体成像研究通过将荧光染料注射到脉管系统中或采用外源性表达荧光蛋白以描绘物理特征的小鼠模型来弥补视觉特征（例如血管）的缺乏。可注射染料和底物如荧光葡聚糖被广泛用于成功标记活体内的脉管系统19， 23， 24。但是，这种方法并非没有限制。首先，它需要额外的鼠标操作，其效用仅限于短期实验。对于纵向研究，荧光葡聚糖可能会有问题，因为我们观察到葡聚糖在吞噬细胞中的积累或随着时间的推移扩散到周围组织中25。外源性荧光蛋白掺入小鼠模型已被提出为荧光葡聚糖的替代品，但存在其自身的局限性。小鼠模型中外源性荧光团的可用性和多样性仍然有限且创建成本高昂。此外，在特定的模型中，例如PDX模型，遗传操作是不可取的或不可能的。还已经表明，细胞内荧光或生物发光蛋白的存在被识别为小鼠内的外来物，并且在免疫功能正常的小鼠模型中，这减少了由于宿主免疫系统的反应而引起的转移量26，27。最后，用于空间背景或分割后续数据的外源荧光蛋白或荧光染料通常占据光谱的素数范围，否则可用于研究感兴趣的生理相互作用。
使用来自ECM的内在信号或来自组织内细胞的内源性荧光代表了一种潜在的通用无标记方法，用于分割活体内数据以进行更深入的细胞和空间分析。二次谐波产生（SHG）长期以来一直用于可视化ECM28。随着随后开发有助于表征纤维组织29，30，31的重要工具，可以表征相对于局部ECM结构的细胞行为。此外，来自内源性代谢物NAD（P）H的自发荧光提供了另一种无标记的工具，用于划分 体内肿瘤微环境。NAD（P）H在肿瘤细胞中发出明亮的荧光，可用于区分生长中的肿瘤巢的边界与其周围的基质21，32。最后，脉管系统是肿瘤微环境中的重要生理结构，也是关键细胞类型特异性相互作用的位点33，34，35。红细胞（RBC）或血浆的激发已被用于可视化肿瘤脉管系统，并且使用双光子或三光子激发（2P; 3P）的血流速率的测量已被证明是可能的36。然而，虽然较大的血管很容易通过其内源性荧光特征来识别，但识别细微的，可变的和荧光较少的小血管需要更多的专业知识。这些固有的困难阻碍了最佳图像分割。幸运的是，这些内源性荧光源（即红细胞和血浆）也可以通过荧光寿命成像37来测量，其利用了脉管系统独特的光物理特性，并代表了对不断增长的活体内工具箱的有益补充。
在该协议中，描述了从采集到分析的四维（4D）活体内成像的工作流程，明确使用内源性荧光和SHG等内在信号进行分割。该协议对于通过乳腺成像窗口进行的纵向研究特别相关，其中外源性荧光可能不实用或不可能，就像PDX模型一样。然而，这里概述的分割原理广泛适用于研究肿瘤生物学，组织发育甚至正常组织生理学的活体内用户。所报告的分析方法套件将允许用户区分排列或随机胶原纤维配置区域之间的细胞行为，比较驻留在肿瘤微环境特定区域的细胞的数量或行为，并仅使用无标记或内在信号将脉管系统映射到肿瘤微环境。这些方法共同创建了一个操作框架，用于最大化从乳腺4D活体内成像中获得的信息深度，同时最大限度地减少对其他外源性标记的需求。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

可视化活肿瘤微环境中多种细胞类型与细胞外基质（ECM）之间复杂和动态生理相互作用的能力是了解调节肿瘤进展机制的重要一步。虽然这可以通过当前的活体成像技术来实现，但由于组织的异质性以及实验观察中对空间背景的需求，它仍然具有挑战性。为此，我们开发了一种活体内成像工作流程，将胶原蛋白二次谐波生成成像，来自代谢共因子NAD（P）H的内源性荧光和荧光寿命成像显微镜（FLIM）配对，作为将肿瘤微环境非侵入性地划分为肿瘤巢，周围基质或ECM以及脉管系统的基本结构域的手段。这种非侵入性方案详细介绍了从采集乳腺肿瘤模型的延时图像到后处理分析和图像分割的分步过程。该工作流程的主要优点是，它利用代谢特征来将动态变化的活肿瘤微环境置于情境中，而无需使用外源性荧光标记，这使其有利于人类患者来源的异种移植物（PDX）模型和未来的临床使用，其中外在荧光团不易适用。

MIW的安装和基本的实验规划是这一过程的第一步。这种特殊的MIW设计和方案更适合纵向研究19 ，并且已成功用于直立和倒置显微镜。在这种情况下，使用了倒置显微镜，因为它使乳腺的图像稳定性更高，呼吸伪影更少。在 图1A中，我们提供了刚性MIW的尺寸和植入过程的图形概述。
无标记MMTV-PyMT39乳腺肿瘤（<strong class="...

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A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

本文描述的活体成像方法利用来自代谢辅助因子NAD（P）H的胶原二次谐波和内源性荧光，将未标记的肿瘤微环境非侵入性地分割成肿瘤，基质和血管室，以深入分析4D活体内图像。

一种用于乳腺肿瘤微环境活体内成像的无标记分割方法

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

活体成像使我们能够观察肿瘤微环境中的生理相互作用。通过使用这种方法，可以使用局部组织特征来划分观察到的特定动态行为。该协议仅使用来自胶原纤维或自发荧光代谢物的无处不在的无标记信号来分割TME，从而最大限度地减少对小鼠的操作量。该方法广泛适用于任何需要了解相对于细胞外基质结构或血管结构的动态相互作用的活体内系统。演示这一程序的将是高级研究专家Dave Inman和实验室研究生Erica Hoffmann。通过将1.5 12毫米圆形盖板玻璃浸泡在100%乙醇中10分钟，然后用加热灯干燥盖板玻璃并使用氰基丙烯酸酯粘合剂将玻璃固定在金属乳腺成像窗框上，开始制备乳腺成像窗盖玻璃。在一夜之间固化粘合剂。第二天，使用丙酮浸泡的拭子清洁组装的乳房成像窗口的多余粘合剂，然后将乳房成像窗口浸入70%乙醇中至少10分钟，以协助清洁。干燥后，将清洁的乳腺成像窗口存放在无菌培养皿中。在开始手术之前，先用70%乙醇高压灭菌手术工具并对表面进行消毒。为手术准备一个经过消毒的桌面，用覆盖着无菌田的温暖毯子。设置加热毯，使无菌场顶部测量的温度为40摄氏度。使用辅助冷光和放大镜进行外科手术。穿戴由无菌一次性实验室外套、手术套、手套、护目镜和口罩组成的PPE。接下来，用脱毛膏去除第四腹股沟乳腺处麻醉小鼠的皮毛，并用无菌水浸泡的纱布冲洗手术部位。然后用三种交替的Betadine和乙醇磨砂膏对皮肤表面进行消毒，准备脱毛的手术部位进行手术。完成后，使用镊子轻轻地将皮肤抬高到乳腺上。一旦皮肤被拉离体壁，用手术微剪刀去除镊子尖端的一毫米真皮层。在不切割下层腺体的情况下，创建一个10毫米的切口，然后通过镊子的轻柔运动将乳腺从真皮层中释放出来。添加PBS以覆盖暴露的腺体。使用5-0丝编织缝合线沿开口的外围形成钱包串缝合线，然后插入乳腺成像窗口的边缘，使真皮层啮合到乳腺成像窗口的接收凹口中。在拉伸乳腺成像窗口另一端的上皮的同时，将金属乳腺成像窗口推入到位，使得真皮层完全啮合整个乳腺成像窗口周周围的接收槽口。然后捏紧钱包绳子，将真皮层拉入缺口，并系上层以固定窗户。在乳腺成像窗口的真皮层上应用局部抗生素并持续监测小鼠。在恢复足够的意识以维持胸骨卧位后，将乳房成像窗口将小鼠单独植入柔软的床上用品上，并将冰屋放置在笼子中，并允许小鼠在成像前恢复48小时。对于成像，请使用设置为30摄氏度的强制空气系统。使用额外的物镜加热器以避免Z轴焦点漂移，并允许系统在成像前至少一小时在30摄氏度下达到平衡。然后在显微镜载物台上设置加热室。用脚趾捏方法确认麻醉后，向小鼠添加眼药膏。为了保持适当的水合作用，在成像过程中，每两小时皮下注射0.5毫升PBS。将水基凝胶而不是水涂在物镜上，并在将小鼠转移到预热的显微镜载物台之前，用棉花施用器和玻璃清洁剂清洁乳腺成像窗口玻璃的外部。将小鼠放在显微镜载物台上后，将乳腺成像窗口的项圈按入载物台插入物台插入物中的14毫米接收孔中，以稳定图像并适合异氟醚软管。然后使用显微镜眼部和明场照明将成像场聚焦，观察脉管系统的血流。检查视野的稳定性。如果存在呼吸运动伪影，请用小泡沫块和类似铍子的胶带轻轻按压压腺的背面。施加按压后，验证整个视野中的血流是否保持。一旦小鼠被镇静并牢固地定位在倒置的显微镜载物台上，开始定位感兴趣的区域。使用指向乳腺成像窗口的光源，使用显微镜的目镜确定潜在的调查区域。重点应该是观察脉管系统和血流。在软件中添加并保存 XY 位置。当设置适当的功率水平时，设置Z堆栈，并在乳腺成像窗口玻璃表面下方20至50微米处观察丰富的胶原纤维的外观。随着显微镜进入肿瘤的更深处，胶原蛋白将变得不那么普遍。二次谐波生成或SHG中的空隙揭示了肿瘤肿块的位置。将顶部的Z切片置于孤立细胞层下方，第一个胶原纤维出现在50至100微米处。将底部Z切片设置为250微米，其中光纤淡出并且信号较差占主导地位。然后对所有保存的XY位置重复该过程。设置 Z 轴堆栈范围后，将停留时间增加到 8 微秒，并优化功率和检测器设置。优化激发每个实验组织所需的功率水平，并在物镜后孔径下使用高达90毫瓦的750纳米或890纳米时高达70毫瓦的功率。接下来，从大多数活体内迁移胶片的收集点之间的10分钟间隔开始，并根据实验目标调整时间间隔。如果观察到光毒性迹象，如细胞漂白或快速增加的自发荧光和过度的光漂白，请根据条件指示降低激光功率或增加延时间隔。对于NADPH的荧光寿命成像或FLIM，开始预览扫描并调整激光功率，直到恒定分数鉴别器或CFD的读数介于10到第五到10到第六之间。超过CFD超过10到第六会导致光子堆积和整体结果不佳。设置功率电平后，将积分时间设置在90到120秒之间，然后启动FLIM集合，在分配的时间内从视野中获取光子。无标记乳腺肿瘤内的典型视野显示，窗口附近有大量的胶原纤维，肿瘤深处的丰度降低。荧光寿命或NADPH的使用有助于识别脉管系统。图像中的一些黑暗区域是肿瘤褶皱或相邻肿瘤叶的对接。为了鉴定脉管系统，通过比较尾静脉注射荧光葡聚糖之前和之后的活体内堆栈的最大强度投影，验证了使用NDPH FLIM的复合图像。代表性分析显示了四只小鼠和视野的量化。为了描绘无标记肿瘤肿块的边界，使用NADPH自发荧光。这些图像报告了细胞的代谢特征和血管的位置。AFD自发荧光也识别出巨噬细胞。通过分割方案，仅使用SHG和NADPH自发荧光将无标记肿瘤分割成肿瘤巢，基质和脉管系统的区室。此外，基质和胶原纤维也可以分为排列纤维的局部区域。对于该协议，要记住的最重要的事情是确保鼠标得到适当的镇静和抑制，以便视野在成像时保持稳定。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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肿瘤微环境的模仿：产生富集的细胞群及侦查间通讯的简单方法

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

科研

癌症研究

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

休眠和活性人肿瘤细胞的时间推移、无标签、定量相成像研究

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

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The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...