Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende NCI R01 CA216248, CA206458 og CA179556 tilskud til finansiering af dette arbejde. Vi vil også gerne anerkende Dr. Kevin Eliceiri og hans billedbehandlingsgruppe for deres tekniske ekspertise i den tidlige udvikling af vores intravitale program. Vi takker også Dr. Ben Cox og andre medlemmer af Eliceiri Fabrication Group ved Morgridge Institute for Research for deres væsentlige tekniske design i de tidlige faser af MIW. Dr. Ellen Dobson hjalp med nyttige samtaler om ImageJ-træningsværktøjet WEKA-segmenteringsværktøj. Derudover vil vi gerne takke Dr. Melissa Skala og Dr. Alexa Barres-Heaton for rettidig brug af deres mikroskop. Til sidst vil vi gerne takke Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, for alle de tankevækkende diskussioner og råd om vores musehåndtering og -pleje.

Alle beskrevne eksperimenter blev godkendt af University of Wisconsin-Madisons Institutional Animal Care and Use Committee. Trivsel og smertebehandling i alle dyreforsøg er altafgørende. Således gøres alt for at sikre, at dyret er behageligt og velplejet på hvert trin i proceduren.
1. Generering af brystbilleddannelsesvinduet (MIW)
<ol><li>For at konstruere brystbilleddannelsesvinduet skal du fremstille en 14 mm ring af rustfrit stål af kirurgisk kvalitet.</li>
	<li>Re...

4D intravital billeddannelse er et kraftfuldt værktøj til at undersøge dynamiske fysiologiske interaktioner inden for den rumlige og tidsmæssige kontekst af det oprindelige tumormikromiljø. Dette manuskript giver en meget grundlæggende og tilpasningsdygtig operationel ramme til opdeling af dynamiske celleinteraktioner inden for tumormassen, den tilstødende stroma eller i nærheden af det vaskulære netværk ved kun at bruge endogene signaler fra anden harmonisk generation eller NAD (P) H autofluorescens. Denne pro...

Den ekstracellulære matrix (ECM) i tumormikromiljøet er kendt for at være dynamisk deponeret og ombygget af flere celletyper for yderligere at lette sygdomsprogression 1,2,3. Disse matrixændringer giver både mekaniske og biologiske signaler, der ændrer celleadfærd og ofte resulterer i en fortsat cyklus af matrixombygning4. Undersøgelse af det dynamiske, gensidige samspil mellem tumorceller og den ekstracellulære matrix udføres ofte ved hjælp af tredimensionel (3D) in vitro-kultur eller mikrofluidiske systemer. Mens disse bottom-up-tilgange har vist mekanismer til ECM-ombygning 5,6,7, øget proliferation8, epitel til mesenkym overgang 9,10,11,12 og tumorcellemigration og invasion 7,13,14,15,16 , har deres fokus primært været på nogle få celletyper (f.eks. Tumorceller eller fibroblaster) inden for en homogen 3D-matrix sammenlignet med mangfoldigheden og heterogeniteten af interaktioner, der er til stede i et fysiologisk væv. Ud over in vitro-systemer kan ex vivo tumor histologi også give en vis indsigt i disse celle-celle og celle-ECM-interaktioner17. Immunohistokemi har den fordel, at den er i stand til at analysere flere celletyper med hensyn til ECM's rumligt heterogene sammensætning og arkitektur, men de statiske endepunkter for fast væv fanger ikke den dynamiske karakter af interaktioner mellem celler og mikromiljøet. Intravital billeddannelse har åbnet døren for at forhøre forskellige og dynamiske interaktioner inden for den fysiologiske kontekst af det oprindelige tumormikromiljø.
Mulighederne for intravital tumorbilleddannelse skrider hurtigt frem. Forbedringer i designet af billeddannelsesvinduer og kirurgiske teknikker til implantering af vinduerne har muliggjort langsigtet langsgående tumorbilleddannelse på en række anatomiske steder (dvs. primær tumor, lymfeknuder, metastatiske steder 18,19,20). Desuden bliver optisk instrumenterings kapacitet til at visualisere og indsamle data i flere dimensioner (dvs. spektral, rumlig fluorescensintensitet og levetid) og ved høj opløsning og hastighed (videohastighed) bredt tilgængelig. Den forbedrede teknologi giver mulighed for at udforske hurtige ændringer i cellesignalering og fænotypisk dynamik inden for et fysiologisk miljø. Endelig giver udvidelsen af optogenetiske værktøjer og den brede vifte af genetiske fluorescerende konstruktioner mulighed for mærkning af specifikke celletyper for at fange cellemigration i tumormikromiljø- eller celleafstamningssporing under udvikling eller sygdomsprogression21,22. Brugen af disse værktøjer i kombination med CRISPR/Cas9-teknologien giver forskerne mulighed for at generere unikke dyremodeller i tide.
Mens alle disse fremskridt gør intravital billeddannelse til en stadig mere kraftfuld metode til at udforske dynamiske og fysiologiske cellulære interaktioner, er der stadig et vigtigt behov for at udvikle strategier, der giver rumlig, tidsmæssig og strukturel kontekst på vævsniveau til disse biologiske interaktioner. I øjeblikket kompenserer mange intravitale billeddannelsesundersøgelser for manglen på visuelle landemærker såsom blodkar ved at injicere fluorescerende farvestoffer i vaskulaturen eller anvende musemodeller, der eksogent udtrykker fluorescerende proteiner for at afgrænse fysiske træk. Injicerbare farvestoffer og substrater som fluorescerende dextrans anvendes bredt til med succes at mærke vaskulaturen i intravitale samlinger19, 23, 24. Denne tilgang er imidlertid ikke uden begrænsninger. For det første kræver det yderligere musemanipulationer, og dets anvendelighed er begrænset til kortsigtede eksperimenter. Til langsgående undersøgelser kan fluorescerende dextran være problematisk, da vi observerer akkumuleringen af dextran i fagocytiske celler eller diffusion i det omgivende væv over tid25. Eksogen fluorescerende proteininkorporering i musemodellen er blevet præsenteret som et alternativ til fluorescerende dextrans, men præsenterer sine egne begrænsninger. Tilgængeligheden og mangfoldigheden af eksogene fluoroforer i musemodeller er stadig begrænset og dyr at skabe. Derudover er genetiske manipulationer i specifikke modeller, såsom PDX-modeller, ikke ønskelige eller mulige. Det har også vist sig, at tilstedeværelsen af fluorescerende eller bioluminescerende proteiner i celler anerkendes som fremmede i musen, og inden for immunkompetente musemodeller reducerer dette mængden af metastase på grund af værtsimmunsystemets respons26,27. Endelig optager eksogene fluorescerende proteiner eller fluorescerende farvestoffer, der anvendes til rumlig kontekst eller til at segmentere efterfølgende data, ofte primære områder af lysspektret, der ellers kunne bruges til at undersøge de fysiologiske interaktioner af interesse.
Anvendelsen af det indre signal fra ECM eller endogen fluorescens fra celler i vævet repræsenterer et potentielt universelt etiketfrit middel til at segmentere intravitale data til mere dybtgående cellulær og rumlig analyse. Anden harmoniske generation (SHG) har længe været brugt til at visualisere ECM28. Med den efterfølgende udvikling af vigtige værktøjer til at hjælpe med karakteriseringen af fiberorganisation 29,30,31 er det muligt at karakterisere celleadfærd i forhold til lokal ECM-struktur. Derudover giver autofluorescens fra den endogene metabolit, NAD (P) H, et andet etiketfrit værktøj til at opdele tumormikromiljøet in vivo. NAD(P)H fluorescerer kraftigt i tumorceller og kan bruges til at skelne grænserne for den voksende tumorrede fra den omgivende stroma21,32. Endelig er vaskulaturen en vigtig fysiologisk struktur i tumormikromiljøet og stedet for nøglecelletypespecifikke interaktioner 33,34,35. Excitationen af røde blodlegemer (RBC) eller blodplasma er blevet brugt til at visualisere tumorvaskulaturen, og ved hjælp af to- eller tre-foton-excitation (2P; 3P) har målingen af blodgennemstrømningshastigheder vist sig at være mulig36. Men mens større blodkar let kan identificeres ved deres endogene fluorescenssignaturer, kræver identifikationen af subtile, variable og mindre fluorescerende små blodkar mere ekspertise. Disse iboende vanskeligheder hindrer optimal billedsegmentering. Heldigvis kan disse kilder til endogen fluorescens (dvs. røde blodlegemer og blodplasma) også måles ved fluorescenslevetidsbilleddannelse 37, som udnytter vaskulaturens unikke fotofysiske egenskaber og repræsenterer en nyttig tilføjelse til den voksende intravitale værktøjskasse.
I denne protokol beskrives en arbejdsgang til segmentering af firedimensionel (4D) intravital billeddannelse eksplicit ved hjælp af iboende signaler som endogen fluorescens og SHG fra erhvervelse til analyse. Denne protokol er især relevant for langsgående undersøgelser gennem et brystbilleddannelsesvindue, hvor eksogen fluorescens muligvis ikke er praktisk eller mulig, som det er tilfældet med PDX-modeller. De segmenteringsprincipper, der er skitseret her, er imidlertid bredt anvendelige for intravitale brugere, der undersøger tumorbiologi, vævsudvikling eller endda normal vævsfysiologi. Den rapporterede pakke af analysemetoder vil give brugerne mulighed for at differentiere cellulær adfærd mellem regioner med justerede eller tilfældige kollagenfiberkonfigurationer, sammenligne tal eller adfærd af celler, der er bosiddende i bestemte regioner i tumormikromiljøet, og kortlægge vaskulaturen til tumormikromiljøet ved kun at bruge etiketfrit eller iboende signal. Sammen skaber disse metoder en operationel ramme for at maksimere dybden af information opnået ved 4D intravital billeddannelse af brystkirtlen, samtidig med at behovet for yderligere eksogene etiketter minimeres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Evnen til at visualisere komplekse og dynamiske fysiologiske interaktioner mellem adskillige celletyper og den ekstracellulære matrix (ECM) inden for et levende tumormikromiljø er et vigtigt skridt i retning af at forstå mekanismer, der regulerer tumorprogression. Selvom dette kan opnås gennem nuværende intravitale billeddannelsesteknikker, er det stadig udfordrende på grund af vævets heterogene karakter og behovet for rumlig kontekst inden for den eksperimentelle observation. Til dette formål har vi udviklet en intravital billeddannelsesarbejdsgang, der parrer kollagen anden harmonisk generationsbilleddannelse, endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H og fluorescens levetidsbilleddannelsesmikroskopi (FLIM) som et middel til ikke-invasivt at opdele tumormikromiljøet i grundlæggende domæner af tumorreden, den omgivende stroma eller ECM og vaskulaturen. Denne ikke-invasive protokol beskriver den trinvise proces, der spænder fra erhvervelse af time-lapse-billeder af brysttumormodeller til efterbehandlingsanalyse og billedsegmentering. Den primære fordel ved denne arbejdsgang er, at den udnytter metaboliske signaturer til at kontekstualisere det dynamisk skiftende levende tumormikromiljø uden brug af eksogene fluorescerende etiketter, hvilket gør det fordelagtigt for humane patientafledte xenograft (PDX) modeller og fremtidig klinisk brug, hvor ydre fluoroforer ikke er let anvendelige.

Installationen af MIW og grundlæggende eksperimentel planlægning er de første skridt i denne proces. Dette særlige MIW-design og -protokol er mere modtagelige for langsgående undersøgelser19 og er blevet brugt med succes med både opretstående og omvendte mikroskoper. I dette tilfælde blev der anvendt et omvendt mikroskop, da det har resulteret i større billedstabilitet i brystkirtlen med færre vejrtrækningsartefakter. I figur 1A giver vi dimensionerne af d...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Den intravitale billeddannelsesmetode, der er beskrevet her, anvender kollagen anden harmonisk generation og endogen fluorescens fra den metaboliske co-faktor NAD (P) H til ikke-invasivt at segmentere et umærket tumormikromiljø i tumor-, stromal- og vaskulære rum til dybdegående analyse af 4D-intravitale billeder.

En etiketfri segmenteringsmetode til intravital billeddannelse af brysttumormikromiljø

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Intravital billeddannelse giver os mulighed for at observere fysiologiske interaktioner inden for tumormikromiljøet. Og ved at bruge denne metode kan specifikke dynamiske adfærd, der observeres, opdeles ved hjælp af lokale vævsfunktioner. Denne protokol bruger kun et allestedsnærværende etiketfrit signal fra kollagenfibre eller autofluorescerende metabolitter til at segmentere TME og derved minimere mængden af manipulationer til musen.Denne metode er bredt anvendelig på ethvert intravitalt system, hvor forståelse af dynamiske interaktioner i forhold til ekstracellulære matrixstrukturer eller vaskulære strukturer er påkrævet. Demonstrerer denne procedure vil være Dave Inman, senior forskningsspecialist, og Erica Hoffmann, en kandidatstuderende fra laboratoriet. Begynd at forberede et brystbilledvinduesdækselglas ved at lægge et 1,5 12 millimeter rundt dækglas i blød i 100% ethanol i 10 minutter, tør derefter dækglasset under en varmelampe og fastgør glasset til metalbrystbilleddannelsesvinduesrammen ved hjælp af cyanoacrylatklæbemiddel.Hærd klæbemidlet natten over. Den næste dag skal du bruge en acetone gennemblødt vatpind til at rengøre det samlede brystbilleddannelsesvindue for det overskydende klæbemiddel, inden du nedsænker brystbilleddannelsesvinduet i 70% ethanol i mindst 10 minutter for at hjælpe med rensningen. Efter tørring opbevares det rensede brystbilleddannelsesvindue i en steril petriskål.Før operationen for vinduesimplantation påbegyndes, autoklave kirurgiske værktøjer og desinficere overflader med 70% ethanol. Forbered en desinficeret bordplade til operationen med et varmetæppe dækket af et sterilt felt. Indstil varmetæppet således, at temperaturen målt oven på det sterile felt er 40 grader Celsius.Brug ekstra kold belysning og forstørrelsesglas til den kirurgiske procedure. Brug personlige værnemidler bestående af en steril engangslaboratoriefrakke, kirurgiske ærmer, handsker, øjenbeskyttelse og ansigtsmaske. Fjern derefter pelsen af den anæstetiserede mus ved den fjerde inguinale brystkirtel med en hårfjerningscreme og skyll det kirurgiske sted med et sterilt vand gennemblødt gasbind.Forbered derefter det depilerede kirurgiske sted til kirurgi ved at desinficere hudoverfladen med tre skiftevis Betadin- og ethanolskrubber. Når du er færdig, skal du forsigtigt løfte huden over brystkirtlen nummer fire ved hjælp af tang. Når huden er trukket væk fra kropsvæggen, skal du fjerne en millimeter sektion af det dermale lag ved spidsen af tangen med kirurgiske mikrosaks.Uden at skære den underliggende kirtel skal du oprette et snit på 10 millimeter og derefter frigøre brystkirtlen fra det dermale lag med tangens blide bevægelse. Tilsæt PBS for at dække den udsatte kirtel. Brug en 5-0 silkeflettet sutur til at skabe en pungstrengsutur langs åbningens periferi, og indsæt derefter en kant af brystbilleddannelsesvinduet, så det dermale lag går i indgreb i det modtagende hak i brystbilleddannelsesvinduet.Mens du strækker epitelet i den modsatte ende af brystbilleddannelsesvinduet, skal du skubbe metalbrystbilleddannelsesvinduet på plads, så det dermale lag fuldt ud engagerer det modtagende hak omkring hele brystbilleddannelsesvinduets omkreds. Klem derefter pungen snor for at trække det dermale lag ind i hakket og binde laget af for at fastgøre vinduet. Påfør et topisk antibiotikum på det dermale lag ved brystbilleddannelsesvinduet og overvåg kontinuerligt musen.Efter at have genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal liggende, skal du huse brystbilleddannelsesvinduet implanteret mus separat på blødt strøelse med en iglo placeret i buret og lade musen komme sig i 48 timer før billeddannelse. Til billeddannelsen skal du bruge et tvungen luftsystem, der er indstillet til 30 grader Celsius. Brug en ekstra objektiv varmelegeme for at undgå drift i Z-fokus, og lad systemet komme i ligevægt ved 30 grader Celsius i mindst en time før billeddannelse.Derefter oprettes et varmekammer på mikroskoptrinnet. Efter at have bekræftet anæstesien med tåklemmemetoden, tilsættes en øjensalve til musen. For at opretholde korrekt hydrering skal du injicere 0,5 ml PBS subkutant hver anden time i løbet af billeddannelsessessionen.Påfør en vandbaseret gel i stedet for vand til målet, og rengør ydersiden af brystbilledvinduesglasset med en bomuldsapplikator og glasrenser, inden musen overføres til det forvarmede mikroskopstadium. Når du har lagt musen på mikroskoptrinnet, skal du trykke på kraven på brystbilleddannelsesvinduet i et 14 millimeter modtagende hul i sceneindsatsen for at stabilisere billederne og passe til isofluranslangen. Bring derefter billeddannelsesfeltet i fokus ved hjælp af mikroskopets kikkert og Brightfield-belysning, idet du observerer vaskulatur med blodgennemstrømning.Kontroller stabiliteten af synsfeltet. Hvis der er vejrtrækningsbevægelsesartefakter til stede, skal du anvende blid kompression på bagsiden af kirtlen med en lille skumblok og et cincture-lignende stykke klæbebånd. Når kompression er påført, skal du kontrollere, at blodgennemstrømningen opretholdes i hele synsfeltet.Når musen er bedøvet og sikkert placeret på det omvendte mikroskopstadium, skal du begynde at lokalisere områder af interesse. Brug en lyskilde rettet mod brystbilleddannelsesvinduet til at bruge mikroskopets kikkert til at identificere potentielle områder til undersøgelse. Fokus bør være på at se vaskulatur og blodgennemstrømning.Tilføj og gem XY-positionerne i softwaren. Når de passende effektniveauer er indstillet, skal du oprette Z-stakken og observere udseendet af rigelige kollagenfibre ved 20 til 50 mikrometer under glasoverfladen på brystbilleddannelsesvinduet. Kollagen vil blive mindre udbredt, da mikroskopet sektioner dybere ind i tumoren.Hulrummene i den anden harmoniske generation eller SHG afslører placeringen af tumormasser. Sæt den øverste Z-skive under laget af ensomme celler med de første kollagenfibre vises ved 50 til 100 mikron. Sæt den nederste Z-skive til 250 mikrometer, hvor fibrene falmer ud, og det dårlige signal dominerer.Gentag derefter proceduren for alle gemte XY-positioner. Når Z-stakområdet er indstillet, skal du øge opholdstiden til otte mikrosekunder og optimere effekt- og detektorindstillingerne. Optimer de effektniveauer, der er nødvendige for at ophidse vævet til hvert eksperiment, og brug kræfter op til 90 milliwatt ved 750 nanometer eller 70 milliwatt ved 890 nanometer ved målets bageste blænde.Start derefter med 10-minutters intervaller mellem indsamlingssteder for de fleste intravitale migrationsfilm og juster tidsintervallerne i henhold til eksperimentelle mål. Hvis der observeres tegn på fototoksicitet som celleblødning eller hurtigt stigende autofluorescens og overdreven fotoblegning, skal du reducere lasereffekten eller øge timelapseintervallerne, som betingelserne indikerer. For fluorescens levetid billeddannelse eller FLIM af NADPH, start forhåndsvisning scanning og juster lasereffekten, indtil aflæsningen af den konstante fraktionsdiskriminator eller CFD er mellem 10 til den femte og 10 til den sjette.Overskridelse af CFD ud over 10 til det sjette resultat i fotonbunkeup og dårlige samlede resultater. Når effektniveauet er indstillet, skal du indstille integrationstiden mellem 90 og 120 sekunder og starte FLIM-samlingen for at hente fotoner fra synsfeltet i den tildelte tid. Et typisk synsfelt inden for en etiketfri brysttumor viste rigelige kollagenfibre nær vinduet og et fald i overflod dybere ind i tumoren.Anvendelsen af fluorescenslevetid eller NADPH hjalp med identifikationen af vaskulaturen. Nogle mørke områder på billederne var tumorfolder eller støde op af tilstødende tumorlober. For at identificere vaskulatur blev et sammensat billede ved hjælp af NDPH FLIM valideret ved at sammenligne maksimale intensitetsfremskrivninger af den intravitale stak før og efter haleveneinjektion af fluorescerende dextran.Den repræsentative analyse viser kvantificeringen af fire mus og synsfelterne. For at afgrænse grænserne for de etiketfrie tumormasser blev NADPH-autofluorescens anvendt. Billederne rapporterede cellernes metaboliske signaturer og placeringen af blodkarrene.AFD-autofluorescensen identificerede også makrofagerne. Med segmenteringsskemaet blev den etiketfrie tumor segmenteret i rum til tumorreden, stroma og vaskulatur ved kun at anvende SHG og NADPH autofluorescens. Derudover kan stroma- og kollagenfibrene også klassificeres i lokale regioner af de justerede fibre.Den vigtigste ting at huske for denne protokol er at sikre, at musen er korrekt bedøvet og fastholdt, så synsfeltet forbliver stabilt til billeddannelse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

En Mimic af tumor mikromiljø: En simpel metode til at generere berigede Cell Befolkninger og Undersøgelse intercellulær kommunikation

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

En Time-lapse, etiket-fri, kvantitative fase Imaging undersøgelse af passive og aktive menneskelige kræftceller

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berigelse kombineret med etiket-fri kvantitativ massespektrometri til at undersøge Phosphoproteome i Prostata Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinel Intravital Imaging af hjerne tumor celle adfærd som reaktion på en invasiv kirurgisk biopsi

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Vurdering tumor mikromiljø af metastase døråbning-medieret vaskulær permeabilitet forbundet med kræft celle udbredelse ved hjælp af Intravital Imaging og fast vævsanalyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse af sidepopulation i faste tumorcellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

En roman Stromal Fibroblast-Moduleret 3D Tumor Spheroid Model for at studere Tumor-Stroma Interaktion og Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolering af proksimale væsker for at undersøge tumormikromiljøet af pancreas adenocarcinom

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Langsgående intravital billeddannelse gennem klare silikonevinduer

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Industrialiseret, kunstig intelligens-styret lasermikrodissektion til mikroskaleret proteomisk analyse af tumormikromiljøet

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...