Name: a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment
Uploaded: 2022-05-24T13:00:00
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Les auteurs tiennent à remercier les subventions NCI R01 CA216248, CA206458 et CA179556 pour le financement de ce travail. Nous tenons également à remercier le Dr Kevin Eliceiri et son groupe d’imagerie pour leur expertise technique dans le développement précoce de notre programme intravital. Nous remercions également le Dr Ben Cox et les autres membres du groupe de fabrication Eliceiri de l’Institut de recherche Morgridge pour leur conception technique essentielle au cours des premières phases du MIW. Dr. Ellen Dobson a participé à des conversations utiles sur l’outil de segmentation WEKA formable d’ImageJ. De plus, nous tenons à remercier la Dre Melissa Skala et la Dre Alexa Barres-Heaton pour l’utilisation opportune de leur microscope. Enfin, nous tenons à remercier la Dre Brigitte Raabe, D.V.M., pour toutes les discussions réfléchies et les conseils sur notre manipulation et nos soins de la souris.

Toutes les expériences décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison. Le bien-être et la gestion de la douleur dans toutes les expériences sur les animaux sont primordiaux. Ainsi, tous les efforts sont faits pour s’assurer que l’animal est à l’aise et bien soigné à chaque étape de la procédure.
1. Génération de la fenêtre d’imagerie mammaire (MIW)
<ol><li>Pour c...

L’imagerie intravitale 4D est un outil puissant pour étudier les interactions physiologiques dynamiques dans le contexte spatial et temporel du microenvironnement tumoral natif. Ce manuscrit fournit un cadre opérationnel très basique et adaptable pour compartimenter les interactions cellulaires dynamiques dans la masse tumorale, le stroma adjacent ou à proximité du réseau vasculaire en utilisant uniquement des signaux endogènes de deuxième génération harmonique ou d’autofluorescence NAD(P)H. Ce protocole fo...

La matrice extracellulaire (ECM) dans le microenvironnement tumoral est connue pour être déposée dynamiquement et remodelée par plusieurs types de cellules pour faciliter davantage la progression de la maladie 1,2,3. Ces altérations de matrice fournissent des indices mécaniques et biologiques qui modifient le comportement cellulaire et entraînent souvent un cycle continu de remodelage de la matrice4. L’étude de l’interaction dynamique et réciproque entre les cellules tumorales et la matrice extracellulaire est souvent menée à l’aide de cultures in vitro tridimensionnelles (3D) ou de systèmes microfluidiques. Alors que ces approches ascendantes ont démontré des mécanismes de remodelage ECM 5,6,7, une prolifération accrue8, une transition épithéliale à mésenchymateuse 9,10,11,12 et une migration et une invasion des cellules tumorales 7,13,14,15,16 , ils se sont principalement concentrés sur quelques types de cellules (par exemple, les cellules tumorales ou les fibroblastes) au sein d’une matrice 3D homogène par rapport à la diversité et à l’hétérogénéité des interactions présentes dans un tissu physiologique. En plus des systèmes in vitro, l’histologie tumorale ex vivo peut également fournir un aperçu de ces interactions cellule-cellule et cellule-ECM17. L’immunohistochimie a l’avantage de pouvoir analyser plusieurs types de cellules par rapport à la composition et à l’architecture spatialement hétérogènes de l’ECM, mais les paramètres statiques des tissus fixes ne capturent pas la nature dynamique des interactions entre les cellules et le microenvironnement. L’imagerie intravitale a ouvert la porte à l’interrogation d’interactions diverses et dynamiques dans le contexte physiologique du microenvironnement tumoral natif.
Les capacités de l’imagerie tumorale intravitale progressent rapidement. Les améliorations apportées à la conception des fenêtres d’imagerie et aux techniques chirurgicales d’implantation des fenêtres ont permis l’imagerie tumorale longitudinale à long terme à divers endroits anatomiques (c.-à-d. tumeur primaire, ganglions lymphatiques, sites métastatiques 18,19,20). De plus, la capacité de l’instrumentation optique à visualiser et à recueillir des données dans de multiples dimensions (c.-à-d. spectrale, intensité de fluorescence spatiale et durée de vie), ainsi qu’à haute résolution et vitesse (taux vidéo) devient largement accessible. La technologie améliorée offre l’occasion d’explorer les changements rapides dans la signalisation cellulaire et la dynamique phénotypique dans un environnement physiologique. Enfin, l’expansion des outils optogénétiques et le large éventail de constructions fluorescentes génétiques permettent le marquage de types cellulaires spécifiques pour capturer la migration cellulaire dans le microenvironnement tumoral ou le traçage de la lignée cellulaire au cours du développement ou de la progression de la maladie21,22. L’utilisation de ces outils en combinaison avec la technologie CRISPR/Cas9 offre aux chercheurs la possibilité de générer des modèles animaux uniques en temps opportun.
Bien que toutes ces avancées fassent de l’imagerie intravitale une méthode de plus en plus puissante pour explorer les interactions cellulaires dynamiques et physiologiques, il existe encore un besoin important de développer des stratégies qui fournissent un contexte spatial, temporel et structurel au niveau tissulaire à ces interactions biologiques. Actuellement, de nombreuses études d’imagerie intravitale compensent le manque de repères visuels tels que les vaisseaux sanguins en injectant des colorants fluorescents dans le système vasculaire ou en utilisant des modèles murins qui expriment de manière exogène des protéines fluorescentes pour délimiter les caractéristiques physiques. Les colorants injectables et les substrats comme le dextrans fluorescent sont largement utilisés pour marquer avec succès le système vasculaire dans les collections intravitales19, 23, 24. Cependant, cette approche n’est pas sans limites. D’une part, il nécessite des manipulations de souris supplémentaires et son utilité se limite à des expériences à court terme. Pour les études longitudinales, le dextran fluorescent peut être problématique car nous observons l’accumulation de dextran dans les cellules phagocytaires ou la diffusion dans les tissus environnants au fil du temps25. L’incorporation de protéines fluorescentes exogènes dans le modèle murin a été présentée comme une alternative au dextrans fluorescent, mais présente ses propres limites. La disponibilité et la diversité des fluorophores exogènes dans les modèles murins sont encore limitées et coûteuses à créer. De plus, dans des modèles spécifiques, tels que les modèles PDX, les manipulations génétiques ne sont ni souhaitables ni possibles. Il a également été démontré que la présence de protéines fluorescentes ou bioluminescentes dans les cellules est reconnue comme étrangère chez la souris, et dans les modèles murins immunocompétents, cela réduit la quantité de métastases dues à la réponse du système immunitaire de l’hôte26,27. Enfin, les protéines fluorescentes exogènes ou les colorants fluorescents utilisés pour le contexte spatial ou pour segmenter les données ultérieures occupent souvent des plages premières du spectre lumineux qui pourraient autrement être utilisées pour étudier les interactions physiologiques d’intérêt.
L’utilisation du signal intrinsèque de l’ECM ou de la fluorescence endogène des cellules à l’intérieur du tissu représente un moyen universel potentiel sans étiquette de segmenter les données intravitales pour une analyse cellulaire et spatiale plus approfondie. La deuxième génération harmonique (SHG) a longtemps été utilisée pour visualiser l’ECM28. Avec le développement ultérieur d’outils importants pour aider à la caractérisation de l’organisation des fibres 29,30,31, il est possible de caractériser le comportement cellulaire par rapport à la structure ECM locale. De plus, l’autofluorescence du métabolite endogène, le NAD(P)H, fournit un autre outil sans étiquette pour compartimenter le microenvironnement tumoral in vivo. Le NAD(P)H fluoresce brillamment dans les cellules tumorales et peut être utilisé pour distinguer les limites du nid tumoral en croissance de son stromaenvironnant 21,32. Enfin, le système vasculaire est une structure physiologique importante dans le microenvironnement tumoral et le site d’interactions clés spécifiques au type de cellule 33,34,35. L’excitation des globules rouges (RBC) ou du plasma sanguin a été utilisée pour visualiser le système vasculaire tumoral, et en utilisant l’excitation à deux ou trois photons (2P; 3P), la mesure des débits sanguins s’est avérée possible36. Cependant, alors que les gros vaisseaux sanguins sont facilement identifiables par leurs signatures de fluorescence endogènes, l’identification de petits vaisseaux sanguins subtils, variables et moins fluorescents nécessite plus d’expertise. Ces difficultés inhérentes entravent une segmentation optimale de l’image. Heureusement, ces sources de fluorescence endogène (c’est-à-dire les globules rouges et le plasma sanguin) peuvent également être mesurées par l’imagerie de fluorescenceà vie 37, qui capitalise sur les propriétés photophysiques uniques du système vasculaire et représente un ajout utile à la boîte à outils intravitale en croissance.
Dans ce protocole, un flux de travail pour la segmentation de l’imagerie intravitale en quatre dimensions (4D) utilisant explicitement des signaux intrinsèques tels que la fluorescence endogène et le SHG est décrit de l’acquisition à l’analyse. Ce protocole est particulièrement pertinent pour les études longitudinales à travers une fenêtre d’imagerie mammaire où la fluorescence exogène peut ne pas être pratique ou possible, comme c’est le cas avec les modèles PDX. Les principes de segmentation décrits ici, cependant, sont largement applicables aux utilisateurs intravitaux qui étudient la biologie tumorale, le développement tissulaire ou même la physiologie tissulaire normale. La suite d’approches d’analyse rapportée permettra aux utilisateurs de différencier le comportement cellulaire entre les régions de configurations de fibres de collagène alignées ou aléatoires, de comparer les nombres ou les comportements des cellules résidant dans des régions spécifiques du microenvironnement tumoral et de cartographier le système vasculaire au microenvironnement tumoral en utilisant uniquement un signal intrinsèque ou sans étiquette. Ensemble, ces méthodes créent un cadre opérationnel pour maximiser la profondeur de l’information obtenue grâce à l’imagerie intravitale 4D de la glande mammaire tout en minimisant le besoin d’étiquettes exogènes supplémentaires.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 12mm round cover glass</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td># 64-0712</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mL syringe for SQ injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421452-988</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle for SQ injection</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>1188827012</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD77410</td>
			<td>Water immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk braided suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K870</td>
			<td>Suture for MIW implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears gel</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-162-35</td>
			<td>Eye gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution, 5%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1558063</td>
			<td>Surgery antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton-tipped applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td>MIW construction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1287-50mg</td>
			<td>intravenous labelling of vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Mckesson.com</td>
			<td>Miltex&#160;#18-782</td>
			<td>stainless, 4 inch, curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GaAsP photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating blanket</td>
			<td>CARA 72 heating pad</td>
			<td>&#160;038056000729</td>
			<td>Temperature selectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating chamber</td>
			<td>home built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent lifetime handbook</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td>https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope base</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 59399-106-01</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liqui-Nox</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-125</td>
			<td>MIW cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Hose</td>
			<td>Scientific Commodities INC.</td>
			<td>&#160;BB31695-PE/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multiphoton scan head</td>
			<td>Bruker Ultima II</td>
			<td></td>
			<td>Multiphoton scanhead and imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH FLIM filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>284994</td>
			<td>ET 440/80 m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair</td>
			<td>CVS</td>
			<td>339826</td>
			<td>Depilatory cream</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective heater</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>STRG-WELSX-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SHG/FAD filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320740</td>
			<td>ET450/40m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sparkle glass cleaner</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B00814ME24</td>
			<td>Glass Cleaner for implanted MIW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPC-150 photon counting board</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical light</td>
			<td>FAJ</td>
			<td>B06XV1VQVZ</td>
			<td>Magnetic LED gooseneck light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical micro-scissors</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>366</td>
			<td>stainless, 3 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment</td>
			<td>Actavis Pharma</td>
			<td>NDC 0472-0179-34</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TV catheter</td>
			<td>Custom</td>
			<td>BD 30G needle: 305106</td>
			<td>Catheter for TV injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two photon filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>320282</td>
			<td>ET585/65m-2P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-photon laser</td>
			<td>Coherent charmeleon</td>
			<td></td>
			<td>Tunable multiphoton laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>PKR-03-02</td>
			<td>Water immersion gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea crystals</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128-5G</td>
			<td>Optional: FLIM IRF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a label-free segmentation approach for intravital imaging of mammary tumor microenvironment

La capacité de visualiser des interactions physiologiques complexes et dynamiques entre de nombreux types de cellules et la matrice extracellulaire (ECM) dans un microenvironnement tumoral vivant est une étape importante vers la compréhension des mécanismes qui régulent la progression tumorale. Bien que cela puisse être accompli grâce aux techniques actuelles d’imagerie intravitale, cela reste difficile en raison de la nature hétérogène des tissus et de la nécessité d’un contexte spatial dans l’observation expérimentale. À cette fin, nous avons développé un flux de travail d’imagerie intravitale qui associe l’imagerie de deuxième génération harmonique de collagène, la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H et la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) comme moyen de compartimenter de manière non invasive le microenvironnement tumoral en domaines de base du nid tumoral, du stroma ou ECM environnant et du vascularisation. Ce protocole non invasif détaille le processus étape par étape allant de l’acquisition d’images time-lapse de modèles de tumeurs mammaires à l’analyse post-traitement et à la segmentation d’images. Le principal avantage de ce flux de travail est qu’il exploite les signatures métaboliques pour contextualiser le microenvironnement tumoral vivant en évolution dynamique sans l’utilisation d’étiquettes fluorescentes exogènes, ce qui le rend avantageux pour les modèles de xénogreffes dérivées du patient humain (PDX) et l’utilisation clinique future où les fluorophores extrinsèques ne sont pas facilement applicables.

L’installation du MIW et la planification expérimentale de base sont les premières étapes de ce processus. Cette conception et ce protocole MIW particuliers se prêtent mieux aux études longitudinales19 et ont été utilisés avec succès avec des microscopes verticaux et inversés. Dans ce cas, un microscope inversé a été utilisé car il a entraîné une plus grande stabilité de l’image de la glande mammaire avec moins d’artefacts respiratoires. Dans la figure 1...

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A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

La méthode d’imagerie intravitale décrite ici utilise la deuxième génération harmonique de collagène et la fluorescence endogène du cofacteur métabolique NAD(P)H pour segmenter de manière non invasive un microenvironnement tumoral non marqué en compartiments tumoral, stromal et vasculaire pour une analyse approfondie des images intravitales 4D.

Une approche de segmentation sans étiquette pour l’imagerie intravitale du microenvironnement tumoral mammaire

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

L’imagerie intravitale nous permet d’observer les interactions physiologiques au sein du microenvironnement tumoral. Et en utilisant cette méthode, les comportements dynamiques spécifiques observés peuvent être compartimentés à l’aide de caractéristiques tissulaires locales. Ce protocole utilise uniquement un signal omniprésent sans étiquette provenant de fibres de collagène ou de métabolites autofluorescents pour segmenter le TME, minimisant ainsi la quantité de manipulations à la souris.Cette méthode est largement applicable à tout système intravital où la compréhension des interactions dynamiques relatives aux structures de matrice extracellulaire ou aux structures vasculaires est nécessaire. Dave Inman, spécialiste principal de la recherche, et Erica Hoffmann, étudiante diplômée du laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Commencez à préparer un verre de couvre-fenêtre d’imagerie mammaire en trempant un verre de couverture ronde de 1,5 12 millimètre dans de l’éthanol à 100% pendant 10 minutes, puis séchez le verre de couverture sous une lampe chauffante et fixez le verre au cadre de fenêtre d’imagerie mammaire en métal à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate.Durcissez l’adhésif pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un écouvillon imbibé d’acétone pour nettoyer la fenêtre d’imagerie mammaire assemblée de l’excès d’adhésif avant d’immerger la fenêtre d’imagerie mammaire dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 10 minutes pour faciliter le nettoyage. Après séchage, conservez la fenêtre d’imagerie mammaire nettoyée dans une boîte de Petri stérile.Avant de commencer la chirurgie pour l’implantation de la fenêtre, autoclavez les outils chirurgicaux et désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%. Préparez une table désinfectée pour la chirurgie avec une couverture chauffante recouverte d’un champ stérile. Réglez la couverture chauffante de telle sorte que la température mesurée au-dessus du champ stérile soit de 40 degrés Celsius.Utilisez un éclairage froid auxiliaire et des loupes pour l’intervention chirurgicale. Portez un EPI composé d’une blouse de laboratoire stérile à usage unique, de manches chirurgicales, de gants, d’une protection oculaire et d’un masque facial. Ensuite, retirez la fourrure de la souris anesthésiée au niveau de la quatrième glande mammaire inguinale avec une crème dépilatoire et rincez le site chirurgical avec une gaze stérile imbibée d’eau.Ensuite, préparez le site chirurgical épilé pour la chirurgie en désinfectant la surface de la peau avec trois gommages alternés à la bétadine et à l’éthanol. Lorsque cela est fait, soulevez doucement la peau sur la glande mammaire numéro quatre à l’aide d’une pince. Une fois que la peau est retirée de la paroi corporelle, retirez une section d’un millimètre de la couche dermique à l’extrémité de la pince avec des microcisseurs chirurgicaux.Sans couper la glande sous-jacente, créez une incision de 10 millimètres, puis libérez la glande mammaire de la couche dermique avec le mouvement doux de la pince. Ajouter PBS pour couvrir la glande exposée. Utilisez une suture tressée en soie 5-0 pour créer une suture de cordon de bourse le long de la périphérie de l’ouverture, puis insérez un bord de la fenêtre d’imagerie mammaire afin que la couche dermique s’engage dans l’encoche réceptrice de la fenêtre d’imagerie mammaire.Tout en étirant l’épithélium à l’extrémité opposée de la fenêtre d’imagerie mammaire, poussez la fenêtre d’imagerie mammaire métallique en place de sorte que la couche dermique engage pleinement l’encoche réceptrice autour de toute la circonférence de la fenêtre d’imagerie mammaire. Ensuite, pincez le cordon de la bourse pour dessiner la couche dermique dans l’encoche et attachez la couche pour fixer la fenêtre. Appliquez un antibiotique topique sur la couche dermique à la fenêtre d’imagerie mammaire et surveillez en permanence la souris.Après avoir repris suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale, logez la souris implantée de fenêtre d’imagerie mammaire séparément sur une literie souple avec un igloo placé dans la cage et laissez la souris récupérer pendant 48 heures avant l’imagerie. Pour l’imagerie, utilisez un système d’air forcé réglé à 30 degrés Celsius. Utilisez un réchauffeur d’objectif supplémentaire pour éviter la dérive dans la mise au point Z et permettre au système de s’équilibrer à 30 degrés Celsius pendant au moins une heure avant l’imagerie.Ensuite, installez une chambre de chauffage sur la scène du microscope. Après avoir confirmé l’anesthésie avec la méthode de pincement des orteils, ajoutez une pommade pour les yeux à la souris. Pour maintenir une bonne hydratation, injecter 0,5 millilitre de PBS par voie sous-cutanée toutes les deux heures pendant toute la durée de la séance d’imagerie.Appliquez un gel à base d’eau au lieu d’eau sur l’objectif et nettoyez l’extérieur de la vitre d’imagerie mammaire avec un applicateur en coton et un nettoyant pour vitres avant de transférer la souris à l’étage de microscope préchauffé. Après avoir posé la souris sur l’étage du microscope, appuyez sur le collier de la fenêtre d’imagerie mammaire dans un trou de réception de 14 millimètres dans l’insert de la scène pour stabiliser les images et ajuster le tuyau d’isoflurane. Ensuite, mettez le champ d’imagerie au point à l’aide des oculaires du microscope et de l’éclairage Brightfield, en observant le flux vasculaire avec le flux sanguin.Vérifiez la stabilité du champ de vision. Si des artefacts de mouvement respiratoire sont présents, appliquez une compression douce à l’arrière de la glande avec un petit bloc de mousse et un morceau de ruban adhésif ressemblant à de la teinture. Après l’application de la compression, vérifiez que le flux sanguin est maintenu dans tout le champ de vision.Une fois que la souris est sous sédation et solidement positionnée sur l’étage du microscope inversé, commencez à localiser les régions d’intérêt. À l’aide d’une source lumineuse dirigée vers la fenêtre d’imagerie mammaire, utilisez les oculaires du microscope pour identifier les zones potentielles d’investigation. L’accent devrait être mis sur la vision du système vasculaire et du flux sanguin.Ajoutez et enregistrez les positions XY dans le logiciel. Lorsque les niveaux de puissance appropriés sont définis, installez la pile Z et observez l’apparition de fibres de collagène abondantes à 20 à 50 micromètres sous la surface vitrée de la fenêtre d’imagerie mammaire. Le collagène deviendra moins répandu à mesure que le microscope s’enfoncera plus profondément dans la tumeur.Les vides de la deuxième génération harmonique ou SHG révèlent l’emplacement des masses tumorales. Placez la tranche Z supérieure sous la couche de cellules solitaires avec les premières fibres de collagène apparaissant à 50 à 100 microns. Réglez la tranche Z inférieure à 250 micromètres où les fibres s’estompent et où le mauvais signal domine.Répétez ensuite la procédure pour toutes les positions XY enregistrées. Une fois la plage de pile Z définie, augmentez le temps de séjour à huit microsecondes et optimisez les paramètres de puissance et de détection. Optimisez les niveaux de puissance nécessaires pour exciter le tissu pour chaque expérience et utilisez des puissances allant jusqu’à 90 milliwatts à 750 nanomètres ou 70 milliwatts à 890 nanomètres à l’ouverture arrière de l’objectif.Ensuite, commencez par des intervalles de 10 minutes entre les points de collecte pour la plupart des films de migration intravitale et ajustez les intervalles de temps en fonction des objectifs expérimentaux. Si des signes de phototoxicité tels que des bêlements cellulaires ou une autofluorescence en augmentation rapide et un photoblanchiment excessif sont observés, réduisez la puissance du laser ou augmentez les intervalles de timelapse selon les conditions. Pour l’imagerie à vie de fluorescence ou FLIM du NADPH, commencez à prévisualiser le balayage et ajustez la puissance du laser jusqu’à ce que la lecture du discriminateur de fraction constante ou CFD soit comprise entre 10 et 10 pour le sixième.Dépasser la CFD au-delà de 10 à la sixième entraîne un empilement de photons et de mauvais résultats globaux. Une fois le niveau de puissance réglé, réglez le temps d’intégration entre 90 et 120 secondes et démarrez la collection FLIM pour acquérir des photons du champ de vision pendant le temps imparti. Un champ de vision typique dans une tumeur mammaire sans étiquette a démontré des fibres de collagène abondantes près de la fenêtre et une diminution de l’abondance plus profondément dans la tumeur.L’utilisation de la durée de vie de fluorescence ou NADPH a aidé à l’identification du système vasculaire. Certaines régions sombres dans les images étaient des plis tumoraux ou le butting des lobes tumoraux adjacents. Pour identifier la vascularisation, une image composite utilisant NDPH FLIM a été validée en comparant les projections d’intensité maximale de la pile intravitale avant et après l’injection de dextran fluorescent dans la veine caudale.L’analyse représentative montre la quantification de quatre souris et les champs de vision. Pour délimiter les limites des masses tumorales sans étiquette, l’autofluorescence du NADPH a été utilisée. Les images ont rapporté les signatures métaboliques des cellules et l’emplacement des vaisseaux sanguins.L’autofluorescence de l’AFD a également identifié les macrophages. Avec le schéma de segmentation, la tumeur sans étiquette a été segmentée en compartiments pour le nid tumoral, le stroma et le système vasculaire en utilisant uniquement l’autofluorescence SHG et NADPH. De plus, les fibres de stroma et de collagène peuvent également être classées en régions locales des fibres alignées.La chose la plus importante à retenir pour ce protocole est de s’assurer que la souris est correctement sous sédation et retenue afin que le champ de vision reste stable pour l’imagerie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

Une Time-lapse, sans étiquette et Quantitative Phase imagerie de cellules cancéreuses humaines dormantes et Active

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enrichissement phosphopeptide couplée à la spectrométrie masse Quantitative exempte d’étiquette d’enquêter sur le Phosphoproteome dans le Cancer de la Prostate

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

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