Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

De auteurs willen graag NCI R01 CA216248, CA206458 en CA179556 subsidies erkennen voor de financiering van dit werk. We willen ook Dr. Kevin Eliceiri en zijn beeldvormingsgroep bedanken voor hun technische expertise in de vroege ontwikkeling van ons intravitale programma. We bedanken ook Dr. Ben Cox en andere leden van de Eliceiri Fabrication Group van het Morgridge Institute for Research voor hun essentiële technische ontwerp tijdens de vroege fasen van de MIW. Dr. Ellen Dobson assisteerde bij nuttige gesprekken over de ImageJ trainbare WEKA segmentatietool. Daarnaast willen we Dr. Melissa Skala en Dr. Alexa Barres-Heaton bedanken voor het tijdige gebruik van hun microscoop. Tot slot willen we Dr. Brigitte Raabe, D.V.M, bedanken voor alle doordachte discussies en adviezen over onze muisbehandeling en -verzorging.

Alle beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Wisconsin-Madison. Het welzijn en pijnbestrijding in alle dierproeven staat voorop. Er wordt dus alles aan gedaan om ervoor te zorgen dat het dier comfortabel en goed verzorgd is bij elke stap van de procedure.
1. Generatie van het borstbeeldvormingsvenster (MIW)
<ol><li>Om het borstbeeldvormingsvenster te construeren, fabriceert u een ring van 14 mm van ...

4D intravitale beeldvorming is een krachtig hulpmiddel om dynamische fysiologische interacties te onderzoeken binnen de ruimtelijke en temporele context van de inheemse tumormicro-omgeving. Dit manuscript biedt een zeer basaal en aanpasbaar operationeel kader om dynamische celinteracties binnen de tumormassa, het aangrenzende stroma of in de nabijheid van het vasculaire netwerk te compartimenteren met alleen endogene signalen van de tweede harmonische generatie of NAD (P) H-autofluorescentie. Dit protocol biedt een uitge...

Het is bekend dat de extracellulaire matrix (ECM) in de micro-omgeving van de tumor dynamisch wordt afgezet en geremodelleerd door meerdere celtypen om de progressie van de ziekte verder te vergemakkelijken 1,2,3. Deze matrixveranderingen bieden zowel mechanische als biologische signalen die het celgedrag veranderen en vaak resulteren in een voortdurende cyclus van matrixremodellering4. Onderzoek naar het dynamische, wederzijdse samenspel tussen tumorcellen en de extracellulaire matrix wordt vaak uitgevoerd met behulp van driedimensionale (3D) in vitro cultuur of microfluïdische systemen. Terwijl deze bottom-up benaderingen mechanismen van ECM-remodellering 5,6,7 hebben aangetoond, verhoogde proliferatie8, epitheliale naar mesenchymale overgang 9,10,11,12, en tumorcelmigratie en invasie 7,13,14,15,16 , hun focus lag voornamelijk op een paar celtypen (bijvoorbeeld tumorcellen of fibroblasten) binnen een homogene 3D-matrix in vergelijking met de diversiteit en heterogeniteit van interacties die aanwezig zijn in een fysiologisch weefsel. Naast in vitro systemen kan ook ex vivo tumorhistologie enig inzicht geven in deze cel-cel en cel-ECM interacties17. Immunohistochemie heeft het voordeel dat het meerdere celtypen kan analyseren met betrekking tot de ruimtelijk heterogene samenstelling en architectuur van de ECM, maar de statische eindpunten van vast weefsel vangen niet de dynamische aard van interacties tussen cellen en de micro-omgeving. Intravitale beeldvorming heeft de deur geopend om diverse en dynamische interacties te ondervragen binnen de fysiologische context van de inheemse tumormicro-omgeving.
De mogelijkheden van intravitale tumorbeeldvorming gaan snel vooruit. Verbeteringen in het ontwerp van beeldvormingsvensters en chirurgische technieken om de vensters te implanteren hebben longitudinale tumorbeeldvorming op lange termijn mogelijk gemaakt op verschillende anatomische locaties (d.w.z. primaire tumor, lymfeklieren, gemetastaseerde plaatsen 18,19,20). Bovendien wordt het vermogen van optische instrumentatie om gegevens in meerdere dimensies (d.w.z. spectraal, ruimtelijke fluorescentie-intensiteit en levensduur) en met hoge resolutie en snelheid (videosnelheid) te visualiseren en te verzamelen, algemeen toegankelijk. De verbeterde technologie biedt de mogelijkheid om snelle veranderingen in celsignalering en fenotypische dynamica binnen een fysiologische omgeving te onderzoeken. Ten slotte maken de uitbreiding van optogenetische hulpmiddelen en het brede scala aan genetische fluorescerende constructies het mogelijk om specifieke celtypen te taggen om celmigratie in de tumormicro-omgeving of cellijntracering tijdens ontwikkeling of ziekteprogressie vast te leggen21,22. Het gebruik van deze tools in combinatie met CRISPR/Cas9-technologie biedt onderzoekers de mogelijkheid om tijdig unieke diermodellen te genereren.
Hoewel al deze ontwikkelingen intravitale beeldvorming een steeds krachtigere methode maken om dynamische en fysiologische cellulaire interacties te verkennen, is er nog steeds een belangrijke behoefte om strategieën te ontwikkelen die ruimtelijke, temporele en structurele context op weefselniveau bieden aan deze biologische interacties. Momenteel compenseren veel intravitale beeldvormingsstudies het gebrek aan visuele oriëntatiepunten zoals bloedvaten door fluorescerende kleurstoffen in de vasculatuur te injecteren of muismodellen te gebruiken die exogene fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om fysieke kenmerken af te bakenen. Injecteerbare kleurstoffen en substraten zoals fluorescerende dextrans worden breed gebruikt om de vasculatuur met succes te labelen in intravitale collecties19, 23, 24. Deze aanpak is echter niet zonder beperkingen. Ten eerste vereist het extra muismanipulaties en is het nut ervan beperkt tot kortetermijnexperimenten. Voor longitudinale studies kan fluorescerend dextran problematisch zijn omdat we de accumulatie van dextran in fagocytische cellen of diffusie in het omliggende weefsel in de loop van de tijd waarnemen25. Exogene fluorescerende eiwitopname in het muismodel is gepresenteerd als een alternatief voor fluorescerende dextrans, maar vertoont zijn eigen beperkingen. De beschikbaarheid en diversiteit van exogene fluoroforen binnen muismodellen zijn nog steeds beperkt en duur om te maken. Bovendien zijn in specifieke modellen, zoals PDX-modellen, genetische manipulaties niet wenselijk of mogelijk. Het is ook aangetoond dat de aanwezigheid van fluorescerende of bioluminescente eiwitten in cellen worden herkend als vreemd in de muis, en binnen immunocompetente muismodellen vermindert dit de hoeveelheid metastase als gevolg van de reactie van het immuunsysteem van de gastheer26,27. Ten slotte bezetten exogene fluorescerende eiwitten of fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor ruimtelijke context of om latere gegevens te segmenteren vaak prime-bereiken van het lichtspectrum die anders zouden kunnen worden gebruikt om de fysiologische interacties van belang te onderzoeken.
Het gebruik van het intrinsieke signaal van de ECM of endogene fluorescentie van cellen in het weefsel vertegenwoordigt een potentieel universeel labelvrij middel om intravitale gegevens te segmenteren voor meer diepgaande cellulaire en ruimtelijke analyse. Second harmonic generation (SHG) wordt al lang gebruikt om de ECM28 te visualiseren. Met de daaropvolgende ontwikkeling van belangrijke hulpmiddelen om te helpen bij de karakterisering van vezelorganisatie 29,30,31, is het mogelijk om celgedrag te karakteriseren ten opzichte van de lokale ECM-structuur. Bovendien biedt autofluorescentie van de endogene metaboliet, NAD(P)H, een ander labelvrij hulpmiddel om de tumormicro-omgeving in vivo te compartimenteren. NAD(P)H fluoresceert helder in tumorcellen en kan worden gebruikt om de grenzen van het groeiende tumornest te onderscheiden van het omringende stroma21,32. Ten slotte is de vasculatuur een belangrijke fysiologische structuur in de tumormicro-omgeving en de plaats van belangrijke celtypespecifieke interacties 33,34,35. De excitatie van rode bloedcellen (RBC) of bloedplasma is gebruikt om de vasculatuur van de tumor te visualiseren, en met behulp van twee- of drie-foton excitatie (2P; 3P) is aangetoond dat het meten van bloedstroomsnelheden mogelijk is36. Hoewel grotere bloedvaten gemakkelijk te herkennen zijn aan hun endogene fluorescentiehandtekeningen, vereist de identificatie van subtiele, variabele en minder fluorescerende kleine bloedvaten meer expertise. Deze inherente moeilijkheden belemmeren een optimale beeldsegmentatie. Gelukkig kunnen deze bronnen van endogene fluorescentie (d.w.z. rode bloedcellen en bloedplasma) ook worden gemeten door fluorescentielevensbeeldvorming37, die profiteert van de unieke fotofysische eigenschappen van de vasculatuur en een nuttige aanvulling vormt op de groeiende intravitale toolbox.
In dit protocol wordt een workflow beschreven voor de segmentatie van vierdimensionale (4D) intravitale beeldvorming expliciet met behulp van intrinsieke signalen zoals endogene fluorescentie en SHG van acquisitie tot analyse. Dit protocol is met name relevant voor longitudinale studies door middel van een borstbeeldvormingsvenster waar exogene fluorescentie mogelijk niet praktisch of mogelijk is, zoals het geval is met PDX-modellen. De segmentatieprincipes die hier worden beschreven, zijn echter breed toepasbaar op intravitale gebruikers die tumorbiologie, weefselontwikkeling of zelfs normale weefselfysiologie onderzoeken. De gerapporteerde reeks analysebenaderingen stelt de gebruikers in staat om cellulair gedrag te differentiëren tussen regio's van uitgelijnde of willekeurige collageenvezelconfiguraties, aantallen of gedragingen van cellen te vergelijken die zich in specifieke regio's van de tumormicro-omgeving bevinden en de vasculatuur in kaart te brengen met behulp van alleen labelvrij of intrinsiek signaal. Samen creëren deze methoden een operationeel kader voor het maximaliseren van de diepte van informatie die wordt verkregen uit 4D intravitale beeldvorming van de borstklier, terwijl de behoefte aan extra exogene labels wordt geminimaliseerd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

Het vermogen om complexe en dynamische fysiologische interacties tussen talrijke celtypen en de extracellulaire matrix (ECM) in een levende tumormicro-omgeving te visualiseren, is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van mechanismen die tumorprogressie reguleren. Hoewel dit kan worden bereikt door middel van de huidige intravitale beeldvormingstechnieken, blijft het een uitdaging vanwege de heterogene aard van weefsels en de behoefte aan ruimtelijke context binnen de experimentele observatie. Hiertoe hebben we een intravitale beeldvormingsworkflow ontwikkeld die collageen tweede harmonische generatie beeldvorming, endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H en fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) combineert als een middel om de tumormicro-omgeving niet-invasief te compartimenteren in basisdomeinen van het tumornest, het omringende stroma of ECM en de vasculatuur. Dit niet-invasieve protocol beschrijft het stapsgewijze proces, variërend van het verkrijgen van time-lapse-beelden van borsttumormodellen tot nabewerkingsanalyse en beeldsegmentatie. Het belangrijkste voordeel van deze workflow is dat het metabole handtekeningen gebruikt om de dynamisch veranderende levende tumormicro-omgeving te contextualiseren zonder het gebruik van exogene fluorescerende labels, waardoor het voordelig is voor van de mens afgeleide xenograft (PDX) -modellen en toekomstig klinisch gebruik waar extrinsieke fluoroforen niet gemakkelijk toepasbaar zijn.

De installatie van de MIW en de experimentele basisplanning zijn de eerste stappen in dit proces. Dit specifieke MIW-ontwerp en -protocol zijn meer vatbaar voor longitudinale studies19 en is met succes gebruikt met zowel rechtopstaande als omgekeerde microscopen. In dit geval werd een omgekeerde microscoop gebruikt omdat dit heeft geresulteerd in een grotere beeldstabiliteit van de borstklier met minder ademhalingsartefacten. In figuur 1A geven we de afmetingen van de...

Watch this Scientific Journal Video about A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment at JoVE.com

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Intravitale beeldvorming stelt ons in staat om fysiologische interacties in de micro-omgeving van de tumor te observeren. En door deze methode te gebruiken, kunnen specifieke dynamische gedragingen die worden waargenomen, worden gecompartimenteerd met behulp van lokale weefselkenmerken. Dit protocol gebruikt alleen een alomtegenwoordig labelvrij signaal van collageenvezels of autofluorescente metabolieten om de TME te segmenteren, waardoor de hoeveelheid manipulaties voor de muis wordt geminimaliseerd.Deze methode is breed toepasbaar op elk intravitaal systeem waar het begrijpen van dynamische interacties met betrekking tot extracellulaire matrixstructuren of vasculaire structuren vereist is. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Dave Inman, senior onderzoeksspecialist, en Erica Hoffmann, een afgestudeerde student van het laboratorium. Begin met het voorbereiden van een borstbeeldvensterafdekkingsglas door een 1,5 12 millimeter rond afdekglas gedurende 10 minuten in 100% ethanol te weken, droog vervolgens het dekglas onder een warmtelamp en bevestig het glas aan het metalen borstbeeldraamkozijn met cyanoacrylaatlijm.Laat de lijm een nacht uitharden. Gebruik de volgende dag een met aceton gedrenkt wattenstaafje om het geassembleerde borstbeeldvormingsvenster van de overtollige lijm te reinigen voordat u het borstbeeldvormingsvenster gedurende ten minste 10 minuten onderdompelt in 70% ethanol om te helpen bij de reiniging. Bewaar na het drogen het gereinigde borstbeeldvenster in een steriel petrischaaltje.Voordat u begint met de operatie voor de raamimplantatie, autoclaaf chirurgische hulpmiddelen en ontsmet oppervlakken met 70% ethanol. Bereid een ontsmet tafelblad voor de operatie voor met een verwarmende deken bedekt met een steriel veld. Stel de verwarmende deken zo in dat de temperatuur gemeten bovenop het steriele veld 40 graden Celsius is.Gebruik extra koude verlichting en vergrootglazen voor de chirurgische ingreep. Draag PBM's bestaande uit een steriele laboratoriumjas voor eenmalig gebruik, chirurgische mouwen, handschoenen, oogbescherming en gezichtsmasker. Verwijder vervolgens de vacht van de verdoofde muis bij de vierde liesklier met een ontharingscrème en spoel de operatieplaats af met een steriel met water gedrenkt gaas.Bereid vervolgens de ontharende operatieplaats voor op een operatie door het huidoppervlak te ontsmetten met drie afwisselende Betadine- en ethanolscrubs. Als u klaar bent, tilt u de huid voorzichtig op over borstklier nummer vier met behulp van een tang. Zodra de huid van de lichaamswand is weggetrokken, verwijdert u een gedeelte van één millimeter van de huidlaag aan de punt van de tang met chirurgische microscisors.Zonder de onderliggende klier te snijden, maakt u een incisie van 10 millimeter en bevrijdt u vervolgens de borstklier uit de huidlaag met de zachte beweging van de tang. Voeg PBS toe om de blootgestelde klier te bedekken. Gebruik een 5-0 zijde gevlochten hechtdraad om een ringbandnaadsel langs de rand van de opening te maken en plaats vervolgens een rand van het borstbeeldvenster zodat de huidlaag in de ontvangende inkeping van het borstbeeldvenster terechtkomt.Terwijl u het epitheel aan de andere kant van het borstbeeldvormingsvenster uitrekt, duwt u het metalen borstbeeldvormingsvenster op zijn plaats zodat de dermale laag de ontvangende inkeping volledig rond de gehele omtrek van het borstbeeldvormingsvenster inschakelt. Maak vervolgens het touwtje van de portemonnee los om de dermale laag in de inkeping te trekken en bind de laag af om het venster vast te zetten. Breng een actueel antibioticum aan op de huidlaag in het borstbeeldvenster en controleer de muis continu.Na het herwinnen van voldoende bewustzijn om de sternale lighouding te behouden, huisvest de borstbeeldvormingsvenster geïmplanteerde muis afzonderlijk op zacht beddengoed met een iglo in de kooi geplaatst en laat de muis 48 uur herstellen voordat de beeldvorming plaatsvindt. Gebruik voor de beeldvorming een geforceerd luchtsysteem dat is ingesteld op 30 graden Celsius. Gebruik een extra objectieve verwarming om drift in Z-focus te voorkomen en laat het systeem ten minste één uur voor de beeldvorming in evenwicht komen bij 30 graden Celsius.Plaats vervolgens een verwarmingskamer op het microscooppodium. Na het bevestigen van de anesthesie met de teenknijpmethode, voegt u een oogzalf toe aan de muis. Om een goede hydratatie te behouden, injecteert u elke twee uur subcutaan 0,5 milliliter PBS gedurende de duur van de beeldvormingssessie.Breng een gel op waterbasis aan in plaats van water op het objectief en reinig de buitenkant van het raamglas met een katoenen applicator en glasreiniger voordat u de muis overbrengt naar de voorverwarmde microscoopfase. Nadat u de muis op het microscooppodium hebt gelegd, drukt u de kraag van het borstbeeldvenster in een ontvangstgat van 14 millimeter in het podiuminzetstuk om de afbeeldingen te stabiliseren en in de isofluraanslang te passen. Breng vervolgens het beeldvormingsveld in beeld met behulp van de microscoop-oculairen en Brightfield-verlichting, waarbij vasculatuur met de bloedstroom wordt waargenomen.Controleer de stabiliteit van het gezichtsveld. Als ademhalingsbewegingsartefacten aanwezig zijn, breng dan zachte compressie aan op de achterkant van de klier met een klein schuimblok en een cinctuurachtig stuk plakband. Nadat de compressie is toegepast, controleert u of de bloedstroom in het hele gezichtsveld wordt gehandhaafd.Zodra de muis is verdoofd en veilig op de omgekeerde microscooptrap is geplaatst, begint u met het lokaliseren van interessante gebieden. Gebruik met behulp van een lichtbron gericht op het borstbeeldvormingsvenster de oculairen van de microscoop om potentiële gebieden voor onderzoek te identificeren. De focus moet liggen op het zien van vasculatuur en bloedstroom.Voeg de XY-posities toe en sla deze op in de software. Wanneer de juiste vermogensniveaus zijn ingesteld, stelt u de Z-stack in en observeert u het verschijnen van overvloedige collageenvezels op 20 tot 50 micrometer onder het glazen oppervlak van het borstbeeldvormingsvenster. Collageen zal minder voorkomen naarmate de microscoop dieper in de tumor snijdt.De holtes in de tweede harmonische generatie of SHG onthullen de locatie van tumormassa's. Plaats de bovenste Z-plak onder de laag solitaire cellen met de eerste collageenvezels verschijnen op 50 tot 100 micron. Zet de onderste Z-plak op 250 micrometer waar de vezels vervagen en het slechte signaal domineert.Herhaal vervolgens de procedure voor alle opgeslagen XY-posities. Zodra het Z-stackbereik is ingesteld, verhoogt u de verblijftijd tot acht microseconden en optimaliseert u de vermogens- en detectorinstellingen. Optimaliseer de vermogensniveaus die nodig zijn om het weefsel voor elk experiment te prikkelen en gebruik vermogens tot 90 milliwatt bij 750 nanometer of 70 milliwatt bij 890 nanometer bij de achterste opening van het objectief.Begin vervolgens met intervallen van 10 minuten tussen verzamelpunten voor de meeste intravitale migratiefilms en pas de tijdsintervallen aan volgens experimentele doelen. Als tekenen van fototoxiciteit zoals cell blebbing of snel toenemende autofluorescentie en overmatige fotobleaching worden waargenomen, verminder dan het laservermogen of verhoog de timelapse-intervallen zoals de omstandigheden aangeven. Voor fluorescentielevensduurbeeldvorming of FLIM van NADPH begint u met het scannen van de voorvertoning en past u het laservermogen aan totdat de uitlezing van de constante fractiediscriminator of CFD tussen 10 en 10 tot de zesde ligt.Het overschrijden van CFD's van meer dan 10 tot het zesde resultaat in fotonenstapeling en slechte algemene resultaten. Zodra het vermogensniveau is ingesteld, stelt u de integratietijd in tussen 90 en 120 seconden en start u de FLIM-verzameling om fotonen uit het gezichtsveld te halen voor de toegewezen tijd. Een typisch gezichtsveld binnen een labelvrije borsttumor toonde overvloedige collageenvezels in de buurt van het raam en een afname in overvloed dieper in de tumor.Het gebruik van fluorescentielevensduur of NADPH hielp bij de identificatie van de vasculatuur. Sommige donkere gebieden op de beelden waren tumorplooien of het optrekken van aangrenzende tumorlobben. Om vasculatuur te identificeren, werd een samengesteld beeld met behulp van NDPH FLIM gevalideerd door maximale intensiteitsprojecties van de intravitale stack voor en na staartaderinjectie van fluorescerend dextran te vergelijken.De representatieve analyse toont de kwantificering van vier muizen en de gezichtsvelden. Om de grenzen van de labelvrije tumormassa's af te bakenen, werd NADPH-autofluorescentie gebruikt. De beelden rapporteerden de metabole handtekeningen van de cellen en de locatie van bloedvaten.De AFD-autofluorescentie identificeerde ook de macrofagen. Met het segmentatieschema werd de labelvrije tumor gesegmenteerd in compartimenten voor het tumornest, stroma en vasculatuur met alleen SHG- en NADPH-autofluorescentie. Bovendien kunnen de stroma- en collageenvezels ook worden ingedeeld in lokale regio's van de uitgelijnde vezels.Het belangrijkste om te onthouden voor dit protocol is om ervoor te zorgen dat de muis goed wordt verdoofd en in bedwang wordt gehouden, zodat het gezichtsveld stabiel blijft voor beeldvorming.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Een Time-lapse, Label-vrije, kwantitatieve fase Imaging studie van slapende en actieve menselijke kankercellen

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Longitudinal Intravital Imaging Through Clear Silicone Windows

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Intravital microscopy (IVM) enables visualization of cell movement, division, and death at single-cell resolution. IVM through surgically inserted imaging ...

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

The tumor microenvironment (TME) represents a complex ecosystem comprised of dozens of distinct cell types, including tumor, stroma, and immune cell ...